一种基于超灵敏CRISPR/Cas12a系统的电化学生物传感器，用于检测产毒的艰难梭菌

《Biosensors and Bioelectronics》：An Ultrasensitive CRISPR/Cas12a Based Electrochemical Biosensor for Detection of toxigenic Clostridioides difficile

　　

程梦青|陈新月|程宏瑞|高向林|敖皓月|鲍新阳|宋晓军|邰玉蕾|金大志|张雷

教育部生物医学工程重点实验室，浙江大学生物医学工程与仪器科学系，中国杭州310027

摘要

艰难梭菌（C. difficile）感染（CDI）是一个严峻的全球医疗挑战，需要开发快速、准确且成本效益高的诊断平台来减少院内传播并改善患者预后。与传统方法相比，CRISPR/Cas系统通过单链RNA进行特异性目标重组，并结合电化学技术，能够高度敏感地检测各种生物标志物。然而，由于缺乏定制的crRNA，其在CDI中的应用尚未得到探索。在此，我们展示了CRISPR/Cas12a与电化学转导的集成，用于直接检测C. difficile。我们设计了一种新型crRNA，能够特异性识别毒素B基因（tcdB），在目标结合时激活Cas12a的转切割活性。这一级联反应会触发电极表面固定化的单链DNA报告分子的切割，产生可测量的安培信号变化。所开发的生物传感器表现出优异的性能，在40分钟内实现对tcdB DNA的pM级别检测限，并对非目标病原体具有高特异性，在7天内稳定性良好。这项工作建立了一个快速可靠的CRISPR-电化学诊断平台，为CDI的即时检测提供了重要潜力。

引言

艰难梭菌（C. difficile）是人体肠道中的共生细菌，也可能成为机会性病原体。滥用广谱抗生素、化疗药物和免疫抑制剂常常导致C. difficile过度生长及其毒素的累积，从而引发严重的肠道炎症，即艰难梭菌感染（CDI）。如果不及时治疗，CDI可能发展为败血性休克并危及生命。[1],[2] 因此，快速准确地检测CDI对全球公共卫生至关重要。[3]

传统的CDI诊断方法，包括细胞毒性测定和细菌培养，通常耗时较长，[4],[5] 这限制了它们在快速临床决策中的实用性。像酶免疫测定和酶联免疫吸附测定（ELISA）这样的免疫学技术虽然具有高特异性，但通常需要昂贵的仪器、复杂的程序，并且容易受到生物样本中非目标蛋白质的干扰。[6] 相比之下，核酸扩增测试（NAAT），如定量PCR（qPCR）和数字PCR，已成为CDI检测的确定性和确认性方法，具有出色的特异性和准确性。[7],[8] 然而，其对复杂热循环设备、受控实验室条件和熟练操作人员的依赖限制了其广泛应用，特别是在资源有限的情况下。[9]

电化学生物传感器因其快速的信号响应、便携性和成本效益而在检测各种生物标志物方面得到广泛应用。[10],[11],[12],[13] 在CDI检测背景下，已经开发出基于电化学生物传感器来特异性识别病原体释放的毒素A或B，利用抗原-抗体结合或适配体识别等原理。[14],[15],[16] 然而，这些方法容易被复杂生物样本中的非目标蛋白质干扰，导致假阳性结果。[5] 相比而言，基于核酸的检测方法利用严格的碱基配对互补性，提供了更高的特异性和准确性。[17],[18],[19] 不过，将低丰度核酸片段直接固定到电极表面上通常会产生弱电化学信号，从而导致灵敏度有限。[20],[21],[22],[23]

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）系统作为下一代生物传感平台受到了广泛关注，因为它们具有高特异性、可编程性和核酸识别效率。[24],[25],[26] 其中，CRISPR/Cas12a系统在结合目标DNA时表现出顺式和反式切割活性，能够非特异性降解附近的单链DNA或RNA探针。这一特性被广泛应用于生物传感中的信号转导和扩增。[27],[28],[29] 例如，基于荧光的CRISPR/Cas系统因其一步反应、均匀性和高通量能力而被用于核酸检测。[30],[31],[32],[33] 然而，其在临床应用中面临几个限制，特别是临床样本通常具有高背景荧光，可能导致假阳性结果。这种方法依赖于复杂且昂贵的光学仪器，不适用于现场快速检测。

