肉牛饲养场中肉牛微生物群在应用埃普里诺菌素（eprinomectin）和氯四环素（chlortetracycline）处理后的纵向分析

《Canadian Journal of Animal Science》：Longitudinal analysis of bovine microbiota in feedlot cattle following treatment with eprinomectin and chlortetracycline

　　李春莉 | 拉哈特·扎希尔 | 斯蒂芬妮·特里 | 凯文·弗洛特 | 蒂姆·麦克阿利斯特
加拿大农业及农业食品部莱斯布里奇研发中心，莱斯布里奇，AB T1J 4B1

埃普里诺菌素（Eprinomectin）被用于控制牛的寄生虫，但关于其单独使用或与氯四环素（chlortetracycline）等抗菌剂联合使用对牛肠道微生物群的影响的长期研究数据有限。研究人员在试验第0天以及第1、2、4和8周收集了对照组公牛（n = 5）以及接受埃普里诺菌素（LR，第0天，n = 5）、氯四环素（CTC，第0–56天，n = 5）或埃普里诺菌素和氯四环素联合治疗（LR + CTC，n = 5）的动物的瘤胃和粪便样本。从提取的DNA中扩增了16S rRNA基因的V4高变区，并使用Illumina MiSeq进行了测序。瘤胃和粪便样本中的α多样性在所有采样时间和处理组之间保持一致（P > 0.05）。然而，置换多元方差分析显示，埃普里诺菌素和氯四环素联合治疗显著改变了瘤胃微生物群落（P < 0.05），但未影响粪便微生物群。在所有样本中，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）是主要的细菌门类。瘤胃中以普雷沃氏菌（Prevotella）为主，而粪便中则以5-7N15（拟杆菌科）和摇摆螺旋菌（Oscillospira）为主。所有公牛的瘤胃中普雷沃氏菌的相对丰度相似，而粪便中5-7N15和摇摆螺旋菌的相对丰度也相似。这些发现表明，埃普里诺菌素和氯四环素可能改变瘤胃微生物群，但对粪便中主要细菌门类的影响较小。

**引言**
在北美，常规在育肥牛的饲料中添加氯四环素、泰乐菌素（tylosin）和莫能菌素（monensin）等抗菌剂，以预防或治疗细菌性疾病（如酸中毒、肝脓肿）。这些抗菌剂通过提高生产效率和促进牲畜健康而益于农业产业（Brown等人1975年；McEwen和Fedorka-Cray 2002年；Angelakis 2017年）。除了生产效益外，抗菌剂还被认为能够通过减少病原性机会主义细菌的增殖和定植来改变肠道微生物群的组成（Weimer等人2008年；Angelakis 2017年；Bessegatto等人2017年；Brown等人2017年；Thomas等人2017年；Weinroth等人2019年）。然而，饲料中添加抗菌剂对肠道微生物群的影响各不相同。例如，有研究表明，在育肥牛饲料中添加莫能菌素和泰乐菌素会降低瘤胃细菌的多样性和丰富度（Thomas等人2017年），而维吉尼亚霉素（virginiamycin）则改变了粪便细菌的组成（Bessegatto等人2017年）。相反，也有研究发现，当饲料中添加泰乐菌素或泰乐菌素和莫能菌素组合时，粪便细菌的α多样性和β多样性没有变化（Weinroth等人2019年；Ran等人2020年）。然而，在高淀粉饮食的牛中添加莫能菌素时，观察到瘤胃细菌的具体变化，如瘤胃中普雷沃氏菌和其他参与生物氢化的细菌属的丰度下降（Weimer等人2008年）。其他研究则发现，在肉牛饲料中添加莫能菌素和泰乐菌素后，粪便中摇摆螺旋菌的丰度降低，但5-7N15未受影响（Ran等人2020年）。瘤胃和粪便微生物群对抗菌剂的不同反应表明，需要进一步研究这两种群落的组成变化。

