《Bioresource Technology》：Enhancing selective esterification of conjugated linoleic acid isomers by immobilized Candida rugosa lipase via hydrophobic acyl acceptors
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杜美君|金俊|孙聪|Abdelaziz Elbarbary|魏伟|张慧|金青哲|王兴国|崔哲中国江南大学食品科学与技术学院食品科学与资源国家重点实验室，无锡214122摘要利用在C18烷基链改性的介孔二氧化硅上 immobilized 的 Candida rugosa 脂酶（MS
杜美君|金俊|孙聪|Abdelaziz Elbarbary|魏伟|张慧|金青哲|王兴国|崔哲
中国江南大学食品科学与技术学院食品科学与资源国家重点实验室，无锡214122
摘要
利用在C18烷基链改性的介孔二氧化硅上 immobilized 的 Candida rugosa 脂酶（MS-C18），构建了一种非水相选择性酯化系统，用于分离共轭亚油酸（CLA）异构体。研究了不同疏水性酰基受体对酯化性能和异构体选择性的影响。在控制反应条件（CLA与醇的摩尔比为1:1，40℃）下，增加酰基受体的疏水性可以提高酯化速率以及c9,t11-CLA和t10,c12-CLA之间的反应速率差异，其中 n-辛醇被确定为最佳酰基受体。通过两步酯化策略，首先从商业CLA混合物中分离出富含c9,t11的酯和富含t10,c12的游离脂肪酸组分，然后分别对这两种游离脂肪酸进行二次酯化，从而同时获得高纯度（≥90%）的两种异构体，并实现了38.1%-52.4%的总回收率。动力学分析表明，该反应遵循醇抑制的Ping-Pong Bi-Bi机理，观察到的选择性与其对两种CLA异构体的不同底物亲和力和催化效率有关。使用更具疏水性的酰基受体可以减少底物对催化的抑制，并增强异构体之间的反应速率差异，从而提高分离效率。本研究表明，调节酰基受体的疏水性是一种有效的方法，可用于调控非水体系中的选择性酯化，为高纯度CLA异构体的制备提供了一种可行且可扩展的手段。
引言
共轭亚油酸（CLA）是指含有共轭双键（?C
C-C
C-") 的十八二烯酸（C18:2）的所有位置和几何异构体（Badawy等人，2023年）。两种主要的生物活性异构体是
cis-9,
trans-11（c9,t11-CLA）和
trans-10,
cis-12（t10,c12-CLA），它们在双键位置（Δ9,11 vs Δ10,12）和几何结构（cis–trans vs trans–cis）上有所不同。在天然的反刍动物产品中，CLA以多种异构体的混合物形式存在，其中c9,t11-CLA是主要成分，同时还存在少量的其他位置和几何变体。这两种异构体具有不同的生物活性（Shen和McIntosh，2016年；Song等人，2023年；Du等人，2024年）。然而，由于它们的结构高度相似，有效的分离具有挑战性，目前工业方法效率低下且资源消耗大，这限制了对其机制的研究和工业应用。
脂酶催化的酯化反应因其内在的立体选择性而成为分离CLA单体的有前途的方法。Candida rugosa 脂酶（CRL）是一种经过充分研究的、选择性强的生物催化剂，已与尿素包合法和分子蒸馏等下游分离技术结合使用，实现CLA单体的富集（Du等人，2025年；Nagao等人，2003年）。然而，基于游离脂酶的传统系统受水活性的影响较大，选择性不足，重复使用性差，通常需要多阶段分离过程，导致效率低下和成本较高。固定化是一种有效的策略，可以提高酶的稳定性、重复使用性和操作稳健性。载体的物理化学性质，特别是表面疏水性，可以调节脂酶周围的微环境，从而影响底物的可及性、界面活化及催化选择性（Garcia-Galan等人，2011年；Manoel等人，2015年）。这种效应可以通过脂酶的界面活化机制来解释：在均相介质中，活性位点通常部分被一个可移动的盖子结构覆盖；而在疏水界面存在的情况下，盖子会发生构象变化，暴露出催化位点，使底物能够接触到酶（Fernandez-Lafuente，2010年）。疏水性载体可以模拟这种界面环境，并选择性吸附脂酶的开放形式，从而稳定其催化活性构象，调节酶的活性和选择性（Guisan，2006年；Manoel等人，2015年）。因此，调节载体的疏水性可能为调控CLA酯化系统中的催化性能和选择性提供合理的手段。
