α-半乳糖苷酶的重组表达以及对用于瓜尔胶侧链修饰的靶向酶的筛选

《Bioorganic Chemistry》：Recombinant expression of α-galactosidases and screening of targeted enzymes for guar gum side chains

　　

岳阳|聂同云|高环|沈玉珠|宋玉笛|单雅坤|胡彦波

中国长春大学食品科学与工程学院，长春130022

摘要

β-甘露聚糖（β-MOS）是一类高性能的益生元，在食品、饲料及相关领域具有重要的应用价值。瓜尔胶富含β-甘露聚糖骨架，是生产β-MOS的理想原料，但其侧链上的α-半乳糖残基严重阻碍了β-MOS的有效制备和应用推广。为克服这一关键技术瓶颈，从脆弱拟杆菌 NCTC9343中克隆出了四种新型α-半乳糖苷酶基因（BfGal27A、BfGal27B、BfGal36A、BfGal36B）。通过大肠杆菌异源表达系统实现了重组蛋白的可溶性表达和纯化，并对其酶学性质进行了系统研究。结果表明，所有重组酶都表现出弱碱性催化偏好和中温适应性，不同的金属离子能调节其催化活性。基于瓜尔胶的底物特异性筛选显示，BfGal36B对瓜尔胶侧链中的α-半乳糖残基具有高效的靶向催化作用。分子对接验证了BfGal36B与瓜尔胶之间的强结合亲和力，其活性中心与底物之间形成的稳定氢键网络为高效降解提供了关键的结构基础。本研究成功筛选出BfGal36B作为瓜尔胶侧链的特异性降解酶，丰富了糖苷水解酶资源库，为功能性β-MOS的大规模生产、农产品的增值加工以及糖苷酶的工业应用提供了重要的理论和技术支持。

引言

β-甘露聚糖（β-MOS）是一类高性能的益生元，具有多种重要的生物活性，包括增强胃肠道功能、提高饲料利用率和抗氧化作用。它们在食品、饲料等领域具有广泛的应用前景[1]、[2]。少量β-MOS可从植物的结构和储存组织中作为天然生物活性成分分离出来。然而，为了满足大规模市场的需求并降低生产成本，甘露聚糖的酶法水解已成为生产β-MOS的主要方法。瓜尔胶是一种来源于豆科植物种子的半乳甘露聚糖[3]、[4]。其分子结构由通过β-1,4糖苷键连接的甘露糖残基线性骨架组成，侧链上通过α-1,6糖苷键链接着半乳糖残基。由于这一独特的结构特征，瓜尔胶被视为生产β-MOS的理想原料，相关的研究及其降解和转化成为了该领域的热点[5]、[6]。然而，目前大多数关于通过瓜尔胶降解生产功能性寡糖的研究仅使用β-1,4甘露聚糖酶来切割主链，而忽略了侧链上的α-1,6半乳糖单元。这导致所得甘露聚糖（MOS）的纯度较低，严重限制了其质量和应用价值[7]、[8]、[9]。α-半乳糖苷酶是一类能够特异性切割α-连接的半乳糖苷键的糖苷水解酶，广泛分布于微生物（如大肠杆菌、曲霉属）、植物（如豆科和谷物的种子或果实）以及动物（如哺乳动物的肠道黏膜和肾脏组织）[10]、[11]，可以通过降解瓜尔胶侧链来弥补上述研究的不足并提高MOS的纯度。然而，α-半乳糖苷酶的工业化生产目前面临成本高、效率低和酶活性不足等常见问题，导致产量难以满足实际需求[12]。因此，迫切需要开发高效的新型α-半乳糖苷酶以克服基于瓜尔胶
（β-MOS）生产中α-半乳糖侧链的障碍。在本研究中，我们假设从脆弱拟杆菌 NCTC9343中克隆出的四种α-半乳糖苷酶基因（BfGal27A、BfGal27B、BfGal36A和BfGal36B）可以在大肠杆菌 BL21(DE3)中可溶性表达。进一步推测其中一种酶会对瓜尔胶
侧链中的α-半乳糖残基表现出靶向催化作用，从而实现对半乳甘露聚糖（如瓜尔胶）的高效降解。这种特异性归因于其活性口袋和辅助结构域的独特空间构象，这使得它们与瓜尔胶
具有更强的结合亲和力和更稳定的氢键相互作用。为了验证这一假设，本研究采用了“基因克隆 - 异源表达 - 酶学表征 - 分子对接验证”的系统研究框架，这种方法与Wang等人用于酶学靶标功能验证的“靶标筛选 - 体外和体内验证 - 分子机制阐明”策略一致，可以有效确保靶标酶筛选过程的特异性和可靠性[13]。最终确定BfGal36B是对瓜尔胶
侧链具有特异性水解活性的酶。本研究为从瓜尔胶
中高纯度制备β-MOS提供了关键工具酶，为功能性β-MOS的大规模生产和富含半乳甘露聚糖的农业原料的高值化利用奠定了坚实基础。

章节片段

材料与方法

图1提供了从基因克隆到最终筛选目标酶的整个实验工作流程的示意图。

四种α-半乳糖苷酶的序列分析

从脆弱拟杆菌 NCTC9343中克隆出了四种α-半乳糖苷酶基因（BfGal27A、BfGal27B、BfGal36A、BfGal36B），其基因长度分别为1500、1488、2157和2073个碱基对（bp），分子量分别为55.9 kDa、55.1 kDa、82.2 kDa和78.1 kDa。使用MEGA11软件对这些酶和其他已报道的α-半乳糖苷酶进行了系统发育树分析。序列比对后，采用SWISS-MODEL构建了它们的三维结构模型。

结论

为了解决高效生产β-MOS的核心瓶颈问题——瓜尔胶
侧链上的α-半乳糖残基——本研究从脆弱拟杆菌 NCTC9343中克隆出了四种新型α-半乳糖苷酶基因（BfGal27A/B、BfGal36A/B），并通过大肠杆菌异源系统实现了它们的可溶性表达和纯化。序列分析将BfGal27A/B归类为GH27家族，BfGal36A/B归类为GH36家族，所有基因均保留了家族特有的结构特征。酶学表征显示...

CRediT作者贡献声明

岳阳：撰写 - 原始稿撰写、验证、数据整理、概念构建。聂同云：软件开发、方法学设计。高环：软件开发、方法学设计。沈玉珠：软件开发、方法学设计。宋玉笛：研究指导、方法学设计。单雅坤：软件开发、方法学设计。胡彦波：撰写 - 审稿与编辑、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本综述工作的利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了吉林省教育厅科学研究项目（项目编号：JKH20251106K）的财务支持。