《Biosensors and Bioelectronics》：DNAzyme-Protease Cascade Amplified Triple-Modal Biosensing Platform with Machine Learning Integration for Specific Monitoring of Plant Pathogens
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陶文|吴青年|赵卓颖|金晨晨|李宁|孙霖|王海波|黄克静|刁凯生|谭学材广西壮族自治区教育厅，应用分析化学重点实验室，广西森林产品化学与工程协同创新中心，国家民委森林产品化学与工程重点实验室，广西民族大学化学与化工学院，南宁530006，中国摘要甘蔗“Pokkah Boeng”病
陶文|吴青年|赵卓颖|金晨晨|李宁|孙霖|王海波|黄克静|刁凯生|谭学材
广西壮族自治区教育厅，应用分析化学重点实验室，广西森林产品化学与工程协同创新中心，国家民委森林产品化学与工程重点实验室，广西民族大学化学与化工学院，南宁530006，中国
摘要
甘蔗“Pokkah Boeng”病对全球糖产量构成了严重威胁，迫切需要既高度敏感又无需复杂仪器即可操作的现场检测工具。本文报道了一种自供电生物传感平台，该平台结合了电化学、比色法和光热三种检测方式，并借助机器学习实现了对“Pokkah Boeng”病原体的超高灵敏度和特异性检测。该传感接口采用MWCNT@ZIF-8/AuNPs纳米复合材料构建，有利于电子传输并提供了丰富的活性位点。通过利用DNA酶切割和Exonuclease III（ExoIII）辅助循环的级联放大策略，该系统在不需要多个酶系统或复杂序列设计的情况下实现了显著的信号增强。G-四链体/血红素DNA酶的引入不仅通过TMB氧化实现比色信号，还实现了稳健的近红外光热转换，从而补充了电化学和比色检测方式。此外，采用线性回归、岭回归、Lasso回归和SGD回归等机器学习算法对多模态数据进行了建模，通过交叉验证显著提高了预测准确性和鲁棒性。所提出的生物传感器表现出优异的灵敏度，检测限分别为20.41 aM（电化学）、25.36 aM（比色法）和18.91 fM（光热法），适用于广泛的线性范围。通过在实际甘蔗叶提取物中的加标回收实验验证了其实用性，获得了令人满意的回收率（99.0-108.0%）和高重复性（RSD < 5%）。这项工作为早期植物病害监测提供了一种可靠且便携的策略，并展示了多模态传感与机器学习在农业诊断中的潜在整合。
引言
植物病害对全球农业生产力和食品安全构成重大威胁，因此需要开发快速、准确且可现场操作的诊断技术。其中，甘蔗“Pokkah Boeng”病已成为一种极具破坏性的感染，导致全球糖产量大幅损失（Zhang等人，2025年）。由于缺乏能够在资源有限环境中运行的灵敏、便携和可靠的传感平台，早期和特异性检测病原体仍然具有挑战性。
传统的病原体检测方法，包括定量聚合酶链反应（qPCR）（Yin等人，2025年）、形态观察（Wang等人，2024年）和表面增强拉曼光谱（Song等人，2025年），虽然有一定可靠性，但存在依赖复杂仪器、实验室设施和熟练操作人员的限制，这限制了它们在快速田间检测和大规模筛查中的应用。近年来，自供电酶燃料电池（EBFCs）因便携性、低成本以及无需外部电源即可运行的能力而受到关注（Xu等人，2024年）。通过利用生物电催化反应，EBFCs能够将生物事件产生的化学能转化为电信号，从而实现连续性和微型化的传感平台（Gao等人，2025年）。
尽管具有这些优势，大多数基于EBFC的传感器在实现超高灵敏度和特异性方面仍面临挑战，因为它们通常需要复杂的核酸扩增策略。传统的扩增技术，如链置换扩增（SDA）（Feng等人，2025年）和滚环扩增（RCA）（Zhang等人，2024年），往往需要多种酶和复杂的引物设计，这增加了实验的复杂性和成本（Shen等人，2025年）。尽管已经开发出无酶替代方案，如催化发夹组装（CHA）和杂交链反应（HCR）（Yang等人，2024年；Geng等人，2025年），但它们通常受序列依赖性的限制，且扩增效率有限。为了解决这些问题，我们提出了一种结合DNA酶切割和ExoIII辅助循环的新型级联信号放大策略。这种方法不仅简化了反应步骤，还通过循环酶促降解提高了扩增效率，即使在极低的目标浓度下也能实现超高灵敏度的检测。