相比之下，CRISPR/Cas12a与电化学传感平台的集成实现了高度敏感和便携的核酸检测。[9],[34],[35] 通过切割固定在电极上的目标或探针，可以记录可检测的电化学信号变化。[36] 例如，有一种CRISPR/Cas12a电化学生物传感器被报道用于检测猴痘病毒（MPXV），具有超高的灵敏度（约aM水平），通过整合CRISPR/Cas12a系统、四面体DNA纳米结构（TDN）修饰电极和基于HCR的信号放大策略实现。^[38] 为了增强Cas12a的切割活性，制备了一种由Cas12a/crRNA组成的Mn-MOF复合材料，释放适当的Mn²⁺离子后，显著提高了其转切割活性。利用这种放大策略，所开发的电化学生物传感器实现了无需预放大即可检测突变ctDNA的超灵敏度（0.28 fM）。[39] 尽管CRISPR/Cas12a在检测各种核酸目标方面取得了成功应用，但由于缺乏针对C. difficile目标DNA设计的特异性crRNA，其在CDI检测方面的潜力尚未得到探索。在我们之前的工作中，我们鉴定出一个编码毒素B的基因（tcdB）序列，适用于使用多重交叉置换扩增（MCDA）快速检测产毒C. difficile。^[40] 这一序列为特异性crRNA的合理设计奠定了基础，从而促进了基于CRISPR/Cas12a的电化学生物传感器的发展，用于检测C. difficile。

在这项研究中，我们利用CRISPR/Cas12a系统的转切割活性开发了一种超灵敏且特异性的C. difficile检测电化学生物传感器（图1）。为了确保特异性检测C. difficult，设计了一种关键的crRNA引物，以特异性识别tcdB基因并激活CRISPR/Cas12a系统的切割活性。此外，为了实现高灵敏度的电化学检测，在其表面固定了单链DNA（ssDNA）报告探针。对于我们的CRISPR/Cas12a系统中的功能电极，我们进行了战略性表面修饰以防止非特异性吸附。为了解决Cas蛋白和切割后的ssDNA片段的非特异性吸附问题，我们战略性地使用了BSA作为替代阻遏剂，有效钝化了电极表面对这些生物分子的吸附。这种基于BSA的策略保留了CRISPR/Cas12a的切割活性和检测信号的准确性。此外，为了在异质电极-溶液界面实现高效的CRISPR切割，我们系统研究了界面动力学并重新优化了反应条件（例如缓冲液组成、反应时间和组分浓度）。这一关键的优化步骤对于在电极平台上建立稳定、可控且高度敏感的检测方法至关重要。我们展示了一个概念验证研究，并进行了初步的临床验证，结果显示标准菌株中的tcdB基因检测限为0.9 ng/μL，临床样本中的检测限为2.4 ng/μL，均在40分钟内完成。这些结果突显了该平台在快速准确临床诊断CDI方面的强大潜力。

章节摘要

化学物质和材料

使用Primer3（v0.4.0）设计了多个交叉置换扩增（MCDA）引物（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），并通过国家生物技术信息中心Primer BLAST以及不同tcdB基因变体的比对验证了引物的特异性^[41]。如表S1所示，每个引物集包含10个引物，包括两个交叉引物（CP1和CP2）、两个置换引物（F1和F2）和六个扩增引物（C1、C2、D1、D2、R1和R2）

Cas12a/crRNA复合物的切割活性

为了特异性检测C. difficile，设计了一种定制的crRNA来识别编码毒素B的基因（tcdB）。如图2a所示，crRNA由重复序列和间隔序列组成。重复序列（“AAUUUCUACUAAGUGUAGAU”）介导与Cas12a蛋白的结合，而间隔序列与目标DNA互补。

目标识别依赖于目标DNA中存在的一种原间隔序列基序（PAM，5’-TTTV）和互补配对

结论

总之，我们开发了一种新型电化学生物传感平台，结合了CRISPR/Cas12a技术，实现了C. difficile感染的快速高灵敏度检测，达到了pM级别的检测限。这项工作是CRISPR/Cas12a与电化学读数的首次成功结合，用于CDI诊断。具体来说，我们设计了一种针对C. difficult的tcdB基因的crRNA，并使用了一个定制的20个碱基的单链DNA片段作为

CRediT作者贡献声明

鲍新阳：研究。陈新月：研究。程宏瑞：方法学。高向林：方法学。敖皓月：方法学。金大志：写作-审稿与编辑。张雷：写作-审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、数据分析、概念化。程梦青：写作-初稿、项目管理。宋晓军：研究。邰玉蕾：方法学

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究工作得到了浙江省先锋引领计划（2024C04040, 2025C01072）、中国中央高校的基本研究资金（编号226-2022-00083）以及浙江省重大科技医疗与健康计划（WKJ-ZJ-2309）的财政支持。