除了抗菌剂外，寄生虫控制计划还使用了驱虫剂，这些药物也被证明可以显著改善牛的生长性能和繁殖效率（Genicot等人1991年；Stromberg等人1997年）。然而，许多驱虫剂的广谱活性引发了对其对牲畜胃肠道微生物群潜在影响的担忧。迄今为止，很少有研究报道驱虫剂对肠道微生物群的影响。例如，在羊身上以1毫克/千克体重的剂量使用莫昔克丁（moxidectin）治疗后，0天、35天和77天时并未观察到瘤胃细菌多样性的显著变化（Moon等人2021年）。相比之下，在马身上，莫昔克丁和吡喹酮（praziquantel）降低了粪便样本中的细菌α多样性，但未影响β多样性（Kunz等人2019年）。同样，费班特尔（febantel）、吡喹酮和芬苯达唑（fenbendazole）对健康成年狗的粪便微生物群的细菌α多样性和β多样性或相对丰度没有显著影响（Fujishiro等人2020年）。在放牧的羊身上，使用阿苯达唑（albendazole）和阿巴美菌素（abamectin）治疗后，瘤胃细菌种类变化很小，最显著的影响是古菌（archaea）的变化（Moon等人2021年）。

瘤胃微生物群在饲料消化和宿主整体营养中起着关键作用，但寄生虫、驱虫剂和微生物群之间的相互作用仍研究不足。大多数长效驱虫剂是大环内酯类（macrocyclic lactones），对线虫、节肢动物和某些细菌具有活性。大环内酯类的特点是含有一个大环结构，包括埃普里诺菌素和莫昔克丁等药物。LongRange?（埃普里诺菌素）是一种缓释、长效的驱虫剂，通过皮下注射给药，用于控制体内和体外寄生虫。

在本研究中，我们假设由于其大环内酯类的特性，埃普里诺菌素会导致瘤胃和细菌群落发生变化，这种变化类似于大环内酯类抗菌剂的作用。我们评估了长效埃普里诺菌素与抗菌剂氯四环素在8周内对牛瘤胃和粪便微生物群的影响，旨在更深入地了解这些干预措施如何影响肉牛瘤胃和粪便中的微生物群。

**方法学**
该研究在加拿大农业及农业食品部莱斯布里奇研发中心的个体喂养设施中进行。研究经过机构动物护理委员会（Protocol # 1916 & 1929）的评估和批准，并遵循加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）的指南（2019年）进行。

**研究设计和样本收集**
安格斯牛（Angus steers）从单一农场购买并运输到莱斯布里奇研发中心的育肥场，在试验开始前允许它们适应育肥场环境2周。牛在部分遮盖的围栏中饲养，喂食以大麦青贮饲料为基础的饮食（78%大麦青贮、17%大麦颗粒、5%矿物质补充剂；11%粗蛋白（CP）；39%中性 detergent fiber (NDF)，23% ash-free detergent fiber (ADF)；24%淀粉，基于干物质基础）。该饮食根据NASEM（2016年）的标准配制，以满足生长中的牛的营养需求。每周通过称重饲料残余量来测量围栏内的饲料摄入量。平均体重为160 ± 12公斤的20头肉牛被随机分配到四个处理组，每组5头牛。处理组如下：（1）对照组（CON；无处理），（2）LongRange?（LR；埃普里诺菌素），（3）氯四环素（CTC），（4）LongRange?和氯四环素的组合（LR + CTC）。选定的牛之前未接触过寄生虫药、抗生素或疫苗，也未接受过激素植入。同一处理组的牛被关在同一围栏内，不同处理组之间有空围栏分隔。在治疗前，通过经口胃管获取瘤胃液体样本（n = 20），并从被固定在挤压通道中的牛的直肠收集新鲜粪便样本（n = 20）作为基线对照（第0周）。然后在第0周，LR组和LR + CTC组按每50公斤体重1毫克剂量皮下注射埃普里诺菌素。氯四环素被加入矿物质-维生素补充剂中，使其在总饮食中的浓度达到44 ppm（约264–350毫克/头/天）。在第1、2、4和8周分别收集每头牛的瘤胃和粪便样本（图1）。瘤胃样本在收集瓶中手动翻转多次以混合液体和固体部分，然后转移10毫升至50毫升的Falcon管中，并在4°C下以10,000× g离心15分钟。上清液被丢弃，沉淀物迅速冷冻在液氮中，储存在-80°C直至DNA提取。同样，粪便样本在样本袋中混合1分钟后压平，放入液氮中，储存在-80°C直至DNA提取。

