超越单一参数：结构组合如何决定壳聚糖的抗菌效果

《Carbohydrate Polymers》：Beyond single parameters: How structural combinations determine chitosans' antibacterial effects

　　卡塔琳娜·艾克尔帕施（Katharina Eickelpasch）| 莱奥妮·布鲁塞尔（Leonie Brussel）| 斯特凡·科德-兰德韦尔（Stefan Cord-Landwehr）| 布鲁诺·M·莫尔斯巴赫（Bruno M. Moerschbacher）| 卡罗琳·里希特（Carolin Richter）

明斯特大学植物生物学与生物技术研究所，德国明斯特，Schlossplatz 8，48143

摘要

壳聚糖是一种多功能且具有广阔应用前景的功能性生物聚合物，具有多样的生物活性，这些活性受到三个特征性结构参数的强烈影响：聚合度（DP）、乙酰化比例（FA）以及乙酰化模式（PA）。然而，由于对这些结构-功能关系及其潜在机制的理解有限，壳聚糖的可重复性和有效应用受到了阻碍。为了解决这一问题，我们从一种母体壳聚糖（DP 1237，FA 0.01）制备了16种不同类型的壳聚糖，这些壳聚糖具有明确的DP和FA值，并具有随机的（伯努利）PA模式。我们分析了所选壳聚糖对四种植物病原体的抗菌活性，包括番茄丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）、密歇根克拉克氏菌（Clavibacter michiganensis）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和麦角菌（Ustilago maydis），发现所有壳聚糖都具有显著的抗菌效果。进一步的研究表明，仅低FA值或特定DP值并不能单独解释增强的抗菌活性；FA对抗菌效果的影响依赖于DP值，反之亦然。这表明DP和FA之间存在复杂的相互作用，仅用单一参数进行解释是不充分的。未来的研究需要验证这一结论是否适用于其他病原体。

1. 引言

壳聚糖是壳聚糖的部分或完全去乙酰化产物，由于其优异的材料特性和多样的生物活性，成为最具应用前景的功能性生物聚合物之一（Rinaudo, 2006）。这种线性多糖由d-葡萄糖胺（GlcN）和N-乙酰-d-葡萄糖胺（GlcNAc）单元通过β-1,4-糖苷键连接而成，其结构由三个参数决定：聚合度（DP）、乙酰化比例（FA）和乙酰化模式（PA）。壳聚糖的这些结构多样性使其具有广泛的功能性（Bellich et al., 2016; Cord-Landwehr et al., 2020; Wattjes, Sreekumar, et al., 2020）。不同的壳聚糖具有特定的生物学功能，因此需要根据不同的应用选择结构特征明确的壳聚糖类型（Cord-Landwehr et al., 2020; Sreekumar et al., 2022; Wattjes, Sreekumar, et al., 2020）。壳聚糖的DP和FA值可以在生产过程中进行控制，且用于表征的分析方法也在不断改进，因此这两个参数可以可靠地测定（Cord-Landwehr et al., 2019; Younes et al., 2016; Younes & Rinaudo, 2015）。大多数市售壳聚糖是通过部分非均相碱性脱乙酰化壳聚糖制备得到的，其中FA值通常在0.05到0.25之间，寡聚体的DP值在2到20之间，聚合物的DP值在100到2000之间（Weinhold et al., 2009; Younes & Rinaudo, 2015）。然而，在关于壳聚糖生物活性的研究中，这些参数经常被忽略，而且功能多样性与结构多样性之间的关系尚未得到充分认识（Cord-Landwehr et al., 2020; Eickelpasch et al., 2025; Wattjes, Sreekumar, et al., 2020）。最近的研究还表明，通过非均相脱乙酰化制备的壳聚糖具有更规则的PA模式，即每三个GlcNAc单元中就有一个被乙酰化，但工艺条件对这种所谓“三联体强度”的影响尚不清楚（Hellmann, Gillet, et al., 2024）。这种对壳聚糖结构特征的缺乏以及对生物活性机制的深入了解不足，影响了其可重复性，并阻碍了其在植物生长促进剂或抗菌剂等领域的应用。

