光动力疗法与抗生素联合治疗糖尿病大鼠多重耐药铜绿假单胞菌伤口感染

《Bioorganic Chemistry》：Photodynamic and antibiotic combination therapy against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa wound infections in diabetic rats

　　

孔飞燕|张婷|刘月彤|李玉彤|刘小彤|白传鹏|王天宇|赵詹娟|何宏

河北大学基础医学院，中国保定

摘要

在之前的研究中，5-氨基酮戊酸介导的光动力疗法（ALA-PDT）通过减少微生物负担促进了慢性糖尿病伤口的愈合。然而，ALA-PDT的抗菌效果常常受到组织内光线穿透有限的限制。为了提高ALA-PDT的效果，本研究评估了将其与抗生素头孢他啶联合用于治疗慢性糖尿病伤口的疗效，并探讨了其潜在的作用机制。结果表明，ALA-PDT与头孢他啶的联合使用能够协同抑制多重耐药铜绿假单胞菌的生长。该治疗还阻止了细菌生物膜的形成，延缓了抗生素耐药性的发展，灭活了urovision蛋白，并具有持久的抗生素后效应。支持这种协同抗菌作用的机制可能涉及ALA-PDT介导的活性氧生成，导致细菌细胞结构破坏、膜通透性增加以及细菌对头孢他啶的吸收增强。在糖尿病大鼠的全层皮肤缺损感染模型中，联合治疗组的杀菌率和伤口闭合率最高。通过对伤口组织的转录组分析发现，联合治疗组与对照组之间差异表达的基因主要集中在IL-17、AKT–STAT和VEGF信号通路相关。分子生物学实验表明，联合治疗可能调节IL-17的表达，激活JAK–STAT轴，增加p-JAK2和p-STAT3的表达，并降低SOCS3的表达，最终促进Ki-67、CD31和VEGF的上调，从而对血管生成、胶原沉积和组织再生产生有益作用。总体而言，PDT与抗生素的联合疗法为糖尿病伤口感染提供了一种有效的治疗方法。

引言

糖尿病伤口是糖尿病患者最常见的并发症之一[1]。研究表明，尽管大约60%–80%的此类伤口能够愈合，但仍有10%–15%的伤口无法愈合，5%–24%的伤口在6–18个月内最终需要截肢[2]。特别是铜绿假单胞菌是导致糖尿病患者严重后果的关键病原体。铜绿假单胞菌感染不仅会对糖尿病患者造成严重损害，还是糖尿病相关败血症和截肢的主要原因[3]。由于其细胞壁的天然低通透性，铜绿假单胞菌对大多数抗生素具有抗性，这使得它成为一种特别致命的病原体[4]。

抗生素是治疗细菌感染最常用的方法。然而，抗生素的广泛使用和滥用显著加速了多重耐药（MDR）微生物的出现和传播[5][6]。此外，对铜绿假单胞菌有效的抗生素（如头孢他啶（CAZ）、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星和哌拉西林）仅在64%–80%的患者中有效[7]。同时，糖尿病伤口中的长期高血糖会损害血管，导致微循环障碍，从而影响局部血液供应。因此，系统性给药的抗生素无法通过血液在感染部位达到有效浓度，大大降低了其治疗效果。尽管局部应用理论上可以规避系统性抗生素给药的限制，但会显著增加细菌耐药性和局部过敏反应的风险[8]。鉴于这些风险，世界卫生组织强烈建议在没有明确临床指征的情况下不要局部使用系统性抗生素[9]。因此，基于传统治疗方法，有必要探索新的治疗策略，以协同对抗感染、调节炎症反应、改善局部微环境并促进组织修复。

光动力疗法（PDT）作为一种新兴的治疗手段，已经引起了广泛关注。5-氨基酮戊酸（ALA）是光敏剂原卟啉IX（PpIX）的代谢前体，因其良好的生物相容性和光动力活性而被广泛应用于PDT[10]。自20世纪90年代以来，基于ALA的PDT（ALA-PDT）被用于治疗光化性角化病、基底细胞癌[11]和尖锐湿疣[12]。2000年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于光化性角化病后，ALA-PDT的应用范围进一步扩大到鲍温病、痤疮、光老化以及各种皮肤恶性肿瘤[13]。后续研究还发现，ALA-PDT对多种细菌具有显著的抗菌活性，展示了其在抗感染治疗中的潜力[14][15]。