**数据下载**
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**图1. 实验设计和处理流程**
公牛在第0周接受埃普里诺菌素注射（LR），并在8周期间通过饲料接受氯四环素治疗。垂直蓝线表示收集瘤胃和粪便样本的日子。

**从瘤胃和粪便样本中提取宏基因组DNA**
瘤胃样本经冻干、研磨、匀浆后，使用DNeasy PowerSoil?试剂盒（QIAGEN GmbH，QIAGEN）从50毫克瘤胃样本中提取宏基因组DNA，具体步骤按照制造商说明进行。粪便样本的宏基因组DNA提取方法参照Zaheer等人（2018年）的描述。DNA提取后，评估其质量和数量。使用Quant-iT? PicoGreen试剂盒（Thermo Fisher Scientific，加拿大安大略省密西沙加）测量DNA浓度。通过NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测量260/280和260/230的吸光度比值来评估DNA纯度。260/280比值在1.7至2.0之间、260/230比值在2.0至2.2之间的DNA样本被认为适合进一步分析，所有样本均符合这些标准。提取的DNA储存在-80°C直至测序。

16S rRNA基因序列文库的生成采用两步PCR协议。第一步PCR使用通用细菌和古菌引物515-F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806-R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）（Walters等人2016年）扩增16S rRNA基因的V4区域。第二步PCR在每个扩增子的5′端添加一个独特的10 bp条形码，并添加Illumina（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）配对末端（PE）接头序列（各33 bp）。16S rRNA基因扩增子使用Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒（Invitrogen，加拿大安大略省本顿）进行定量，然后以等摩尔比例混合，并使用AMPure XP珠子（Beckman Coulter，加拿大安大略省密西沙加）纯化。16S rRNA基因扩增子的测序使用Illumina NovaSeq 6000 SP PE250平台（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）完成。所有PCR扩增和测序步骤均在魁北克基因组公司（Genome Quebec，加拿大蒙特利尔）进行。

16S rRNA基因序列使用QIIME2（Bolyen等人2019年）和R包DADA2（版本1.40）去噪方法处理。简而言之，原始序列（FASTQ文件）被加载到系统中并去多重化。正向和反向阅读片段分别截断至240 bp长度，低质量和嵌合c序列使用trimmomatic处理，Phred得分低于25的序列被剔除（SLIDINGWINDOW:6:25，MINLEN:50）。阅读片段合并后，使用朴素贝叶斯RDP分类器（Wang等人2007年）和Greengenes参考数据库（McDonald等人2012年）进行分类单元（OTUs）分配，相似度要求为99%。尽管过去使用97%的相似度阈值，但在QIIME2中，V4区域的标准是99%，因为这在物种水平上具有更高的分辨率（Edgar 2018年）。每个样本的OTU数量和Shannon多样性指数使用R语言中的Phyloseq 1.42.0（McMurdie和Holmes 2013年）和vegan 2.6.0（Oksanen等人2016年）计算。使用R包Deseq2（Love等人2014年）比较第1、2、4和8周的瘤胃或粪便样本与第0周的差异，P值调整后的 fold change 为< 0.05。序列数据可在NCBI的BioProject PRJNA1290378下获取。

