在三文鱼养殖的影响下，大西洋鲑鱼的eDNA在第一民族领土（布劳顿群岛）内有所增加，但病原体的eDNA并未随之增加

《Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences》：Salmon aquaculture elevates Atlantic salmon eDNA, but not pathogen eDNA across First Nations’ territories in the Broughton Archipelago

　　杰米·格林姆（Jaime Grimm）| 莉娜·舍伍德（Lena Sherwood）| 安德鲁·贝特曼（Andrew Bateman）| 马丁·克科谢克（Martin Krko?ek）

多伦多大学生态与进化生物学系，加拿大安大略省多伦多市威尔科克斯街25号，邮编M5S 3B2

由于气候变化、栖息地破坏和传染病等压力因素，不列颠哥伦比亚省的太平洋鲑鱼捕捞量有所下降。鲑鱼养殖可能会通过放大环境中的鲑鱼病原体而阻碍其恢复。布劳顿群岛曾有大规模的鲑鱼养殖业，但后来在一些原住民倡议的推动下，大多数养殖场被拆除。现在，只有三家养殖场仍位于克利奥海峡（Clio Channel），该地区是马马利利库拉第一民族（Mamalilikulla First Nation，简称MFN）和特洛威蒂斯第一民族（Tlowitsis First Nation）领土重叠的区域。我们与MFN合作，评估了从克利奥海峡流入奈特湾（Knight Inlet）的潮水中是否含有大西洋鲑鱼及几种常见鲑鱼病原体的环境DNA（eDNA）。

**研究结果：**

与奈特湾相比，克利奥海峡中大西洋鲑鱼的eDNA浓度显著更高，但我们并未检测到病原体的eDNA。此外，在距离最近的养殖场5.2公里范围内也检测到了大西洋鲑鱼的eDNA。我们的研究表明，克利奥海峡中的鲑鱼养殖场有可能将病原体释放到奈特湾。

**研究意义：**

该研究突显了在存在不同鲑鱼养殖方式的共享领土内管理鲑鱼健康问题的复杂性。

**引言：**

不列颠哥伦比亚省温哥华岛东北部的布劳顿群岛包含夸克瓦卡瓦克瓦族（Kwakwaka’wakw）的传统未割让领土。由于太平洋鲑鱼在该族的文化、经济和生计中的重要地位，他们自称为“鲑鱼民族”（Mustonen等人，2021年）。然而，自20世纪90年代初以来，不列颠哥伦比亚省沿海地区的太平洋鲑鱼捕捞量持续减少（Price等人，2017年；Connors等人，2024年），这威胁到了食品安全、经济机会以及沿海原住民与鲑鱼之间的关键关系（Nesbitt和Moore，2016年；Carothers等人，2021年；Reid等人，2022年）。太平洋鲑鱼数量减少的原因是多种压力因素的综合作用，包括气候变化、栖息地破坏、过度捕捞和传染病（Noakes等人，2000年；Miller等人，2014年；Connors等人，2020年；Wilson等人，2023年）。鲑鱼养殖是威胁鲑鱼恢复的一个主要原因，因为它可能造成环境污染、逃逸的驯养鲑鱼与野生鲑鱼竞争或杂交，以及传播鲑鱼寄生虫（加拿大政府，2012年）。最近的一系列半结构化访谈中，来自18个拥有鲑鱼河流（弗雷泽河、斯基纳河和纳萨尔河）领土的原住民社区的48位长者认为鲑鱼养殖是对野生鲑鱼的最大威胁（Reid等人，2022年）。

布劳顿群岛沿海水域的大西洋鲑鱼养殖始于1989年（Morton，2021年）。此后，当地渔民注意到该地区野生幼鲑鱼身上的寄生性海虱数量增加（Morton和Williams，2003年；Bocking，2012年；Morton，2021年），这促使人们进行了数十年的研究，探讨驯养鲑鱼与野生鲑鱼之间的寄生虫和病原体传播（包括细菌、病毒、黏孢子虫等，统称为“病原体”或IA，下文简称IA）（Krko?ek等人，2007年；Peacock等人，2013年）。在多年的监测项目中，在养殖鲑鱼样本中发现了34种病原体（Bateman等人，2021年），其中大多数也被证实会感染野生鲑鱼（Krkosek等人，2024年）。其中，Paranucleospora theridion和Tenacibaculum maritimum在太平洋鲑鱼样本中尤为普遍，而Candidatus Sygnamydia salmonis和Piscine orthoreovirus在死亡或即将死亡的鱼类中的检出率也较高（Bateman等人，2021年）。此外，研究表明，在布劳顿群岛的鲑鱼养殖场附近检测到的病原体eDNA的概率是参考地点的2.7至4.3倍（Shea等人，2020年；Bass等人，2024年）。养殖场相关的病原体密度升高不仅限于养殖场周边环境。理论模型和实证数据表明，病毒的传播距离可超过10公里，海虱的传播距离可达30公里（Krko?ek等人，2005年；Foreman等人，2015年）。此外，在距离大西洋鲑鱼养殖场1.6至3.2公里处也能检测到大西洋鲑鱼的eDNA（Shea等人，2022年），这说明了遗传物质在环境中的传播能力。目前关于海洋环境中微小病原体传播能力的实证数据仍然有限，但DNA技术和分子生物学方法有可能填补这一空白。