尽管有这些发现，PDT仍存在一些固有的局限性，如组织穿透力有限、水环境中活性氧（ROS）的扩散范围短（约100纳米）以及寿命短暂（约3.5微秒）。这些因素限制了其作为单一疗法的效果，尤其是对于深层感染[16]。糖尿病伤口通常伴有深层组织缺氧，这可能会影响PDT的效果。此外，这些伤口常常伴有生物膜感染。虽然PDT可以破坏生物膜结构，但单次治疗往往不足以完全清除嵌入生物膜中的细菌或定植于更深层组织中的细菌，从而使伤口容易再次感染。

为了解决这些局限性，将局部PDT与系统性抗生素联合使用有望充分发挥两者的优势并克服各自的局限性。PDT通过产生ROS发挥局部抗菌作用，有效破坏生物膜并增强抗生素的渗透能力。同时，系统性给药的抗生素可以消除PDT难以到达的扩散性病原体，从而降低全身感染和转移并发症的风险。通过这种联合作用，该方案有望显著改善深层组织和生物膜相关感染的微生物清除情况，同时减少所需的抗生素剂量和治疗时间。这种综合策略可能降低抗菌耐药性和全身毒性的风险，为临床难治性细菌感染提供一种更安全、更有效的治疗方法。

本研究探讨了将ALA-PDT与常规抗生素联合用于治疗感染性糖尿病伤口的潜在疗效。利用细菌感染的大鼠糖尿病模型，我们评估了伤口闭合情况、炎症标志物、胶原沉积和细菌负荷。此外，我们还通过伤口组织的转录组分析阐明了联合治疗的潜在作用机制。我们的研究结果为协同机制提供了新的见解，并提出了一种管理慢性糖尿病伤口的新策略。

章节摘录

细菌菌株和培养条件

本研究使用了四种多重耐药（MDR）细菌菌株：大肠杆菌、耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌（CRKP）、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌（CRPA）。所有菌株均由河北大学附属医院的实验室提供。使用溶原體肉汤（LB）培养基进行细菌培养。细菌菌株在37℃下连续震荡（200 rpm）过夜培养。

细菌通透性检测

通过测定CRPA的MIC和MBC来评估ALA-PDT和常规抗生素的抗菌效果。如补充表S2所详述，CRPA对所有测试的氨基糖苷类（阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素）均敏感。其对头孢菌素（CAZ和头孢吡肟）和多粘菌素表现出中等敏感性，但对碳青霉烯类（亚胺培南和美洛培南）具有抗性。因此，这种CRPA菌株属于MDR细菌。体外抗菌测试表明...

讨论

糖尿病患者的急性创伤性皮肤伤口容易发展为持续性不愈合的慢性伤口[27]。MDR细菌感染是导致伤口持续存在的关键因素，可能导致严重的后果。尽管已经探索了多种促进糖尿病伤口愈合的策略，但最佳的治疗方法尚未确定[28]。本研究探讨了ALA-PDT与CAZ联合使用是否代表了一种有效的新型治疗方案...

结论

本研究表明，ALA-PDT与CAZ的联合使用是一种有前景的协同治疗方案。从临床角度来看，这种协同作用显著降低了抗生素的剂量，这对于减少抗生素过度使用的风险（包括不良反应和抗菌耐药性）至关重要。联合治疗加速的伤口愈合通过多重机制实现...

作者贡献声明

孔飞燕：写作 – 审稿与编辑，原始稿撰写，数据可视化，方法论设计，实验设计，数据分析，数据整理。张婷：实验设计，数据整理。刘月彤：数据可视化，软件操作。李玉彤：数据可视化，数据分析。刘小彤：方法论设计，数据整理。白传鹏：数据可视化，软件操作。王天宇：数据可视化，数据分析。赵詹娟：写作 – 审稿与编辑，数据可视化，项目监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

www.liwenbianji.cn）帮助编辑了本手稿的英文文本。

缩写

ALA-PDT	5-氨基酮戊酸介导的光动力疗法
MDR	多重耐药
CAZ	头孢他啶
PDT	光动力疗法
ALA	5-氨基酮戊酸
PpIX	原卟啉IX
ROS	活性氧
CRKP	耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌
MRSA	耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌
CRPA	耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌
CFU	菌落形成单位
LB	溶原體肉汤
PBS	磷酸盐缓冲盐水
MIC	最低抑制浓度
MBC	最低杀菌浓度
FICI	分数抑制浓度