**统计分析**
使用R v.4.2.2和lme4 v 1.15包中的lmer函数，在每个处理组中分析实验期间的OTU数量和Shannon多样性指数。使用postHoc包v.0.3的Tukey's Honestly Significant Difference进行事后比较。使用vegan软件和置换多元方差分析（PERMANOVA；Adonis函数；10,000次置换）分析每个处理组中采样时间的微生物群结构，评估第1、2、4和8周与第0周之间的治疗差异。基于属水平的差异分类使用GMPR进行调整，并建立层次聚类，聚类距离定义为欧几里得距离和对数fold变化。这导致了44,997,675次阅读（中位数=462,886；范围=285,438–605,957），用于识别59,167个操作分类单元（OTUs），平均每个样本有500个OTUs，分布为CON 5,805个；CTC 5,499个；LR 6,665个；LR + CTC 5,898个独特OTUs。通过OTU丰富度和Shannon多样性指数测量的alpha多样性在四个处理组中随着采样时间的推移没有差异（P > 0.05），表明细菌多样性保持一致（图2a；表S1）。然而，beta多样性分析揭示了微生物群落在处理和时间上的特定差异。与对照组基线（每个处理组的W0）相比，在第4周（R2 = 0.143，P = 0.007）和第8周（R2 = 0.135，P = 0.012）观察到对照组有差异，在CTC组中在第1周（R2 = 0.124，P = 0.036）、第2周（R2 = 0.119，P = 0.049）、第4周（R2 = 0.139，P = 0.007）和第8周（R2 = 0.142，P = 0.008）观察到差异，在LR组中在第1周（R2 = 0.118，P = 0.044）以及在LR + CTC组中在第1周（R2 = 0.120，P = 0.021）和第8周（R2 = 0.123，P = 0.036）也观察到差异。值得注意的是，只有到第8周时，LR组的微生物群落才恢复到与对照组基线相似的状态。下载：下载高分辨率图片（805KB）下载：下载全尺寸图片图2. 在不同处理组中，随着采样时间的推移，瘤胃（a）或粪便（b）中操作分类单元（OTUs）的比较alpha多样性（观察到的和Shannon指数）。对照组（未处理）用绿色表示，CTC组（用氯四环素处理的牛）用蓝色表示，LR组（用依普诺菌素处理的牛）用红色表示，LR + CTC组（用依普诺菌素和氯四环素组合处理的牛）用紫色表示。在瘤胃和粪便的各个组中，alpha多样性在采样时间上相似（P > 0.05）。在所有组和采样时间点，检测到21个细菌门，其中七个门（Firmicutes、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia和Fibrobacteres）占据了大多数。这些优势门占细菌总数的97.3%，其中Firmicutes（49.7%）和Bacteroidetes（33.0%）最为丰富，其次是Euryarchaeota（5.5%）、Proteobacteria（3.2%）、Actinobacteria（2.4%）、Verrucomicrobia（1.8%）和Fibrobacteres（1.8%）（图3a；表S3）。下载：下载高分辨率图片（1MB）下载：下载全尺寸图片图3. 在不同处理组中，随着采样时间的推移，瘤胃（a）或粪便（b）中细菌16S rRNA基因序列的相对丰度。对照组（未处理）用绿色表示，CTC组（用氯四环素处理的牛）用蓝色表示，LR组（用依普诺菌素处理的牛）用红色表示，LR + CTC组（用依普诺菌素和氯四环素组合处理的牛）用紫色表示。所有其他分类的OTUs占比不到总丰度的1%，被标记为其他/未分配的分类单元。在属水平上，Prevotella（40.4%）最为丰富，其次是Ruminococcus（14.8%）、Methanobrevibacter（11.1%）、Fibrobacter（3.9%）、Succinivibrio（3.7%）、Succiniclasticum（2.7%）、Clostridium（2.2%）、Bifidobacterium（1.9%）和Coprococcus（1.6%）。在属水平上的差异分析显示了时间和处理依赖的效应（图4a）。虽然大多数属未受影响，但在对照组中Ruminococcus在第1周减少（P < 0.05），Methanobrevibacter在第4周和第8周增加。同样，Bifidobacterium在对照组中在第1周减少，在CTC和LR + CTC组中在第4周减少，在LR + CTC组中在第8周减少（P < 0.05）。