利用PKM2-PARP1的依赖关系：异塞莱纳唑醇-奥拉帕利结合物实现了多模式的PKM2抑制

《Bioorganic Chemistry》：Exploiting PKM2-PARP1 dependency: Isoselenazolium-olaparib conjugates achieve multimodal PKM2 suppression

　　

拉脱维亚有机合成研究所，Aizkraukles 21，LV1006，里加，拉脱维亚

摘要

丙酮酸激酶M2（PKM2）是癌细胞中葡萄糖代谢的关键调节因子，其功能不仅限于糖酵解过程。PKM2能够转移到细胞核内，并作为致癌转录因子发挥作用。当其与poly(ADP-ribose)结合时，其在细胞核中的滞留会增强，而这种结合可以通过抑制PARP1来阻止。为了利用这一相互作用，研究人员设计并合成了一类新的PKM2-PARP1抑制剂复合物。主要化合物9f对PKM2和PARP1具有强效抑制作用（IC₅₀分别为261 ± 23 nM和39.5 ± 3.1 nM）。9f还能减少PKM2的二聚化，降低其在细胞核中的积累，并选择性下调PKM2的mRNA表达。从功能上看，9f在多种癌细胞系中表现出广泛的抗增殖活性（IC₅₀为2.9–6.6 μM），在12.5 μM浓度下可完全抑制3D癌细胞球形的形成。这些发现表明PKM2-PARP1复合物是一类新型的双重抑制剂，在酶学、细胞核和转录层面均能抑制PKM2，从而扩展了PARP抑制策略的应用范围，超出了其在DNA修复通路中的传统作用。

引言

丙酮酸激酶（PK）催化糖酵解的最后一步，即将磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）中的磷酸基团转移到ADP上，生成丙酮酸和ATP。哺乳动物的PK有四种组织特异性异构体：PKL（肝脏、肾脏、肠道）、PKR（红细胞）、PKM1（在健康组织中广泛表达）和PKM2。与其他异构体不同，PKM2主要在高度增殖的细胞中表达，尤其是在肿瘤中，并已成为一个有前景的治疗靶点。多项研究表明，PKM2表达升高与多种常见恶性肿瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和非小细胞肺癌）相关，且通常预示着不良预后[1]，[2]。

PKM2在酶活性四聚体和低活性二聚体之间处于动态平衡状态。PKM2可以经历多种翻译后修饰，从而改变其聚集体形态，如氧化[3]、乙酰化、磷酸化、琥珀酰化等[4]。其聚集体形态也可通过小分子代谢物进行可逆调节：激活剂如果糖-1,6-二磷酸（FBP）、丝氨酸和琥珀酰氨基咪唑羧酰胺核糖-5′-磷酸（SAICAR），以及抑制剂如L-苯丙氨酸和L-丙氨酸。这种别构转换使癌细胞能够将糖酵解中间产物重新定向至生物合成途径，并适应营养和氧气供应的变化[5]，[6]。除了代谢功能外，二聚体形式的PKM2在缺氧或EGFR激活情况下可转移到细胞核内，在那里它作为蛋白激酶（例如磷酸化组蛋白H3）[7]和致癌信号通路的转录共激活因子（例如与HIF-1α和β-连环蛋白相互作用）[8]，[9]，并促进支持糖酵解和增殖的基因表达[4]，[10]。

先前的研究表明，EGFR激活会诱导PKM2与poly(ADP-ribose)结合，后者通过增强PKM2在细胞核中的滞留并促进致癌转录靶基因（包括c-Myc和与糖酵解相关的基因如GLUT1和LDH）的表达来调节其核功能[11]，[12]，[13]，[14]。值得注意的是，PARP1抑制剂奥拉帕利（olaparib）已被证明能抑制EGF刺激后肺癌细胞中的PKM2驱动的细胞增殖[14]。这些发现建立了PARP1活性与PKM2介导的代谢重编程之间的机制联系，为同时靶向PARP1和PKM2提供了理论依据。

