在Clostridium carboxidivorans和Clostridium beijerinckii的共培养系统中，物种生长、溶剂生成及气体产生的代谢协同作用

《Bioresource Technology Reports》：Metabolic synergy of species growth, solvent, and gas production in cocultures of Clostridium carboxidivorans and Clostridium beijerinckii

　　

Okezie Emmanuel | Christopher C. Okonkwo | Stephen A. Akinola | Hasan K. Atiyeh | Thaddeus C. Ezeji

生物技术与发酵小组，动物科学系，食品农业与环境科学学院，俄亥俄州立大学，伍斯特，OH 44691，美国

摘要

传统的单一培养发酵过程常常受到内在代谢效率低下的限制，这限制了碳的利用和产物的产量。然而，共培养代谢互补的微生物物种提供了一种有吸引力的但尚未得到充分利用的策略来克服这些限制。本研究探讨了自养CO₂固定细菌Clostridium carboxidivorans与强健的异养溶剂生产菌C. beijerinckii之间的共生关系，以提高丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵过程中的碳流分布。共培养物的接种比例为50:50、60:40和70:30。通过针对recA基因的实时定量PCR（RT-qPCR）技术对每种菌株进行了定量分析。在所有比例下，C. beijerinckii占主导地位，分别占菌群的80%、78%和74%。共培养物的丁醇产量显著提高（P < 0.05），其中50:50和60:40的比例分别达到了13.1 g/L和13.8 g/L，比C. beijerinckii单一培养（12.48 g/L）提高了约1.1倍。气相色谱分析显示共培养物中的H₂和CO₂产量降低，表明C. carboxidivorans通过Wood-Ljungdahl途径吸收了这些气体。值得注意的是，尽管葡萄糖消耗量较低（初始浓度为60 g/L），共培养物的ABE产量和生产力仍显著提高（P < 0.05），表明碳的利用更加高效。这种性能提升归因于代谢间的交叉供给，即一种菌株产生的中间产物被另一种菌株利用，从而减少了通过气体形式的碳损失。这些结果展示了工程化共培养在提高溶剂生产和碳转化效率方面的潜力。因此，这种方法通过结合异养发酵与自养CO₂固定，为推进更清洁和可持续的生物燃料生产提供了可行的策略。

引言

向更清洁的生产方式和低碳能源路径的转变需要创新的生物技术策略，以提高资源利用效率并减少温室气体（GHG）排放（Li et al., 2023; Nath, 2024; Emmanuel et al., 2025a）。微生物发酵长期以来一直是可再生燃料开发的基石，提供了与化石衍生物功能相当的生物基化学品的生产途径（Ezeji et al., 2023; Emmanuel et al., 2024）。在所研究的微生物平台中，像Clostridium carboxidivorans P7^T这样的产乙酸细菌因其独特的CO₂（一种主要的温室气体）和H₂固定能力而备受关注。这种还原性乙酰-CoA途径使气体底物能够被转化为关键的代谢中间体，包括乙酸和乙酰-CoA，这些中间体是下游生物合成（如丁醇生产）的前体（Amiri, 2020; Zhang et al., 2024）。

虽然单独培养细菌菌株是发酵技术中的标准做法，但将CO₂固定菌与溶剂生成菌配对的共培养策略为提高碳回收率和多样化产物构成提供了新的机会（Du et al., 2020）。Clostridium属物种在这方面特别具有吸引力，因为它们具有天然的溶剂生成代谢能力（Ezeji and Blaschek, 2010; Emmanuel et al., 2025b）。例如，C. carboxidivorans P7^T是一种中温专性厌氧菌，可以在合成气体（CO₂、CO和H₂）上自养生长，并通过Wood-Ljungdahl途径直接合成乙醇和丁醇（Thunuguntla et al., 2024; Feliu-Paradeda et al., 2025）。尽管在培养基组成（Phillips et al., 2015; Zhang et al., 2016; Shen et al., 2017）、pH值（Fernández-Naveira et al., 2017）、温度（Ramió-Pujol et al., 2015）和生物反应器设计（Shen et al., 2017）等方面进行了大量优化，但在这种细菌在理想条件下的丁醇产量仍低于1 g/L。这一限制主要与其较慢的生长速率和较低的丁醇生产力有关，使其在工业应用上不如其他Clostridium物种（Herzog et al., 2025）。

相比之下，C. beijerinckii在ABE发酵中是一株公认的优良菌株，以其高丁醇产量和广泛的底物适应能力而闻名（Ezeji et al., 2007; Okonkwo et al., 2020; Emmanuel et al., 2026）。它能够有效转化各种糖类和淀粉类原料，将其转化为燃料和化学品（Masset et al., 2012）。然而，与C. carboxidivorans不同，C. beijerinckii无法在合成气体上生长。先前的研究表明，C. carboxidivorans可以产生不同浓度的己醇和己酸，但浓度变化较大，且高度依赖于合成气组成和培养条件，据报道己醇的浓度从无法检测到到1.33 g/L不等，己酸的浓度最高可达1.05 g/L（Feliu-Paradeda et al., 2025; 补充表1）。