Anaerovibrio的相对丰度在LR组中在第4周和第8周减少，而Bacillus在对照组中在第4周、CTC和LR + CTC组中在第4周增加，在LR组中与基线相比在第4周和第8周增加（P < 0.05）。这些结果表明，某些分类单元在群落中的结构和相对丰度受到了处理的影响，其中LR组的恢复最为显著。下载：下载高分辨率图片（1MB）下载：下载全尺寸图片图4. 在不同处理组中，与第0周相比，瘤胃（a）或粪便（b）中第1周、第2周、第4周和第8周识别的细菌古菌属的平均相对丰度热图。对照组（未处理）用绿色表示，CTC组（用氯四环素处理的牛）用蓝色表示，LR组（用依普诺菌素处理的牛）用红色表示，LR + CTC组（用依普诺菌素和氯四环素组合处理的牛）用紫色表示。粪便中的16S rRNA序列数据使用16S rRNA测序对100个粪便样本进行了微生物群分析，产生了42,054,464个高质量读数（中位数=421,617；范围=298,164–510,133），并识别出49,327个OTUs；平均每个样本有445个OTUs，分布为CON 5,952个；CTC 6,091个；LR 6,173个；LR + CTC 5,720个独特OTUs。通过OTU丰富度和Shannon多样性指数测量的alpha多样性在所有四个组中五个采样时间点保持稳定（P > 0.05），反映了单个样本内细菌多样性的稳定性（图2b；表S2）。beta多样性分析显示，对照组在第4周与第0周（R2 = 0.121，P = 0.008）和第1周（R2 = 0.119，P = 0.022）的群落结构存在差异。在LR + CTC组中，与第1周（R2 = 0.122，P = 0.012）和第2周（R2 = 0.120，P = 0.006）相比，第8周的群落差异显著。这些发现表明，单独使用CTC或LR不会改变基线粪便微生物群落，但当它们联合使用时会有一些差异。粪便微生物群落主要由五个主要门组成，其中Firmicutes（72.3%）和Bacteroidetes（22.1%）最为丰富，其次是Proteobacteria（1.0%）、Spirochaetes（0.8%）和Tenericutes（0.7%）（图3b；表S4）。Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度在各个组和随时间保持一致，Firmicutes的比例在71.4%到72.7%之间，Bacteroidetes的比例在21.5%到22.5%之间。在属水平上，5-7N15（20.1%）和Oscillospira（15.9%）最为丰富，其次是CF231（9.3%）、Ruminococcus（8.8%）、Coprococcus（5.2%）、Roseburia（4.7%）、Treponema（4.4%）、[Clostridium]（1.3%）作为数据库中未解决或废弃的分类单元，以及确认的Clostridium（1.2%）。差异分类学分析表明一些属的丰度发生了变化（图4b）。[Clostridium]在CTC组中在第1周、第4周和第8周与第0周相比减少（P < 0.05）。像SMB53这样的次要属在LR组中也在第2周、第4周和第8周减少（P < 0.05），而Dorea仅在第8周减少。相反，这两个属在对照组中的第2周和第8周增加。Escherichia的相对丰度在CTC组中在第4周和第8周减少，而Anaerovibrio在CTC组中在第2周减少，在LR组中在第1周、第2周和第8周减少。Bifidobacterium的丰度在对照组中在第1周减少，在LR + CTC组中在第8周减少。相比之下，Bacillus的丰度在对照组中在第4周增加，在CTC和LR + CTC组中在第4周和第8周增加，在LR组中与基线相比在第4周和第8周增加（P < 0.05）。这些结果表明，尽管alpha多样性未受影响，但特定属对抗菌剂有反应，特别是在联合治疗中。总共815个OTU来自瘤胃，635个来自粪便。讨论本研究重点评估了驱虫药eprinomectin LongRange?和抗菌剂氯四环素对牛瘤胃和粪便微生物群落的影响。使用像Shannon指数这样的多样性指数来衡量局部群落中的细菌多样性（alpha多样性）。我们的测序结果显示，在第1周、第2周、第4周和第8周，处理组与第0周的对照组相比，无论是瘤胃还是粪便样本，alpha多样性指数都没有差异。这些发现表明，CTC、LR或它们的组合并未影响瘤胃或粪便细菌群落的多样性或丰富度。这与先前的研究结果一致，这些研究发现泰乐菌素、维吉尼亚霉素或泰乐菌素和莫能菌素的组合没有引起粪便alpha多样性的变化（Weinroth等，2019；Ran等，2020）。