鲑鱼养殖在不列颠哥伦比亚省沿海地区一直是一个有争议的环境问题，环保人士及“Namgis、Mamalilikulla和Musgamagw Dzawada'enuxw”原住民团体一直抗议该产业在其领土内的运营（Bocking，2012年；Morton，2021年）。2018年，不列颠哥伦比亚省政府同意在未经这三个原住民同意的情况下，不续签他们在这些地区的鲑鱼养殖许可（不列颠哥伦比亚省政府，2018年）。2019年，这三个原住民与在其领土内运营的鲑鱼养殖公司达成协议，共同监督养殖场的监测和管理，并决定该产业是否继续在其领土内运营（布劳顿养殖转型计划，Godwin等人，2022年；不列颠哥伦比亚省政府，2023年）。最终，截至2023年，这些原住民地区的养殖场在许可证到期后全部被关闭。然而，沿海原住民对鲑鱼养殖业的支持程度各不相同（Schreiber，2006年）。在布劳顿群岛南部，仍有三家养殖场在与特洛威蒂斯第一民族合作的模式下继续运营，该地区是两族领土重叠的区域。这种持续的养殖生产情况体现了管辖权重叠（包括原住民和非原住民机构）以及管理方式差异时原住民主权的复杂性。

继续进行鲑鱼养殖的区域与奈特湾相邻，并通过潮汐相连，而奈特湾的管辖权属于马马利利库拉第一民族。奈特湾是一个以淡水补给的峡湾，是幼年粉红鲑鱼和狗鲑鱼从格伦代尔河（Glendale River）洄游的重要通道——这是该地区粉红鲑鱼的主要来源地（Krko?ek等人，2005年；Beamish等人，2011年）。除了鲑鱼，奈特湾还具有丰富的生物多样性和文化价值。2021年，马马利利库拉第一民族将奈特湾的Gwaxdlala/Nalaxdlala（拉尔湾/Hoeya海峡）地区宣布为海洋避难所和原住民保护及保育区（Mamalilikulla First Nation IPCA）。由于靠近鲑鱼养殖场，马马利利库拉第一民族的代表们担心养殖场产生的病原体是否会扩散到奈特湾。为了解决这个问题，我们与马马利利库拉第一民族合作，研究了在克利奥海峡入口（特洛威蒂斯和马马利利库拉领土重叠区域）和奈特湾（马马利利库拉领土）检测到大西洋鲑鱼及各种病原体eDNA的可能性（图1）。我们假设如果克利奥海峡的养殖场是环境中病原体的来源，那么在克利奥海峡入口处（潮水流入方向）检测到的病原体eDNA浓度应该会比奈特湾其他地方更高。

**图表说明：**

- 图1. 研究区域、采样点和活跃的大西洋鲑鱼养殖场地图。数据来源：Esri Canada、Esri、TomTom、Garmin、SafeGraph、METI/USGS、EPA、USDA、NRCan、Parks Canada。坐标系统：WGS 1984 Web Mercator。

**方法：**

**2.1. 与马马利利库拉第一民族的合作方式：**

本研究的主要作者（MK和AB）在马马利利库拉第一民族领土及其邻近地区进行了超过二十年的研究，并在此期间与该民族建立了合作关系。布劳顿养殖转型计划（Broughton Aquaculture Transition Initiative，简称BATI）的一部分工作涉及在大多数养殖场关闭期间合作监测鲑鱼病原体的eDNA。这种持续的监测工作，加上作者团队在eDNA技术方面的专业知识以及通过BATI项目的合作，促使一位当选的马马利利库拉第一民族议员（Brad Puglas）向MK提出了这个研究项目。马马利利库拉第一民族参与了项目的构思，在整个研究过程中定期收到更新，并在提交手稿前审阅了初稿。野外研究、实验室分析、统计分析和手稿撰写均由作者团队完成。BP选择在手稿的致谢部分提及自己的贡献，而非作为共同作者列出。

