CASK通过调控ROS-p38-SOCE信号通路及抗氧化酶介导甲基乙二醛诱导的视网膜Müller细胞线粒体相关死亡

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：CASK mediates methylglyoxal-induced mitochondria-associated cell death in retinal Müller cells through modulating the ROS-p38-SOCE signalling pathway and antioxidant enzymes

　　

糖尿病视网膜病变(DR)是一种主要的致盲性疾病，其发生发展部分由糖酵解副产物甲基乙二醛(MGO)的细胞毒性驱动。视网膜Müller细胞(MCs)是维持视网膜完整性与功能的关键细胞，对MGO诱导的损伤高度敏感。钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)是视网膜广泛表达的支架蛋白，其在MCs及DR进展中的作用尚未明确。研究人员在小鼠rMC1细胞中检测到CASK同时定位于细胞核、细胞质及线粒体。敲低CASK可显著减少MGO诱导的细胞凋亡、线粒体活性氧(mtROS)积累、线粒体膜电位崩解及氧化磷酸化损伤，该细胞毒性可被ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)与MitoTEMPO阻断。值得注意的是，沉默CASK还可提升超氧化物歧化酶2(SOD2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)及过氧化氢酶的基础表达水平。此外，CASK缺失可阻止MGO诱导的细胞质与线粒体Ca2+升高及内质网钙库耗竭介导的Ca2+内流。抑制钙库操纵性钙内流(SOCE)、线粒体钙单向转运体(MCU)或CASK激酶活性均可抑制MGO诱导的Ca2+超载与细胞死亡，且不影响mtROS生成。机制层面，CASK与基质相互作用分子1(STIM1)结合以促进Orai1聚集，从而增强SOCE活性；抑制p38信号同样可减少Ca2+积累与凋亡。转录组分析显示，沉默CASK可上调线粒体呼吸与氧化磷酸化相关基因（尤其复合物I与V）的表达。综上，CASK通过激酶非依赖性破坏线粒体与抗氧化防御、以及激酶依赖性激活SOCE两条途径促进MGO诱导的凋亡，提示CASK可作为DR的潜在治疗靶点。

该研究针对糖尿病视网膜病变(DR)中甲基乙二醛(MGO)诱导视网膜Müller细胞(MCs)死亡的机制不明问题，以小鼠rMC1细胞为模型，结合CASK敲低稳转株构建，从细胞死亡类型、线粒体功能、钙信号、MAPK通路、SOCE调控、转录组变化及激酶活性等多维度展开机制探究，最终明确CASK通过双通路介导MGO诱导的MCs凋亡，为DR治疗提供了新的潜在靶点，相关成果发表于《Biomedicine》。

研究人员采用的关键技术方法包括：慢病毒介导的shRNA稳转株构建用于CASK敲低；流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI染色评估细胞凋亡；MitoSOX、JC-1等荧光探针检测线粒体活性氧(mtROS)与线粒体膜电位；Fluo-3 AM、Rhod-2 AM及活细胞钙成像技术分析细胞质与线粒体Ca²⁺动态；蛋白质免疫印迹(Western blot)与免疫共沉淀(co-IP)验证蛋白表达、磷酸化及相互作用；转录组测序(RNA-Seq)分析差异表达基因与功能富集；Seahorse能量代谢分析检测线粒体氧消耗率(OCR)；激光共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位与共定位。

研究结果如下：

3.1 CASK沉默通过减少mtROS生成与线粒体膜电位丢失保护rMC-1细胞抵抗MGO诱导的凋亡

研究人员通过慢病毒shRNA敲低CASK，发现CASK定位于细胞核与线粒体且不受MGO影响。Annexin V/PI染色显示，MGO以时间与浓度依赖方式诱导细胞死亡，该死亡可被caspase抑制剂zVAD阻断，属于凋亡类型；CASK沉默显著降低MGO诱导的凋亡率。进一步实验表明，ROS清除剂NAC与线粒体靶向ROS清除剂MitoTEMPO均可抑制MGO的细胞毒性，且CASK沉默可减少MGO诱导的mtROS（包括O₂^-与H₂O₂）生成及线粒体膜电位丢失，提示CASK通过调控mtROS介导MGO的细胞毒性。

3.2 CASK沉默通过减弱ROS-p38依赖的胞内Ca²⁺升高抑制MGO诱导的细胞死亡

钙检测结果显示，MGO诱导细胞质Ca²⁺持续升高及线粒体Ca²⁺的双相变化（早期短暂下降后持续升高），CASK沉默可降低基础及MGO刺激后的线粒体Ca²⁺水平。钙螯合剂BAPTA-AM可阻断MGO的细胞毒性，且ROS清除剂NAC与MitoTEMPO均能抑制MGO诱导的胞质与线粒体Ca²⁺升高，提示ROS位于Ca²⁺上游。MAPK通路分析发现，MGO可激活ERK、JNK与p38，其中p38的激活最显著受CASK沉默抑制；仅p38抑制剂SB203580可阻断MGO诱导的细胞死亡、mtROS生成后的线粒体膜电位丢失及Ca²⁺积累，且NAC可抑制p38磷酸化，证实MGO通过CASK→mtROS→p38→Ca²⁺轴诱导凋亡。