同样，关于莫昔菌素和芬苯达唑的研究也报告称，它们对放牧绵羊的瘤胃或狗的粪便细菌多样性没有显著影响（Fujishiro等，2020；Moon等，2021）。我们发现，在第4周，LR组的瘤胃微生物群落结构与第1周和第2周相比有显著差异。依普诺菌素在皮下注射后不会表现出单峰浓度曲线，而是被设计为双相的，在注射后70-90天有一个第二个峰（Soll等，2013）。我们的最后一个瘤胃样本是在第56天收集的，由于测量依普诺菌素的血浆水平超出了我们的研究范围，因此不清楚是否是这第二个阶段的早期释放导致了观察到的瘤胃微生物群落的变化。此外，连续喂食CTC长达4周导致瘤胃微生物结构与第0周明显不同，这些差异一直持续到研究结束。这表明持续暴露于氯四环素可以引起瘤胃微生物群落的变化，这一发现与Hungate几十年前的培养观察结果一致（Hungate等，1955）。类似的效果也在放牧绵羊中使用莫昔菌素时观察到（Moon等，2021）。相比之下，CTC和LR均未影响粪便微生物群落结构，这与关于泰乐菌素和莫能菌素在肉牛中的研究以及费班特唑或芬苯达唑在狗中的研究结果一致（Fujishiro等，2020；Ran等，2020）。瘤胃与粪便细菌群落受干扰程度不同的确切原因尚不清楚，但可能是因为瘤胃群落直接暴露于饲料中的抗菌剂。此外，瘤胃群落的基线多样性通常高于粪便群落，因此即使少数分类单元的变化也会对群落结构产生更大的影响。最后，瘤胃微生物群落对饮食变化的敏感性高于后肠群落。这些饮食差异可能解释了为什么对照组在第4周也显示出与第0周相比的差异，这可能反映了即使喂食相同饮食的牛之间细菌群落组成的固有变异性（Welkie等，2010）。尽管所有牛都喂食相同的饮食，并且所有饮食成分在整个实验期间来自同一来源，但不能排除牛之间对成分选择性不同的可能性对细菌群落组成变化的影响。与其他研究（Kim等，2014；Han等，2015；Deusch等，2017；Thomas等，2017；Yu等，2022）一致，Firmicutes和Bacteroidetes是瘤胃内容物和粪便中的主要门。它们的相对丰度在整个研究期间在对照组、CTC组、LR组或LR + CTC组中都相似。这支持了抗寄生虫药和抗生素治疗不会影响主要门相对丰度的发现（Thomas等，2017；Kunz等，2019；Yu等，2022）。如其他研究所述（Durso等，2010；Mao等，2012；Rudi等，2012；Jiao等，2015），微生物群组成的个体差异可能在这一稳定性中起重要作用。在属水平上，Prevotella是瘤胃中最丰富的属，这与它在各种饮食和地理位置收集的样本中作为瘤胃微生物群落主要成员的地位一致（Fernando等，2010；Jami和Mizrahi 2012；Henderson等，2015；Mao等，2015）。同样，在粪便中，CTC、LR或它们的组合也没有影响像5-7N15和Oscillospira这样的主要属。这表明这些微生物群落保持稳定，可能是由于饮食的一致性或这些属的韧性。虽然抗生素在特定条件下（如高淀粉饮食）可以减少某些属的丰度（Weimer等，2008），但在我们的研究中没有观察到这种效应。我们的数据证实，这些属是饲养场牛肠道细菌群落的关键成员，在瘤胃和粪便微生物生态系统中起核心作用（Durso等，2010；Jami和Mizrahi 2012；Kim等，2014）。此外，最近的研究强调了肠道微生物群对抗生素和驱虫药的潜在韧性，先进的测序方法强调了细菌种群的稳定性，即使是在短暂干扰下也是如此（Boisseau等，2023；d'Humieres等，2024；Doolin和Dearing 2024）。总之，尽管CTC、LR及其组合引起了微生物群落结构的短暂变化，但它们对核心微生物群的影响很小。这些发现强调了牛肠道微生物组对药物干预的适应能力，以及在微生物组研究中考虑个体宿主和饮食因素的重要性。

数据可用性：
本研究的所有Illumina测序数据均已作为短读长序列（Short Read Archive, SRA）存入NCBI数据库，生物项目编号为PRJNA1290378。

作者贡献：
概念设计：RZ、KF、TM
数据整理：CL
正式分析：CL、RZF
资金筹集：RZ、KF、TM
研究实施：TM
方法开发：CL、ST
项目管理：TM
资源协调：ST、KF、TM
监督指导：KF、TM

写作：
初稿撰写：CL
审阅与编辑：RZ、ST、KF、TM

补充材料：
补充数据可在线获取，网址为：https://doi.org/10.1139/cjas-2025-0094
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