在这项合作项目中，各方均未讨论签订正式的研究协议。我们是通过开放沟通和共享研究成果来开展工作的。所有各方一致同意该项目生成的数据应公开获取，并可在线获取：https://github.com/JaimeGrimm/clio。

**2.2. 研究区域：**

我们在不列颠哥伦比亚省温哥华岛东北部的马马利利库拉领土内的奈特湾低处收集数据（图1）。截至2024年夏季，克利奥海峡内有三家鲑鱼养殖场，这些养殖场的管辖权属于特洛威蒂斯第一民族和马马利利库拉第一民族。采样时，其中两个养殖场饲养了大西洋鲑鱼，第三个养殖场处于非运营状态。奈特湾的当前水流方向是朝向开阔海域（向西；Foreman等人，2015年），在涨潮期间，水流主要从克利奥海峡流入奈特湾（B. Proctor，个人交流并现场验证）。

**2.3. 样本采集与过滤：**

2024年6月8日和9日，我们在克利奥海峡入口（n=12个采样点）和奈特湾其他地点（n=12个采样点）同时采集了24个海水样本（图1）。为了确保采样只在马马利利库拉第一民族的领土范围内进行，我们没有在克利奥海峡的养殖场附近采集样本。每天我们在退潮时开始采样，并持续到涨潮时，此时水流主要从克利奥海峡流入奈特湾（图1）。我们交替在两个区域采集样本；然而，下午中后期通常会有强风进入奈特湾，导致采样条件复杂。因此，我们优先在上午进行采样。在每个采样点，我们使用Yellow Springs Instruments的多参数探针（YSI）测量了2米深度的海水温度和盐度，并用Secchi盘（Holmes，1970年）测量了浊度。

我们从2米深度抽取了15升海水，并通过三个空心膜过滤器（RKS Labs；Bass等人，2024年；Deeg等人，2025年）同时过滤海水，每个过滤器处理5升水，过滤孔径范围为0.1–0.45微米（完整过滤方案见补充材料1）。除了海水样本，我们还在每天采样前后各采集了5升蒸馏水作为对照样本。开始采样前对过滤设备进行了消毒（见补充材料1），结束采样后再次消毒设备以评估样本间的DNA交叉污染。过滤后，所有过滤器都用RNAlater（ThermoFisher Scientific，目录号#AM7021）处理以保存核酸，在采集后的24小时内储存于室温，之后在-20°C下保存直至实验室提取DNA。

**2.4. 目标物种及eDNA提取与量化：**

我们评估了两个区域中大西洋鲑鱼以及病原体Tenacibaculum maritimum、Tenacibaculum finnmarkense、Piscirickettsia salmonis、Candidatus Sygnamydia salmonis和Erythrocytic Necrosis Virus（ENV）的浓度。选择这些目标物种是因为它们在先前研究中经常出现在eDNA样本中（Krkosek等人，2024年；Bass等人，2024年），并且对养殖和野生鲑鱼的生长、健康和存活有显著影响（例如，Nylund等人，2015年；Sm?ge等人，2016年；Pagowski等人，2019年；Bateman等人，2022年；Wassmuth等人，2024年）。

我们使用PureLink Viral RNA/DNA mini试剂盒（ThermoFisher Scientific，目录号#12280050；补充材料2）中的改良协议提取核酸，并在提取过程中包括空过滤器作为空白对照。提取的核酸保存在-80°C下直至量化。我们使用QuantStudio 3实时PCR系统来量化目标物种的eDNA浓度。该系统依赖于使用特定物种的引物和探针组合（补充材料3），这些引物和探针能够靶向并扩增过滤海水中现有的DNA，并且对于每个DNA拷贝，会释放出荧光标记物，这些标记物通过PCR系统进行量化。我们在每个反应孔中进行了三次多重检测（详见补充材料2中的反应方案），并且每种样本和检测组合都重复了三次（总共504种样本/检测组合）。我们重复进行了每次PCR反应，以减少由于IA（感染性Agents）罕见或含量低而可能产生的假阴性结果。对于每个目标物种，我们创建了已知DNA浓度的系列稀释液来制作标准曲线，这些标准曲线用于将QuantStudio 3系统报告的数据（阈值循环——PCR中目标的相对浓度）转换为初始样本中的基因拷贝数。我们手动筛选了扩增曲线，将低于QuantStudio 3设计和分析软件自动阈值的曲线设置为零。对于超出扩增阈值的非典型扩增曲线，我们进行了标记并从后续分析中移除了它们（ThermoFisher 2024；详见补充材料3中的示例，图S3.1）。

