《Biotechnology Reports》：Overcoming challenges in the production of a human-like L-asparaginase: advanced strategies for expression and purification
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人源L-天冬酰胺酶1（hASNase1）因免疫原性低、生理相容性优异，是急性淋巴细胞白血病（ALL）下一代治疗的潜力候选分子。但该酶的重组生产存在显著挑战：在大肠杆菌中表达易形成不溶性聚集体，且与宿主分子伴侣紧密结合，限制了生化表征。研究人员建立了一种优化工作
人源L-天冬酰胺酶1（hASNase1）因免疫原性低、生理相容性优异，是急性淋巴细胞白血病（ALL）下一代治疗的潜力候选分子。但该酶的重组生产存在显著挑战：在大肠杆菌中表达易形成不溶性聚集体，且与宿主分子伴侣紧密结合，限制了生化表征。研究人员建立了一种优化工作流程，结合温和诱导条件、定制化增溶及纯化策略。亲和层析过程中，L-天冬酰胺孵育联合ATP介导的洗涤可显著提升蛋白回收率，同时减少分子伴侣共纯化。该方法成功分离得到具有催化活性的hASNase1，其表现出变构调节与协同底物结合特性，与该酶四聚体组装的预期一致。互补的计算机模拟分析鉴定出聚集倾向区域，为观察到的表达挑战提供了结构层面的解释。综上，本研究为原核系统中难表达人源酶的重组生产策略优化提供了支撑。
该研究针对人源L-天冬酰胺酶1（hASNase1）重组生产难题展开系统性攻关。现有临床应用的L-天冬酰胺酶（ASNase）均源于细菌，免疫原性高，易引发超敏反应与治疗中断；而hASNase1属于人60kDa溶血磷脂酶N端结构域，生物相容性更优，但其异源表达时易形成包涵体、与大肠杆菌分子伴侣强结合，此前研究仅能获得无活性产物或需复杂复性流程，严重阻碍了其临床转化。论文发表于《Biotechnology Reports》，研究人员通过优化表达体系、创新纯化策略，首次在不依赖复性的条件下获得具有天然活性的hASNase1，并通过计算模拟揭示了其聚集机制，为同类难表达人源酶的制备提供了通用框架。
研究人员采用的关键技术方法包括：将密码子优化的人源溶血磷脂酶N端结构域（1-369位残基）克隆至pET-28a载体，融合N端6×His标签与SUMO标签，分别转化大肠杆菌BL21(DE3) Star、BL21(DE3) Rosetta及ArcticExpress菌株进行表达筛选；通过溶解度评估与尿素梯度增溶实验确定最优裂解缓冲体系；开发三种亲和层析优化方案——L-天冬酰胺孵育亲和层析、ATP介导洗涤亲和层析、L-天冬酰胺预孵育联合ATP洗涤亲和层析；采用纳升液相色谱-质谱联用技术鉴定蛋白组分；通过Nessler法检测酶活性，拟合Hill方程分析变构动力学特征；利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合Western blot解析寡聚体状态；基于300ns分子动力学模拟结构，通过AGGRESCAN3D预测聚集倾向区域。
研究结果如下：
3.1 表达与溶解度评估：BL21(DE3)-Star菌株在28℃与37℃诱导均高产hASNase1，但完全以包涵体形式存在；经含精氨酸、商用裂解试剂的缓冲液处理无法增溶，仅4-8M尿素可实现完全溶解，2M尿素增溶无效。
3.2 大肠杆菌DE3 Rosetta中hASNase1的表达与溶解度：15℃、0.3mM IPTG诱导17小时可获得微量可溶性蛋白，1M尿素可提升溶解度，2M尿素实现完全增溶；但该条件下经固定化金属亲和层析（IMAC）纯化后梯度去除尿素复性，产物无催化活性。
3.3 ArcticExpress系统中的表达：该低温表达菌株未提升溶解度，且总表达量低于前两种菌株，后续未进一步研究。
3.4 hASNase1分离策略：
3.4.1 IMAC纯化：大规模纯化后产物含GroEL、DnaK等分子伴侣污染，储存6个月后发生SUMO标签自切割，质谱证实蛋白结构稳定；
3.4.2 离子交换层析联合IMAC：未能有效富集目标蛋白，反而导致hASNase1大量丢失，剩余条带无活性；
3.4.3 含L-天冬酰胺的IMAC：未能去除GroEL，且标签切除后酶失活；
3.4.4 ATP介导的分子伴侣去除与优化IMAC：单独ATP洗涤可降低污染但目标蛋白回收率仅0.09%；L-天冬酰胺预孵育联合ATP洗涤可将hASNase1相对丰度提升至40.53%，回收率达0.29%，且产物具有酶活性；
3.4.5 非变性PAGE与免疫检测：蛋白在非变性条件下迁移为171-460kDa的高分子量物种，证实存在寡聚体组装。
3.5 hASNase1结构的计算机模拟分析：同源四聚体中催化位点由单体互作形成，变构位点与催化位点邻近；AGGRESCAN3D预测多个正分区域为聚集热点，解释了包涵体形成的结构基础。
讨论部分指出，hASNase1的聚集倾向与分子伴侣强结合是异源生产的核心瓶颈，低温、稀有密码子互补菌株仅能获得微量可溶性蛋白，低浓度尿素增溶后复性失败，可能与四聚体组装要求及动力学陷阱有关。L-天冬酰胺预孵育可能稳定酶构象，减少分子伴侣结合，联合ATP洗涤可有效解离伴侣复合物，该策略成本低、操作简便，优于多步层析。获得的活性hASNase1表现出典型正协同效应，Hill系数为3.9，半饱和浓度S0.5为52.1±2.0mM，最大反应速率Vmax为101.7±4.4U/mg，验证了此前报道的变构调节特性。聚集倾向区域的鉴定为后续蛋白工程改造提供了靶点，该工作建立的纯化框架可推广至其他难表达人源酶的制备。研究结论表明，通过温和诱导结合L-天冬酰胺孵育与ATP洗涤的IMAC策略，可在不依赖复性的条件下获得高活性hASNase1，显著降低分子伴侣污染，为hASNase1的功能研究与临床转化奠定了基础，也为原核表达系统中聚集倾向人源酶的纯化提供了通用方案。