尽管脂酶固定化具有优势，但脂酶催化的酯化反应的催化性能仍受水活性的显著影响。脂酶催化的酯化是一个热力学可逆过程，水会直接影响酯化-水解平衡（Kasche，1986年）。虽然需要一定量的水来维持酶的活性，但过多的水会促使平衡向水解方向偏移，降低分离效率。在固定化系统中，酯化过程中产生的水可能在生物催化剂内部积聚，导致局部微环境不利，转化率降低，进而可能使反应平衡向水解方向偏移（Marty等人，1997年；Séverac等人，2011年）。因此，调节反应体系中的水分布对于提高催化性能至关重要。在这种情况下，反应环境的疏水性，包括固定化载体和反应组分的疏水性，在调节酶的微环境和水分分布中起着重要作用（Mateo等人，2007年；Garcia-Galan等人，2011年）。然而，针对CLA系统的研究尚有限。例如，Yu等人（2015年）报道了在低水活性环境下，使用固定在介孔二氧化硅上的脂酶在异辛烷系统中实现了选择性酯化。进一步的研究表明，尤其是在经过疏水改性的介孔载体上固定脂酶，可以提高CLA异构体的分离效率（Du等人，2026年）。更重要的是，一个关键因素尚未得到充分关注：在非水体系中，酰基受体不仅作为反应底物，还影响界面极性、底物分布以及脂酶的构象稳定性（Yang等人，1994年；Martinelle和Hult，1995年）。因此，它们的疏水性可能在调控选择性酯化行为中起关键作用。
本研究使用固定在十八烷基硅烷改性的介孔二氧化硅（MS-C18）上的 Candida rugosa 脂酶构建了一种非水相选择性酯化系统。系统地研究了不同疏水性酰基受体对CLA酯化效率和异构体分离的影响。经过筛选和优化后，采用两步酯化策略处理不同的商业CLA混合物，成功地实现了两种异构体的高纯度和高回收率的同步制备。动力学分析进一步揭示了固定化脂酶对这两种CLA异构体的选择性催化特性，并阐明了酰基受体疏水性在调控异构体分离中的作用。总体而言，这项工作为高效酶法分离CLA异构体提供了通用的策略和机理见解。
片段
材料
从中国青岛的Auhai Biotechnology Co., Ltd.购买了总CLA含量分别为80%、95%和98%的商业CLA混合物，其中主要包含等摩尔的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA，分别命名为FFA-80、FFA-95和FFA-98。Candida rugosa 脂酶（Lipase AY “Amano” 400SD，400 U/mg）购自Amano Enzyme China Ltd。介孔二氧化硅微球（XD-SO5J）由芜湖Xinda新材料科技有限公司提供。所有溶剂和……
不同疏水性酰基受体对CLA异构体酯化的影响
酰基受体的疏水性会影响脂酶催化的酯化反应的动力学和平衡（Hoff和Eisenacher，2025年）。为了系统研究酰基受体疏水性对由固定化MS-C18-AY催化的CLA异构体非水相酯化效率的影响，选择了六种碳链长度逐渐增加的初级醇作为酰基受体，分别是甲醇、乙醇、n-丙醇、n-丁醇、n-戊醇和n-辛醇。图1A中的所有反应……
结论
本研究表明，在非水体系中，酰基受体的类型决定了MS-C18-AY催化的CLA异构体酯化的效率和选择性。n-辛醇提高了酯化速率并改善了异构体的分离效果。在优化条件下，两步酯化过程实现了两种CLA单体的高纯度和高产率同时制备，证实了该系统的可行性。动力学分析揭示了一种醇抑制的Ping-Pong Bi-Bi机理……
未引用的参考文献
Monteiro等人（2021年）。
CRediT作者贡献声明
杜美君：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，软件操作，方法学研究，实验设计。金俊：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。孙聪：资源协调，资金获取。Abdelaziz Elbarbary：。魏伟：监督。张慧：监督，资源协调。金青哲：监督，资源协调。王兴国：监督，资源协调。崔哲：监督，资源协调。
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢食品科学与资源国家重点实验室江南大学（项目编号：SKLF-ZZB-202509）、河南省高等教育机构关键研究项目计划支持（项目编号：26A550007）以及河南省自然科学基金（项目编号：252300423563）的财政支持。