为了量化Knight Inlet和Clio Channel之间目标物种DNA浓度的差异，我们使用了障碍模型（hurdle models），这种模型在数据集中存在大量零值时非常有用。该模型结合了两个部分——一个用于模拟零数据，另一个用于模拟非零数据——来预测eDNA浓度（Dalrymple等人，2003年）。在这里，我们使用Gamma障碍模型来描述观察到的eDNA浓度，该模型假设零数据来自于Bernoulli分布，并使用logit链接函数；而非零数据则来自于Gamma分布，并使用log链接函数。我们采用了两种建模方法来进行分析：（1）针对每个物种单独拟合一系列广义线性混合效应模型（GLMMs）；（2）一个层次模型，将目标物种视为随机效应的层次之一（即，假设不同物种之间的观察模式差异可以被建模）。在这两种建模方法中，我们都包含了一个独特的样本标识符作为随机截距，以解释由于重复PCR检测而产生的DNA浓度估计的非独立性。

对于特定物种的障碍模型，我们定义yi为观察到的DNA浓度，λi为障碍概率，μi和?分别为Gamma分布的均值和形状参数。eDNA浓度的似然值为：
$$P(yi\mid\mu_i, \phi, \lambda_i) = \left\{
\begin{array}{ll}
\lambda_i \cdot f_{\Gamma}(yi\mid\mu_i, \phi) & \text{如果 } yi = 0 \\
1 & \text{如果 } yi \neq 0
\end{array}
$$
其中Gamma密度由下式给出：
$$f_{\Gamma}(yi\mid\mu_i, \phi) = \left(\frac{\phi}{\mu}\right)^{\phi\Gamma(\phi)y^{\phi-1} \exp\left(-\phi y^{\mu_i}
$$
链接转换后的均值和障碍概率参数分别用以下线性方程建模：
$$
\logit(\lambda_i) = \alpha(0) + \alpha(1) \cdot x_{area}[i] + u_{samp}[i] \\
\log(\mu_i) = \beta(0) + \beta(1) \cdot x_{area}[i] + \nu_{samp}[i]
$$
其中α(0)和α(1)表示障碍概率的截距和面积系数，β(0)和β(1)表示均值概率的截距和面积系数，x_area编码采样面积，u Samp和νsamp表示特定于样本的随机效应截距。

对于层次障碍模型，我们使用相同的Gamma障碍模型来描述eDNA浓度，似然值如（1）所示，并添加了前一样本中eDNA浓度的固定效应系数a(2)和β(2)，以及按目标物种分组的随机效应截距usp(0)和vsp(0)，以及按目标物种分组的随机效应斜率usp(1)和vsp(1)。

初步分析表明，测量的环境变量对目标物种的eDNA浓度没有影响（补充材料4）。简而言之，环境变量与面积（即Knight Inlet或Clio Channel的入口）没有强烈相关性（相关系数：温度：-0.34，塞氏透明度（Secchi depth）：0.20，盐度：0.17），并且它们的值范围并不具有高度生物学相关性（温度：9.7–11.8°C，塞氏透明度：2.0–3.5米，盐度：27.1–29.2 ppt）。由于我们的样本量较小，为了避免过度参数化，我们将环境变量从模型中排除。

层次GLMM模型包括了面积的固定效应以及前一样本中的平均DNA浓度（计算方法为所有PCR重复实验估计值的平均值）。这一项模型考虑了从一个样本到下一个样本的潜在相关性，解释了DNA可能从前一个样本通过我们的过滤装置物理携带的可能性。由于采样设备在每个采样日结束时用漂白剂进行消毒，我们假设没有之前的DNA会携带到当天的第一个采样点，并将这一项手动设置为每个样本的零（进行了负场对照实验来验证这一假设；见图1）。模型包括了一个随目标物种分组的面积的随机截距和斜率。

对于特定物种的障碍模型，我们定义yi为观察到的DNA浓度，λi为障碍概率，μi和?分别为Gamma分布的均值和形状参数。eDNA浓度的似然值为：
$$P(yi\mid\mu_i, \phi, \lambda_i) = \left\{
\begin{array}{ll}
\lambda_i \cdot f_{\Gamma}(yi\mid\mu_i, \phi) & \text{如果 } yi = 0 \\
1 & \text{如果 } yi \neq 0
\end{array}
$$
其中伽马密度由下式给出：
$$f_{\Gamma}(yi\mid\mu_i, \phi) = \left(\frac{\phi}{\mu}\right)^{\phi\Gamma(\phi)y^{\phi-1} \exp\left(-\phi y^{\mu_i}
$$
链接转换后的均值和障碍概率参数用以下线性方程建模：
$$
\logit(\lambda_i) = \alpha(0) + \alpha(1) \cdot x_{area}[i] + u_{samp}[i] \\
\log(\mu_i) = \beta(0) + \beta(1) \cdot x_{area}[i] + \nu_{samp}[i]
$$
其中α(0)和α(1)代表障碍概率的截距和面积系数，β(0)和β(1)代表均值概率的截距和面积系数，x_area编码采样面积，u_samp和ν_samp代表特定于样本的随机效应截距。