目前已描述了几类PKM2抑制剂，包括黄酮类化合物如芹菜素[15]、萘醌类化合物如shikonin，以及第二代衍生物3k[16]和咪唑[1,2-a]吡啶-噻唑骨架衍生物[17]。然而，这些化合物的精确结合模式和作用机制尚未完全阐明，它们对其他PK异构体的选择性也未得到研究。最近，我们的团队开发了含有Se–N⁺键的双环杂环化合物——异硒氮鎓盐[18]，这些化合物显示出对PKM2的强效选择性抑制作用。我们发现异硒氮鎓盐以一种非经典的方式抑制PKM2，导致其形成不稳定且功能受损的四聚体构象[19]。

在本研究中，我们设计了将异硒氮鎓吡啶鎓盐衍生物与奥拉帕利共价结合的小分子复合物，这两种活性药物分子在分子水平上协同发挥作用。与分别使用两种抑制剂不同，复合物确保在同一细胞内同步释放和发挥活性，从而协调它们的分子效应并最小化补偿性耐药途径[20]，[21]，[22]。对于PKM2和PARP1而言，这些复合物能够同时破坏PKM2的代谢和核功能，同时抑制其在细胞核中的滞留，从而实现单一抑制剂无法实现的协同效应。本文描述了这些新型化合物的合成方法、它们对PARP1和丙酮酸激酶异构体的抑制活性、对PKM2聚集体形态及其在细胞核中积累的影响，以及它们在二维和三维模型中对各种癌细胞系的细胞毒性作用。

部分摘录

合成

以炔基吡啶羧酸1为起始原料，成功合成了不含烷基连接剂的奥拉帕利-异硒氮鎓吡啶鎓复合物3（方案1）[19]。通过将1与4-(4-氟-3-(哌嗪-1-羰基)苯基)酞嗪-1(2H)-酮（CAS 763111–47-3）在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC × HCl）和1-羟基苯并三嗪（HOBt×H₂O）的存在下偶联，生成了中间体2，产率中等。

讨论

本研究介绍了一类新型的异硒氮鎓-奥拉帕利复合物，它们同时具备强烈的PKM2和PARP1抑制活性。考虑到PKM2在代谢重编程和核转录调控中的关键作用[1]，以及其受到PARP1依赖的PARylation调控[14]，这种结合方法非常具有吸引力。通过将靶向PKM2的异硒氮鎓盐与PARP抑制剂奥拉帕利共价连接，我们验证了这种基于机制导向的复合物设计的有效性。

结论

总之，本研究确定了PKM2-PARP1复合物是一类新型的双重抑制剂，它们优先抑制二聚体形式的PKM2，减少其恶性二聚体比例，并抑制其在细胞核中的滞留。这些化合物通过干扰PKM2的酶学、核功能和转录功能，在多种癌细胞系中表现出强的抗增殖活性，在较高浓度下可完全抑制3D癌细胞球体的形成。

一般信息

除非另有说明，所有试剂均从商业供应商处购买，未经进一步纯化直接使用。超纯水通过Milli-Q系统（18.2 MΩ cm）获得。薄层色谱（TLC）使用MERCK Silica gel 60 F254板进行，并通过UV（254 nm）荧光检测。柱色谱使用ZEOCHEM silica gel（ZEOprep 60/35–70 μm – SI23501）。¹H谱在Bruker 300、Bruker 400或Bruker 600光谱仪上记录，¹³C谱

CRediT作者贡献声明

Pavels Dimitrijevs：撰写原始草案、数据可视化、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。Marina Makrecka-Kuka：实验研究、数据分析。Diana Zelencova-Gopejenko：数据可视化、实验研究、数据分析。Zhanna Rudevica：实验研究、数据分析。Ksenija Korotkaja：实验研究、数据分析。Anna Zajakina：验证、方法学设计、实验研究、数据分析。Kristofers Rudzitis：实验研究。Agnieszka Bogucka：

利益冲突声明

不存在利益冲突。

致谢

No.07/OSI/ZG（RRF项目编号5.2.1.1.i.0/2/24/I/CFLA/001）提供的财政支持。