观察到男性附睾精子DNA片段化具有高度变异性

《Canadian Journal of Urology》：Observations of high variability in DNA fragmentation of epididymal sperm in men

　　马尼什·库查库拉（Manish Kuchakulla）| 赫里迪·P·班姆布瓦尼（Hriday P. Bhambhvani）| 罗伯特·菲施（Robert Fisch）| 马荣卓（Runzhuo Ma）| 乔纳森·加尔（Jonathan Gal）| 马克·戈德斯坦（Marc Goldstein）
美国纽约州纽约市纽约长老会医院泌尿科，邮编10021

**研究目的**
患有梗阻性无精子症（OA）或不孕症的男性通常需要进行手术取精以用于辅助生殖技术。虽然可以从睾丸或附睾成功获取精子，但不同取精部位的精子DNA完整性可能存在差异，这可能会影响生殖结果。本研究旨在确定对于患有OA或不孕症且DNA片段化指数（DFI）升高的男性，是否需要进行双侧附睾和/或睾丸取精。

**研究方法**
我们回顾性地分析了2020年至2022年间由同一位外科医生实施双侧睾丸活检和/或显微附睾精子抽吸（MESA）的男性患者。通过TUNEL检测方法评估DFI（正常值≤15%）。研究的主要目的是评估在取精过程中左右睾丸/附睾之间DFI的差异。

**研究结果**
共有24名患者符合纳入标准，他们接受了MESA和/或睾丸活检并进行了DFI分析。在患有OA的患者中，睾丸精子的DFI显著低于附睾精子（右侧睾丸9.52 vs 右侧附睾17.61，p = 0.01；左侧睾丸9.22 vs 左侧附睾14.71，p = 0.04）。对于每位OA患者而言，左右附睾精子之间的DFI差异显著大于左右睾丸精子之间的DFI差异（分别为12.09% ± 6.58 vs 2.27% ± 1.59，p < 0.001）。

**结论**
鉴于附睾内部DFI的个体差异，对于患有OA的男性来说，双侧附睾取精可能是必要的。相反，由于从两侧睾丸获取的精子DFI差异不显著，双侧睾丸取精可能并非必需。

**引言**
不孕症影响大约15%的夫妇，其中男性因素导致的不孕症占近一半。1–3 梗阻性无精子症（OA）约占无精子症病例的40%。4,5 在不适合进行重建的OA病例中，可以通过手术取精用于辅助生殖技术（ART），特别是体外受精（IVF）和胞浆内单精子注射（ICSI）。6–8 使用显微附睾精子抽吸（MESA）时，精子获取率接近100%，MESA-ICSI后的活产率接近40%。9–11 除了OA外，精子质量问题也可能导致不孕，包括升高的精子DNA片段化指数（DFI），这与较低的受精率和活产率相关。12,13 在这种情况下，可以选择睾丸精子提取，因为睾丸精子的DFI通常低于射精精子，可能有助于改善ART结果。14 影响生育结果的关键因素是精子的DNA完整性，因为高水平的精子DNA片段化与胚胎质量较差、着床率降低和流产率增加有关。15–18 尽管关于IVF/ICSI环境下DNA片段化对生育结果的具体影响仍有争议，但多项研究表明高DNA片段化与不良生育结果相关。17,19–22 精子通过男性生殖道时会受到氧化应激的影响，从而导致DNA片段化增加。23–27 研究表明，在射精精子DFI升高的不孕男性中，直接从睾丸获取的精子具有更好的DNA完整性。28–30 在OA患者中，睾丸精子的DNA完整性与其生育能力正常的对照组相当，但附睾精子的DFI程度更高。14,31,32 然而，OA患者附睾和睾丸内精子DFI的侧别差异尚未得到研究。本研究通过比较DFI升高的OA或不孕男性左右附睾和睾丸获取的精子来探讨这一难题，以明确这些部位之间是否存在DFI的侧别差异。阐明这一问题有助于优化关于单侧 vs 双侧取精的手术决策，从而减少不必要的手术干预并提高生育结果。

**材料与方法**
研究设计及患者群体
回顾性分析了2020年至2022年间由同一位经过培训的外科医生在纽约长老会医院-威尔康奈尔医学中心进行的睾丸或附睾精子提取手术的所有患者，这些患者的OA或不孕症与精液参数异常和DFI升高有关。根据世界卫生组织（WHO）标准，精液参数异常定义为至少有一个参数超出参考范围。33,34 术前评估包括完整的病史和体格检查以确定睾丸体积。所有患者均使用 orchidometer 作为参考标准进行睾丸体积测量，并使用加热垫放松阴囊提睾肌以便检查精索静脉曲张。精索静脉曲张分级依据Dubin和Amelar系统进行。35 术前获取激素水平数据，包括血清睾酮和促卵泡生成激素（FSH）。所有睾丸和附睾样本均进行了TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）检测以评估精子DNA片段化（正常DFI：≤15%）。TUNEL检测方法如前所述。36 患有OA的患者最初均接受双侧MESA，除非之前有睾丸外伤、手术或II/III级精索静脉曲张的情况，此时会避开受影响部位；如果无未受影响的一侧，则继续进行该侧操作。如果取出的精子数量较少，随后会进行双侧睾丸活检，同样避开先前受影响的部位。对于精液参数异常且DFI升高的不孕患者，进行精子提取以优化ART效果。双侧显微睾丸活检避开之前手术、外伤或II/III级精索静脉曲张的部位。根据精子数量的视觉评估决定是否进行MESA，同样避开受影响的部位。

本研究获得了纽约长老会医院-威尔康奈尔医学中心伦理委员会（IRB）的批准（IRB #20-07022335）。研究遵循所有适用于涉及人类参与者的机构和联邦法规。由于回顾性研究设计，无需签署知情同意书。