对于层次障碍模型，我们使用相同的Gamma障碍模型来描述eDNA浓度，并添加了前一样本中eDNA浓度的固定效应系数a(2)和β(2)，以及按目标物种分组的随机效应截距usp(0)和vsp(0)，以及按样本面积分组的随机效应斜率usp(1)和vsp(1)。

现在，障碍和均值模型分别为：
$$
\logit(\lambda_i) = \alpha(0) + (a(1) + usp[i](1)) \cdot x_{area}[i] + \alpha(2) \cdot x_{prev}[i] + usp[i](o) + usamp[i] \\
\log(\mu_i) = \beta(0) + (\beta(1) + \nu_sp[i](1)) \cdot x_{area}[i] + \beta(2) \cdot x_{prev}[i] + \nu_sp[i]
$$

初步分析表明，所测量的环境变量对目标物种的eDNA浓度没有影响（补充材料4）。简而言之，环境变量与面积（即Knight Inlet或Clio Channel的入口）没有强烈相关性（相关系数：温度：-0.34，塞氏透明度：0.20，盐度：0.17），并且它们的值范围并不具有高度生物学相关性（温度：9.7–11.8°C，塞氏透明度：2.0–3.5米，盐度：27.1–29.2 ppt）。为了避免过度参数化，我们将环境变量从模型中排除。

层次GLMM模型包括了面积的固定效应以及前一样本中的平均DNA浓度（计算方法为所有PCR重复实验估计值的平均值）。这一项模型考虑了一个样本到下一个样本的潜在相关性，解释了DNA从前一个样本通过我们的过滤装置物理携带的可能性。由于采样设备在每个采样日结束时用漂白剂进行消毒，我们假设没有之前的DNA会携带到当天的第一个采样点，并将这一项手动设置为每个样本的零（进行了负场对照实验来验证这一假设；见图1）。模型包括了一个随目标物种分组的面积的随机截距和斜率。结果是一个估计了15个参数的模型，见表1。单个物种的GLMM只包括了面积的固定效应（包括障碍和均值组件），每个目标物种估计了7个参数，见表1。

所有模型拟合都是在贝叶斯框架中使用的，使用了R语言中的brms（基于Stan的贝叶斯回归模型；Bürkner 2017）包（版本4.2.1；R Core Team 2022）。我们使用6条链和4000次迭代进行了每个模型的拟合，在2000次迭代的热身期后，对所有固定效应使用了弱的正态分布先验，对所有其他效应使用了默认的先验（表1）。

我们在至少一个样本中检测到了所有目标物种。Tenacibaculum maritimum和T. finnmarkense的检出率较低（分别为7.0%和22.5%；见图2）。其余的目标物种在qPCR检测中的检出率很高（58.3%–100%；见图2），Cand. S. salmonis和Piscirickettsia salmonis在每个反应中都呈阳性检测结果。

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图2. Clio Channel和Knight Inlet中每个目标物种的eDNA浓度。彩色点代表每个区域中原始扩增的DNA拷贝数（拷贝/μL）；由于排除了非典型扩增结果，样本大小有所不同（见方法部分）。黑色点是使用广义线性混合效应模型估计的平均预期eDNA浓度，误差条表示95%的可信区间。

3.1. 特定物种的障碍模型
在所有目标物种中，只有大西洋鲑鱼的DNA浓度在Clio Channel中高于Knight Inlet（平均值分别为每微升海水50.1拷贝和0.77拷贝；见图2）。对于所有其他目标物种，我们没有检测到两个区域之间的差异。

3.2. 层次障碍模型
总体而言，在Clio Channel中检测到目标物种DNA的概率是Knight Inlet的1.96倍（95%可信区间：0.44–5.97倍；见图3）。模型的障碍部分（用于模拟数据中的零值）预测，平均而言，目标物种的DNA在Clio Channel中的样本中有28.6%（1.3%–84.1%）不存在，在Knight Inlet中的样本中有38.3%（2.8%–88.5%）不存在（见图4）。Clio Channel中的大西洋鲑鱼eDNA浓度是Knight Inlet的11.2倍（95%可信区间：2.5–40.7；见图5）。其他所有目标物种的后验估计与两个区域之间的1:1比例一致（见图5）。前一样本的eDNA浓度对后续样本的eDNA浓度没有显著影响，表明前一样本中的高浓度并不会系统性地导致后续样本中的高浓度（见图6）。