尽管在ABE发酵方面取得了显著进展，但仍然存在一个 persistent challenge：即使在高性能系统中，也有高达三分之一的原料碳以CO₂的形式损失（Sandoval-Espinola et al., 2017）。这种低效率不仅降低了总体产量，还削弱了生物燃料生产的环境效益。因此，将CO₂和H₂的再利用整合到发酵过程中对于提高碳效率和可持续性至关重要。此外，单一菌株发酵系统的产品种类有限且产量不佳，这突显了微生物联合体的潜在优势（Du et al., 2020; Emmanuel et al., 2026），它们可以利用互补的代谢特性来提高底物转化率和扩展产品多样性（Emmanuel et al., 2025b）。然而，微生物共培养也带来了自身的挑战，包括竞争性相互作用、抑制性代谢产物的积累以及种群动态的不稳定性，尤其是在亲缘关系密切的Clostridium物种之间，其生理相似性使得过程监测和控制变得复杂（Du et al., 2020）。尽管之前尝试利用微生物联合体进行ABE发酵取得了积极成果，但往往受到种群平衡控制不佳、底物代谢竞争以及共培养过程中不稳定的影响（Du et al., 2020）。在许多情况下，不同的生长速率会导致某种生物占主导地位，从而削弱了预期的协同效应。代谢互补性不足和抑制性中间产物（如有机酸）的积累进一步限制了溶剂产量。这些挑战表明，需要合理设计的共培养系统，具备明确且互补的代谢功能。将C. carboxidivorans与C. beijerinckii配对具有明显优势，因为它们的代谢能力可以实现交叉供给和更好的碳利用。我们假设增加C. carboxidivorans的初始接种比例可以弥补其相对于C. beijerinckii较慢的生长速率，从而促进稳定的共存、促进交叉供给相互作用，并提高共培养中的溶剂产量。

在这项研究中，我们调查了C. carboxidivorans和C. beijerinckii在葡萄糖发酵过程中生产丁醇时的共生关系。为了指导共培养的设计，我们采用了基于Benito-Vaquerizo等人（2022）的方法进行了初步的基因组规模代谢建模（GEM），以确定能够最小化竞争排斥并促进菌株间互利的最佳接种比例和生长条件。为了在共培养中实现精确的物种特异性监测，我们开发了针对高度保守的recA基因的RT-qPCR检测方法（Savichtcheva et al., 2011）。随后通过全面分析生长动态、溶剂（ABE）产量和气体副产物（H₂和CO₂）在批次发酵条件下的表现来评估共培养的效果。

章节片段

细菌细胞和培养条件

本研究中使用的Clostridium carboxidivorans P7^T和C. beijerinckii NCIMB 8052菌株（分别称为C. carboxidivorans和C. beijerinckii）来自美国马纳萨斯的American Type Culture Collection。选择P7^T菌株是因为它具有成熟的合成气体发酵能力，包括溶剂生成和乙酸/丁醇/己醇的生产，以及通过Wood-Ljungdahl途径的自养生长能力。

C. carboxidivorans和C. beijerinckii在不同底物上的生长速率预测和稳态流量

图1A-B展示了C. carboxidivorans和C. beijerinckii在多种底物上的生长速率预测。结果显示不同碳源对每种菌株生长动力学的影响不同。C. beijerinckii在葡萄糖和乙酸组合下的生长速率最高（0.42 h^?1），而单独使用葡萄糖时生长速率适中（0.35 h^?1）。相比之下，C. carboxidivorans在CO₂/H₂共同存在下达到了最大生长速率（0.28 h^?1）。

讨论

传统的单一培养发酵过程常常受到代谢限制，包括底物利用不完全和抑制性中间产物（如有机酸）的积累。为了解决这些问题，本研究探讨了C. carboxidivorans和C. beijerinckii之间的共生协同作用，以增强ABE发酵过程中的溶剂生产和气体（H₂和CO₂的生成。选择这两种菌株是因为它们具有互补的代谢能力：

结论

本研究表明，共培养C. carboxidivorans和C. beijerinckii可以通过代谢互补性提高溶剂产量。在测试的所有接种比例中，60:40的共培养组获得了最高的ABE产量，既平衡了气体利用又促进了溶剂生成，表现优于单一培养和其他比例组合。这种改进可能源于C. carboxidivorans通过Wood-Ljungdahl途径以CO₂/H₂固定提供乙酰-CoA前体。

CRediT作者贡献声明

Okezie Emmanuel:撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，软件应用，方法学设计，实验研究，数据分析，数据整理。Christopher C. Okonkwo:撰写 – 审稿与编辑，验证，方法学设计，实验研究，数据整理。Stephen A. Akinola:验证，方法学设计，实验研究，数据整理。Hasan K. Atiyeh:撰写 – 审稿与编辑，验证，方法学设计，实验研究。Thaddeus C. Ezeji:撰写 – 审稿与编辑，可视化：

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