3.3 CASK沉默通过内质网相关SOCE与MCU通路抑制MGO诱导的线粒体Ca²⁺超载

内质网应激抑制剂4-PBA可部分抑制MGO诱导的细胞死亡与Ca²⁺升高，提示内质网参与该过程。SOCE抑制剂YM-58483与MRS1845均可减少MGO诱导的细胞死亡、胞质与线粒体Ca²⁺升高，但不影响mtROS生成；线粒体钙单向转运体(MCU)抑制剂Ru265同样可阻断上述效应，表明MGO通过内质网SOCE→MCU→线粒体Ca²⁺超载轴发挥毒性作用，且该过程位于ROS下游。

3.4 CASK结合STIM1并调控STIM1-Orai1相互作用

钙成像实验显示，CASK沉默可降低基础及MGO刺激后的SOCE活性；p38抑制剂SB203580可模拟CASK沉默对SOCE的抑制作用。免疫荧光结果显示，MGO可促进STIM1与Orai1的共定位及Orai1在质膜的聚集，该效应被CASK沉默减弱；免疫共沉淀证实CASK与STIM1存在相互作用，提示CASK通过促进STIM1-Orai1互作增强SOCE活性。

3.5 CASK沉默上调线粒体呼吸相关基因表达

转录组测序分析显示，CASK沉默导致222个基因上调、241个基因下调，GO富集提示差异基因主要参与呼吸、氧化磷酸化(OXPHOS)及线粒体结构与功能调控。具体而言，编码线粒体复合物I、III、IV、V亚基的基因在CASK沉默细胞中普遍上调，而复合物II亚基基因无显著变化；Western blot验证显示，CASK沉默可提升NDUFB8（复合物I）、SDHB（复合物II）、UQCRC2（复合物III）、MTCO1（复合物IV）的基础蛋白水平，MGO可降低这些蛋白表达，而复合物V亚基ATP5A不受调控。

3.6 CASK沉默逆转MGO对线粒体呼吸的抑制作用

Seahorse分析表明，MGO可显著降低基础氧消耗率(OCR)与呼吸容量，而CASK沉默本身可提升上述指标，并逆转MGO的抑制作用。OXPHOS抑制剂（ Antimycin A、Oligomycin、FCCP）均可减少MGO诱导的细胞死亡与线粒体Ca²⁺升高，但不影响胞质Ca²⁺水平与线粒体膜电位丢失；仅Oligomycin可减少mtROS生成，提示线粒体Ca²⁺超载是MGO细胞毒性的关键步骤，OXPHOS抑制的保护作用与代谢重编程相关。

3.7 CASK沉默上调抗氧化酶SOD2、GPX4与过氧化氢酶的表达

Western blot与qPCR结果显示，CASK沉默可提升基础状态下SOD2、GPX4与过氧化氢酶的蛋白水平，其中SOD2的mRNA水平同步升高，而GPX4与过氧化氢酶的mRNA无显著变化，提示CASK通过转录水平调控SOD2、通过转录后水平调控GPX4与过氧化氢酶，增强细胞抗氧化能力以对抗MGO诱导的mtROS生成。

3.8 CASK激酶抑制发挥细胞保护作用

CASK激酶活性抑制剂NR162与钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)抑制剂KN-93均可模拟CASK沉默的效应，减少MGO诱导的细胞死亡与胞质、线粒体Ca²⁺积累，但不影响mtROS生成，表明CASK的激酶活性依赖其对SOCE的调控，而激酶非依赖的支架功能则参与mtROS生成与抗氧化酶调控。

讨论部分总结：

研究人员首先指出，既往研究已证实MGO通过ROS与线粒体功能障碍诱导多种细胞死亡，且CASK在神经元与胶质细胞的应激反应中发挥作用，但其在DR中视网膜Müller细胞的作用未知。本研究首次揭示CASK在MGO诱导的MCs凋亡中的双重调控机制：一方面通过激酶非依赖的支架功能抑制线粒体呼吸复合物表达与抗氧化酶（SOD2、GPX4、过氧化氢酶）水平，促进mtROS生成；另一方面通过激酶依赖的方式与STIM1结合，促进STIM1-Orai1互作以增强SOCE活性，进而通过MCU介导线粒体Ca²⁺超载，最终激活凋亡通路。研究还发现，MGO诱导的mtROS可通过激活p38信号放大SOCE，形成正反馈环路。此外，单细胞数据分析显示，糖尿病模型小鼠视网膜Müller细胞中CASK表达上调并与胶质活化标志物GFAP共表达，进一步支持其在DR病理中的生理相关性。该研究明确了CASK作为DR治疗靶点的潜力，为干预MGO介导的视网膜损伤提供了新策略。