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图3. Clio Channel与Knight Inlet中所有物种的eDNA检测相对概率的后验分布（包括均值和障碍部分）。虚线代表1:1的比例，分布右侧的大部分表示在Clio Channel中检测到目标物种eDNA的概率更高。点是平均值，水平线表示66%和95%的可信区间。来自层次广义线性混合效应模型的后验估计。

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图4. Knight Inlet和Clio Channel中未检测到eDNA的概率的障碍后验分布。点是平均值，水平线表示66%和95%的可信区间。来自层次广义线性混合效应模型的估计。

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图5. Clio Channel与Knight Inlet中预期eDNA浓度比的95%可信区间（Clio Channel为分子）。我们绘制了95%的可信区间以便于可视化，因为某些物种的尾部较长，比率超过了4000:1。大西洋鲑鱼eDNA的最大估计比率为782.6:1。虚线代表1:1的比例。

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图6. 来自层次广义线性混合效应模型的条件响应，显示了预期eDNA浓度与前一样本中的eDNA浓度之间的关系。在保持所有其他模型预测因子（面积、样本ID和目标物种）在其均值或参考水平的情况下，评估了预期eDNA浓度。阴影区域表示95%的可信区间。

3.3. 模型收敛性
层次模型和大多数特定物种模型的诊断工具表明收敛性良好：所有固定效应和随机效应的R?值均为1.00，迹线图显示了良好的混合情况，表明模型收敛到了相同的后验分布。T. maritimum和T. finnmarkense的特定物种障碍模型的混合情况较差（分别有884和12次分歧），但最大R?值为1.01，表明链收敛到了可靠的模型估计。

3.4. 污染
在504个实验样本的PCR检测中（不包括对照和空白样本），有两个样本显示了非典型的扩增图谱，并被从后续分析中移除。在野外采样的第一天，当天的开始对照样本中含有Cand. S. salmonis和Piscirickettsia salmonis的微量DNA，而在第二天，当天的开始对照样本中含有T. maritimum的DNA。结束时的对照样本在第1天扩增出了Cand. S. salmonis、T. finnmarkense、Piscirickettsia salmonis和大西洋鲑鱼的DNA，在第2天扩增出了Cand. S. salmonis、Piscirickettsia salmonis、T. maritimum和Paranucleospora theridion的DNA。污染可能发生在从敞开的船甲板上收集野外对照样本时海水溅到设备上。提取空白样本中的一个和两个显示了Piscirickettsia salmonis（两个空白样本）和Cand. S. salmonis（一个空白样本）的实验室污染。三个qPCR空白样本中的一个扩增出了Piscirickettsia salmonis，再次表明了实验室污染（见图7）。

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图7. 野外和实验室对照样本中的污染（彩色点）与海水中eDNA浓度分布（灰色点）的关系。

4. 讨论
我们试图确定大西洋鲑鱼和IA（感染性Agents）的eDNA浓度在Clio Channel是否比Knight Inlet更高。我们的结果显示，Clio Channel中的大西洋鲑鱼eDNA浓度高于Knight Inlet，但目标感染性Agents（T. maritimum、T. finnmarkense、Piscirickettsia salmonis、Candidatus Syngnamydia salmonis和ENV）的eDNA浓度没有差异。因此，在当时和采样距离农场的情况下，没有证据表明农场中的IA发生了扩增。