此外，为了提高检测可靠性和便于多通道信号获取，我们引入了一种结合电化学、比色法和光热检测方式的三模态生物传感系统。G-四链体（G4）/血红素DNA酶模拟物的引入使得3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）在近红外照射下能够发生催化氧化，从而产生比色和光热信号（Zhao等人，2025年）。这种多信号输出策略具有内置的交叉验证功能，显著提高了检测准确性和降低了误报率。
生物传感器性能的另一个关键方面是电极材料。虽然金属有机框架（MOFs）具有高表面积和可调孔隙率（Chai等人，2025年），但其较差的电导率限制了直接的电化学应用。以往尝试通过高温炭化MOFs来提高导电性，但这增加了复杂性、安全风险和成本（Li等人，2024年）。在这项工作中，我们设计了一种混合纳米复合材料MWCNT@ZIF-8/AuNPs，在合成过程中将多壁碳纳米管（MWCNTs）嵌入沸石咪唑酸盐框架（ZIF-8）中，形成了导电网络，有利于电子传输并为生物分子提供了丰富的固定位点。
最后，多模态数据的复杂性日益增加，需要先进的处理工具来提取有意义的模式并确保稳健的定量分析。机器学习（ML）算法在处理高维数据和建立输入特征与目标输出之间的非线性关系方面显示出优异的实用性（Mirza等人，2019年）。与传统拟合方法不同，机器学习模型（如支持向量机、随机森林和正则化线性模型）可以整合多源传感数据，减轻噪声，并显著提高预测准确性和泛化能力。
本文基于DNA酶-蛋白酶级联放大策略，提出了一种集成机器学习的三模态生物传感平台，用于超灵敏和特异性检测甘蔗“Pokkah Boeng”病原体。该平台综合了以下创新：（1）由DNA酶和ExoIII介导的一步扩增策略；（2）采用电化学、比色法和光热检测方式的三信号输出系统；（3）具有增强导电性和催化活性的MWCNT@ZIF-8/AuNP修饰电极；（4）基于机器学习的数据融合机制，以提高预测准确性和可靠性。所提出的生物传感器具有高灵敏度、特异性和便携性，为早期植物病害诊断和基于现场的农业监测提供了强大的工具。
部分片段
实验仪器、试剂和纳米材料的准备
这部分内容见支持信息。
目标响应DNA纳米机器的逐步组装程序
购买的核苷酸序列粉末按照说明书中的方法稀释至100 mM，（目标序列除外）进一步稀释至1 mM用于实验。目标核苷酸链从100 mM浓度稀释到10-8、10-9、10-10、5×10-11、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、5×10-16和10-16 M的浓度，以测试它们的多模态信号响应。相应的输出
三模态机器学习辅助生物传感平台的工作原理
如图1A所示，首先构建初始扩增模板。DNA链A1和A2通过互补碱基配对进行杂交。随后，A1-A2双链与A3和磁性珠子协同组装。然后，发夹结构H1通过碱基互补配对锚定在A3上，完成识别复合物的制备。目标诱导的生物信号放大过程如图1B所示。
结论
总之，我们构建了一个基于机器学习辅助的三模态自供电生物传感平台，用于超高灵敏度检测甘蔗“Pokkah Boeng”病原体。使用MWCNT@ZIP-8/AuNPs纳米复合材料电极显著提高了导电性和生物分子的固定能力。基于DNA酶和ExoIII蛋白酶的核心级联扩增策略实现了高效的目标循环和信号生成，简化了操作同时保持了高效率。
CRediT作者贡献声明
黄克静：写作 – 审稿与编辑，项目管理，方法论，资金获取，概念化。孙霖：方法论。谭学材：方法论，概念化。刁凯生：监督，项目管理，概念化。王海波：概念化。吴青年：写作 – 审稿与编辑，方法论，研究。陶文：写作 – 初稿，资源提供，研究。金晨晨：方法论。赵卓颖：资源提供。李宁：方法论
数据可用性声明
数据和材料均包含在本手稿和支持信息中。
致谢
作者感谢中国自然科学基金（编号22464004、22074130）和广西自然科学基金（2024GXNSFAA010431）的财政支持。