壳聚糖的抗菌活性是其被研究最广泛的生物活性之一。总体而言，壳聚糖对多种真菌和细菌具有强效的抗菌效果（Goy et al., 2009; Raafat & Sahl, 2009），但不同微生物对壳聚糖的敏感性存在差异；然而，文献中的研究结果并不一致。一些研究表明革兰氏阳性细菌对壳聚糖的敏感性更高（Jeon, 2001; No et al., 2002; Tayel et al., 2010; Zheng & Zhu, 2003），而另一些研究则指出革兰氏阴性细菌的敏感性更高（Chung & Chen, 2008; Younes et al., 2014）。此外，不同真菌属对壳聚糖的敏感性也存在差异（Oliveira et al., 2008; Younes et al., 2014）。现在普遍认为壳聚糖的结构参数对其抗菌活性也有显著影响。例如，研究表明随着FA值的降低，壳聚糖的抗菌活性增强（Confederat et al., 2021; Goy et al., 2009; Raafat & Sahl, 2009; Wattjes, Sreekumar, et al., 2020），这可能是由于低FA值的壳聚糖具有更高的电荷密度，从而增强了与带负电的微生物细胞表面化合物的静电相互作用。也有研究指出DP值的影响，但相关结果并不一致且仍有争议。一些研究表明中小型壳聚糖（DP 10–300）具有最高的抗菌活性（Kulikov et al., 2014; Wattjes, Sreekumar, et al., 2020; Younes et al., 2014），而其他研究则发现DP 30–50的壳聚糖具有最高的活性（Huet et al., 2023; Rahman et al., 2015），还有一些研究认为DP 500–1200的大型壳聚糖具有最强的活性（Ulfadillah & Chang, 2024; Zhang et al., 2024）。这些不一致性的原因可能包括不同的最佳DP范围、未知的PA值，以及壳聚糖样品的DP和FA值通常是平均值且其分散度（D）很少被测定（Attjioui et al., 2021）。此外，实验条件等非壳聚糖因素也可能影响抗菌活性。最近对壳聚糖抗菌性能研究的系统分析强调了这些关系的复杂性，指出了微生物菌株特异性或培养基pH值等其他实验条件的重要影响（Eickelpasch et al., 2025）。因此，跨研究比较困难且容易产生误解和错误结论。

为了系统地深入探讨这些结构-功能关系，我们从同一种母体壳聚糖制备了16种壳聚糖，覆盖了广泛的DP（10–1200）和FA（0–0.5）范围，并在标准化和受控条件下评估了它们的抗菌活性，以尽量减少因实验条件差异带来的不确定性。我们假设同时改变DP和FA的方法可能比仅改变其中一个参数的方法提供更深入的结构-功能关系理解。重要的是，通过部分化学N-乙酰化完全去乙酰化的聚葡萄糖胺获得了不同FA值的壳聚糖，这一过程已被证明能产生随机（=伯努利）的PA模式（Aiba, 1991; Hellmann, Gillet, et al., 2024; Weinhold et al., 2009），从而消除了这一第三个结构参数的影响。然后，在统一的实验条件下测试了这些结构明确的壳聚糖对四种不同植物病原体的抗菌活性，以初步了解它们对不同微生物种类的作用机制。接下来，我们测试了多种壳聚糖对番茄丁香假单胞菌的抗菌活性。结果发现，结构参数对抗菌活性的影响不如文献中预期的那么明显，特别是在商业上常见的有限DP和FA范围内。重要的是，结果清楚地表明壳聚糖的DP值对其对抗番茄丁香假单胞菌的抗菌活性有影响，反之亦然，这表明结构参数之间的相互作用比之前认为的更为复杂。尽管如此，这项研究仅限于单一物种，因此未经进一步研究不应将其结果推广到其他物种。