尽管Knight Inlet中的大西洋鲑鱼eDNA浓度较低，但检测到其存在提供了证据，表明eDNA可能从鲑鱼养殖场扩散而来。在Knight Inlet中收集的样本中，有33%（12/36）的PCR检测结果中发现了大西洋鲑鱼的eDNA，这些样本距离最近的活跃鲑鱼养殖场最远达5.2公里。鉴于不列颠哥伦比亚省沿海地区没有已建立的大西洋鲑鱼种群（Andres 2015），在Knight Inlet中检测到的大西洋鲑鱼eDNA几乎可以肯定来自Clio Channel中的鲑鱼养殖场，可能是通过笼养鱼类的生物物质扩散或从养殖场逃逸的鲑鱼迁移而来的。重要的是，在Knight Inlet中检测到大西洋鲑鱼的eDNA本身并不表明对同域的太平洋鲑鱼存在生态风险。相反，这提供了实证证据，表明来自养殖场的生物物质可以扩散到相邻的海洋环境中。虽然我们在采样时没有检测到高水平的感染性Agents的eDNA，但在距离最近活跃养殖场5.2公里处检测到大西洋鲑鱼的eDNA，表明养殖相关IA可以通过不同的养殖场健康或放养条件在辖区之间传播。因此，大西洋鲑鱼的eDNA可以作为评估养殖场与邻近水域之间环境连通性的有用代理指标，这对评估野生鱼类群体的潜在暴露风险具有重要意义。鲑鱼eDNA在其源头几公里外的扩散也与先前的研究结果一致。在之前的研究中，大西洋鲑鱼eDNA的95%扩散概率范围是从源头向上游1.6公里到下游3.2公里（采样深度为2米；Shea等人，2022年），并且一直能够检测到距离最近源头5公里范围内的eDNA（棕鳟鱼：Deutschmann等人，2019年；大西洋鲑鱼：Shea等人，2022年）。尽管在我们的研究中，各种病原体（IA）在海洋区域的检测频率相似，但在Broughton群岛的先前调查显示，它们在活跃的鲑鱼养殖场附近更为常见（Shea等人，2020年；Bass等人，2024年）。这些研究发现，ENV、Cand. S. salmonis、Piscirickettsia salmonis和Paranucleospora theridion在活跃和非活跃养殖场都有存在，这与我们的发现一致，但它们与水产养殖之间的关联强度有所不同（Shea等人，2020年；Bass等人，2024年）。Tenacibaculum maritimum和T. finnmarkense与活跃养殖场之间存在强正相关，其中T. maritimum的流行率具有年际变化。这种变异性突显了病原体在野生和养殖鱼类种群中存在的偶发性质（Bakke和Harris，1998年；Reno，1998年；Lafferty和Harvell，2013年）。与跨越多个季节和年份的先前调查不同，我们的研究仅在短时间内进行，因此只能提供一个关于养殖场潜在eDNA扩散的“快照”。因此，我们可能没有发现病原体与水产养殖之间的显著关联，这是因为在采样时没有发生活跃的疾病爆发。也有可能来自养殖场的病原体eDNA在采样地点已经降解到背景浓度。

eDNA在环境中的扩散和命运，从而影响其检测，还取决于许多环境和生理因素。虽然我们的研究中没有发现环境变量的显著影响——可能部分是由于我们测量的条件相对稳定——但eDNA的传输（例如通过洋流）和在环境中的持久性受到温度、紫外线、pH值以及影响降解速率的微生物活动的影响（Strickler等人，2015年；Lance等人，2017年；Kagzi等人，2022年）。此外，不同形式的eDNA（即细胞内的DNA，包括微生物中的DNA，以及从生物体排泄物或细胞裂解中释放的细胞外DNA；Barnes和Turner，2016年；Cristescu和Hebert，2018年；Nagler等人，2018年）在抵抗环境压力方面的能力不同，因此在环境中的可检测性也不同。较短的DNA片段、膜结合的DNA以及存在于生物膜中或吸附在表面的DNA比长片段和自由漂浮的DNA更持久，传播距离也更远（Nagler等人，2018年；Joseph等人，2022年；Kitrane等人，2024年）。在我们的分析中，我们没有区分细胞内和细胞外的DNA，也无法量化代表活生物量的eDNA的数量或种类。因此，我们无法确定我们检测到的是具有感染性的病原体还是非感染性的病原体；然而，对病原体eDNA的回顾表明，大多数检测到的可能是具有感染性的病原体，因为环境中病原体DNA的相对稀少以及细胞外DNA的快速降解（Bass等人，2023年）。此外，对鱼类病毒的回顾发现，大多数病毒在宿主外仍可存活数天或数周（Oidtmann等人，2018年）。

在我们的对照样本中，我们观察到大多数目标物种存在低水平的污染或假阳性检测（图7）。在野外研究中，维持无菌条件是一个固有的挑战（例如，Bass等人，2024年）。为了预见这一风险，我们设计了在多个地点（例如Clio Channel和Knight Inlet）之间交替采样的方法，以尽量减少污染对地区间比较的干扰。从统计上讲，我们通过检测收集的序列的自相关性来评估样本之间的污染可能性（即一个样本中的eDNA浓度是否与之前的样本相关），并未发现显著影响。这一结果表明，污染不太可能影响Knight Inlet和Clio Channel之间的比较。