**附睾精子提取方法**
附睾精子提取采用我们之前描述的技术进行微分离。38 使用手术显微镜，在X10-15倍放大倍率下进行附睾管解离和抽吸。使用双极镊子在扩张的透明附睾管上创建无血管区域。在覆盖附睾管的鞘膜上做一个3.5毫米的孔，然后用15度微刀穿刺附睾管。打开附睾管后，将内径0.5毫米、外径0.9毫米、刻有1-μL刻度的5-μL微量移液管（Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA）放置在其附近。精子通过毛细作用被吸入微量移液管中，液体被冲洗到含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（0.5至1.0 mL）的无菌容器中。实验室被指示将吸取物分装在多个试管中，以便在需要时多次用于IVF周期。附睾抽吸液与等体积的甘油保护剂稀释后，逐渐冷却至4°C，再转移到顺序冷冻装置中冷却至-90°C，最终储存在液氮中（-196°C）。

**显微睾丸活检方法**
睾丸活检在手术显微镜辅助下进行，采用我们之前描述的技术。39 简而言之，在X15倍放大倍率下观察白膜，避免损伤次膜血管。在中前表面选择无血管区域进行切口，使用15度微刀小心切割约5至10毫米长的切口。切除组织前先用双极烧灼器烧灼次膜血管，重点提取大而白色的管状结构（这些结构更可能含有精子）。每个样本（通常<1毫克组织）。

**统计分析**
患者和疾病特征使用描述性统计进行分析，包括比例、中位数和均值±标准差。通过Shapiro-Wilk检验确认结果变量（睾丸和附睾TUNEL检测）呈偏态分布，因此使用Wilcoxon秩和检验比较左右侧的TUNEL检测结果。所有数据分析使用R v4.3.2软件（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）。所有统计检验的显著性水平设为0.05，均为双侧检验。

**结果总结**
共有24名患者符合纳入标准，他们接受了MESA和/或睾丸活检并进行了DFI分析。队列特征详见表1。中位数（IQR）年龄和体重指数（BMI）分别为38.0（32.75–49.25）和26.9（26.07–29.49）。大多数患者从未吸烟（87.5%），2名患者为 former smokers（8.3%），1名为 current smoker（4.2%）。最常见的手术指征包括输精管切除术史（N = 7，29.2%）、高DFI伴精液参数异常（N = 8，33.3%）和先天性双侧输精管缺失（CBAVD）（N = 3，12.5%）。术前血清总睾酮的中位数（IQR）为416 ng/dL（364–576），术前血清FSH的中位数（IQR）为4.60 mIU/mL（3.30–4.88）。2名患者有双侧精索静脉曲张，10名患者有左侧精索静脉曲张，其中左侧精索静脉曲张更严重。10名患者仅接受双侧睾丸活检；5名患者同时接受双侧睾丸活检和单侧MESA；3名患者仅接受双侧MESA；2名患者同时接受双侧MESA和单侧睾丸活检；4名患者同时接受双侧睾丸活检和双侧MESA。在这4名患者中，右侧睾丸、右侧附睾、左侧睾丸和左侧附睾的DFI分别为9.70 ± 2.23；21.85 ± 10.91；7.00 ± 2.49；9.88 ± 3.13。在这小部分患者中，右侧睾丸和右侧附睾之间、右侧睾丸和左侧睾丸之间以及左侧睾丸和左侧附睾之间的DFI无统计学差异（所有p > 0.05）。

**表1. 队列特征**
| 特征 | 总数（N） | 中位数（IQR） |
| ---- | ---- | ---- |
| 年龄 | 38.00 [32.75, 49.25] | |
| BMI | 26.90 [26.07, 29.49] | |
| 吸烟状态 | 从未吸烟（87.5%） | 21 |
| 曾吸烟（8.3%） | 2 |
| 目前吸烟（4.2%） | 1 |
| 精索静脉曲张 | 无 | 12 |
| 单侧（左侧） | 10 |
| 双侧 | 2 |
| 手术指征 | 输精管切除术（7, 29.2%） | 7 |
| 高DFI伴精液参数异常（8, 33.3%） | 8 |
| 先天性双侧输精管缺失（CBAVD）（3, 12.5%） | 3 |
| 非CF引起的CBAVD（1, 4.2%） | 1 |
| 双侧腹股沟疝修复后的医源性OA（1, 4.2%） | 1 |
| 特发性OA（4, 16.7%） | 4 |
| 怀孕尝试时间（年） | 3.00 [1.81, 4.00] | |
| 梗塞间隔时间（年） | 8.00 [7.00, 12.50] | |
| 术前血清总睾酮（ng/dL） | 416 [364–576] | |
| 术前血清FSH（mIU/mL） | 4.60 [3.30–4.88] | |
| 注：数据基于8名输精管切除术患者（n = 7）或医源性OA患者（n = 1）。 |

**表2. 按手术指征和DFI侧别分层的结果**
我们将队列按手术指征（N = 16例OA vs N = 8例DFI升高）和DFI测量侧别进行分组，结果显示无论手术指征如何，左右睾丸或附睾精子的DFI之间均无显著差异（所有p > 0.05）。OA患者的睾丸体积存在显著侧别差异，右侧平均体积为21.75 ± 4.71 cc，左侧为18.62 ± 5.62 cc（p = 0.001）；同样，DFI升高患者的右侧睾丸体积也更大（20.12 ± 6.06 cc vs 15.38 ± 5.53 cc，p = 0.01）。**按手术指征和侧别比较DFI**
**特征** | **按手术指征分层的队列**
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