2. 材料与方法

2.1. 母体壳聚糖（聚葡萄糖胺）的纯化

使用从虾壳废弃物中提取的壳聚糖进行四步连续部分碱性非均相脱乙酰化反应制备的壳聚糖聚合物作为起始材料（Gillet Chitosan，法国Plumaudan提供）。将这种壳聚糖在室温下用稀释的醋酸（每克聚葡萄糖胺0.575毫升醋酸）溶解过夜，随后通过5微米、0.8微米和0.45微米孔径的膜过滤，再通过缓慢加入25%（w/w）氨水使其沉淀。溶液反复用水洗涤，离心（12,000转/分钟，20分钟），直至上清液pH值呈中性。最后将纯化的壳聚糖冷冻干燥，得到白色粉末。该母体壳聚糖的结构特征如下，DP值为1237，?M值为1.89，FA值为0.01，基本上属于聚葡萄糖胺（表1）。

表1. 本研究中制备的所有16种壳聚糖的DP和FA系列特征。DP = 聚合度；?M = 分子量分散度；FA = 乙酰化比例；n.d. = 无法测定；med.DP/FA = 中值DP/FA。

壳聚糖样品 | DP（平均值±标准差） | ?M（平均值±标准差） | FA（平均值±标准差）
--- | --- | --- | ---
DP系列 | FA系列 | |
DP 1237, FA 0.01 | 1237 ± 21 | 1.89 ± 0.28 | 0.01 ± 0.00 |
高DP零 | FADP 116, FA 0.01 | 116 ± 13 | 1.38 ± 0.13 | 0.01 ± 0.00 |
中等DP零 | FADP 47, FA 0.00 | 47 ± 6 | 1.29 ± 0.17 | 0.00 ± 0.00 |
低DP零 | FADP 9, FA 0.01 | 9 ± 0 | 0.01 ± 0.00 |
寡聚物零 | FADP 111 | 3 | 111 ± 4 | 1.84 ± 0.03 | 0.13 ± 0.00 |
高DP低 | FADP 120, FA 0.14 | 120 ± 9 | 1.11 ± 0.06 | 0.14 ± 0.00 |
中等DP低 | FADP 55, FA 0.14 | 55 ± 11 | 4.3 ± 0.13 | 0.14 ± 0.00 |
低DP中等 | FADP 16, FA 0.18 | 16 ± 0 | 0.18 ± 0.00 |
寡聚物低 | FADP 1027, FA 0.27 | 1027 ± 6 | 1.84 ± 0.04 | 0.27 ± 0.00 |
高DP中等 | FADP 162, FA 0.27 | 162 ± 11 | 1.17 ± 0.04 | 0.27 ± 0.00 |
中等DP中等 | FADP 63, FA 0.29 | 63 ± 0.13 | 0.05 | 0.29 ± 0.00 |
低DP中等 | FADP 17, FA 0.32 | 17 ± 0 | 0.32 ± 0.00 |
寡聚物中等 | FADP 1024, FA 0.41 | 1024 ± 4 | 21.69 ± 0.09 | 0.41 ± 0.00 |
高DP高 | FADP 149, FA 0.42 | 149 ± 11 | 1.36 ± 0.04 | 0.42 ± 0.00 |
高DP高 | FADP 62, FA 0.44 | 62 ± 5 | 1.21 ± 0.09 | 0.44 ± 0.00 |
低DP高 | FADP 21, FA 0.47 | 21 ± 0 | 0.47 ± 0 | 0.00 |
寡聚物高 | FA |