4.1. 管理挑战和基于地方数据的需求

管理渔业和海洋疾病具有挑战性，特别是在利益相关者和权利持有者之间存在重叠的管理主张和不同价值观的情况下，这会引发持续的紧张关系。这些紧张关系可能导致用户群体内部和之间的冲突（例如，东南亚的小规模渔民与工业渔民；Pomeroy等人，2007年）以及不同治理层级之间的冲突（例如，加拿大的原住民和联邦机构；Harper等人，2018年）。鲑鱼的迁徙生活史以及病原体在环境中的无物理屏障扩散特性进一步加剧了这些挑战，这促进了鱼类和病原体跨越辖区的移动——包括在原住民领地与定居者治理体系之间的移动。在这里，我们展示了来自鲑鱼养殖场的eDNA可能扩散到邻近原住民领地的潜力，突显了管理对野生鲑鱼潜在影响的挑战，这些影响超越了政治边界。虽然中央集权治理（例如加拿大渔业和海洋部）可以提供一定程度的协调，但更加协作、基于地区的方法，特别是赋予权利持有者（尤其是原住民）权力，可能会更有效地减少冲突并支持可持续管理（Pomeroy等人，2007年；Murray和Gubbins，2016年；Krko?ek，2017年；Samsing等人，2017年）。有效的协作管理依赖于权利持有者和用户群体能够及时获取可靠的数据以支持决策。在不列颠哥伦比亚省，鲑鱼养殖场被要求监测并报告养殖鱼类上的海虱数量，并在海虱数量超过规定阈值时采取缓解措施（例如，2025年每条鱼2.8个活动Lepeophtheirus salmonis；加拿大政府，2024年）。尽管这些海虱数据是公开共享的，但可能存在报告不足的情况，从而限制了其可靠性（Godwin等人，2021年）。相比之下，除非导致死亡事件（例如，在24小时内损失1%的鱼类或在5天内损失2.5%的鱼类；加拿大政府，2024年），否则水产养殖经营者没有定期监测或报告其他病原体的存在的要求。即使在这种情况下，报告也可能延迟：关于死亡事件及其可能原因的数据可能要在事件发生几个月后才能公开。例如，截至2025年5月3日，最新的公开死亡数据库更新日期是2025年2月11日（加拿大渔业和海洋部，无日期）。此外，如果来自养殖场的病原体没有导致养殖鱼类患病，它们可能会被忽视或未被报告。这些监测空白加上数据获取的延迟，削弱了原住民权利持有者做出知情、及时决策的能力，以保护野生鱼类种群并履行他们的治理责任，这也反映了原住民在依赖行业或联邦生成的监测数据来决策其领地内水产养殖影响方面的更广泛挑战。

环境DNA是一种新兴工具，可以促进社区主导的监测，并减少对外部数据的依赖。收集eDNA样本不需要进入水产养殖设施，可以使用便携式过滤工具在现场进行，而且相对于许多传统的野外采样方法来说成本相对较低。通过适当的培训（例如，由我们的作者团队提供的培训），eDNA采样可以加入到社区渔业技术人员或保护计划正在实施的现有监测项目中，并与学术或独立实验室合作进行处理。社区主导的eDNA监测计划可以生成与收获时期、迁徙事件或观察到的环境变化相一致的地方相关数据。这样的方法将支持更及时的基于地方的决策，并减少对延迟或外部生成的报告的依赖。这些合作关系将通过生成关于病原体流行率、多样性和空间模式的数据来增强现有的监测项目，这对生态系统和生物体的健康具有重要意义，也可能支持原住民行使他们的原住民研究主权。

越来越多的人认识到，以地方为导向的研究可以为资源管理提供宝贵的见解，并弥合知识生成与行动之间的差距（Cooke等人，2021年）。我们的研究就是一个例子，它对野生鲑鱼的管理具有启示意义——这是一种原住民和定居者共同拥有的资源。我们发现，来自鲑鱼养殖场的大西洋鲑鱼eDNA可以扩散到距离源头5公里以外的Mamalilikulla领地。尽管在采样时没有检测到感染性病原体的eDNA，但在领海内检测到来自养殖场的宿主eDNA表明，与水产养殖相关的生物物质可以通过辖区边界进行移动。我们的研究仅提供了一个时间点上环境中的病原体分布的快照，纵向研究将提供有关病原体分布如何随季节变化、养殖鲑鱼数量规模变化以及健康状况变化的额外见解。此外，更详细的空间采样设计可能会阐明病原体向邻近领地扩散的潜力，以及野生和养殖宿主对病原体社区的相对贡献。

该项目的数据和代码可在以下网址获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.19117099

作者贡献：
概念化：JG、AB、MK
数据管理：JG
正式分析：JG
调查：JG、LS
方法论：JG、LS、AB、MK
项目管理：MK
资源：MK
监督：AB、MK
验证：JG
可视化：JG
初稿撰写：JG
审稿与编辑：JG、LS、AB、MK

资金信息：
这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）研究生奖学金（JG）、多伦多大学FAST奖学金（JG）、NSERC Discovery Grant（项目编号RGPIN-2024-05054）（MK）以及加拿大研究主席职位（MK）的支持。

补充材料：
补充数据可在以下网址获取：https://doi.org/10.1139/cjfas-2025-0243
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