2.2. 母体聚葡萄糖胺的N-乙酰化

使用上述方法（Lamarque et al., 2005），通过部分化学N-乙酰化（FA系列）制备了一系列具有不同FA值但相同DP值的壳聚糖，进行了微小修改。将聚葡萄糖胺聚合物溶解在水中（每克聚葡萄糖胺0.575毫升醋酸），加入等体积的1,2-丙二醇，室温下搅拌60分钟。脱气60分钟后，按化学计量比加入醋酸酐以达到所需的FA值（2克聚葡萄糖胺对应160微升醋酸酐：FA约0.15时需160微升，FA约0.35时需390微升，FA约0.55时需670微升）。反应混合物在室温下搅拌过夜，通过5微米孔径的膜过滤，然后通过缓慢加入25%（w/w）氨水和四倍反应体积的丙酮使壳聚糖沉淀。沉淀后的壳聚糖用dH2O:丙酮溶液多次洗涤（详见表S1）以去除剩余的1,2-丙二醇。最后，将纯化的N-乙酰化壳聚糖重新悬浮在水中并冷冻干燥，得到白色粉末。其结构特征如下，所得FA值略低于目标值（表1）。

2.3. 壳聚糖聚合物的解聚

使用上述方法（Moussa et al., 2019），通过部分化学解聚处理母体聚葡萄糖胺和N-乙酰化壳聚糖聚合物，得到具有不同DP值但相同FA值的样品（DP系列），其中使用了亚硝酸（Moussa et al., 2019）。解聚过程中，将2.1克每种壳聚糖聚合物溶解在100毫升dH2O和1.2毫升37% HCl中，室温下连续搅拌过夜。溶解后，加入5毫升新鲜的NaNO2水溶液，混合物在室温下搅拌16小时。根据目标DP值调整NaNO2浓度（DP约10时为44.85克/升，DP约50时为11.96克/升，DP约120时为4.485克/升）。通过逐步提高pH值至9（加入25%（w/w）氨水和额外丙酮）使壳聚糖沉淀。沉淀后的壳聚糖用多次dH2O:丙酮溶液洗涤（表S2）并离心（10,000转/分钟，20分钟），直至上清液pH值呈中性。最后将解聚后的壳聚糖重新悬浮在水中并冷冻干燥，得到白色粉末。其结构特征如下，所得DP值与目标值一致（表1）。

2.4. 确认所有FA为0的壳聚糖的FA值

在使用壳聚糖进行抗菌测试之前，首先将其溶解在含有相对于游离氨基过量5%摩尔醋酸的dH2O中，室温下搅拌过夜，然后用0.2微米孔径的滤膜进行无菌过滤。壳聚糖的表征
壳聚糖的分子量分布（FA）是通过酶促质谱指纹分析（EMS-FP）确定的，该方法包括使用ChiB/Csn174催化的水解，随后对产物进行亲水相互作用液相色谱电喷雾离子化质谱（HILIC-ESI-MS）分析，所有操作均重复三次，具体方法如前所述（Wattjes, Niehues, & Moerschbacher, 2020）。聚合物壳聚糖样品的分子量（Mw和Mn）及其分子量分散度（?M）是使用高压尺寸排阻色谱结合折射率和多角度激光光散射检测器（HPSEC-RI-MALLS）测定的，所有操作也重复三次，具体方法如前所述（Schatz et al., 2003）。相应的平均聚合度（DP）是基于重量平均分子量（Mw）计算的（表S3）。对于低聚壳聚糖（DP < 25），其DP分析是通过尺寸排阻色谱结合质谱和折射率检测（SEC-RI-MS）进行的，所有操作同样重复三次，具体方法如前所述（Hellmann, Moerschbacher, & Cord-Landwehr, 2024）。在所有情况下，都指出了壳聚糖样品的平均DP值，即每个样品中自然存在比指定DP值小和大的壳聚糖分子（图S1）。

2.5. 通过半制备型尺寸排阻色谱分离壳聚糖
为了分离出特定DP的壳聚糖组分（例如DP 11；FA 0.01），采用了半制备型尺寸排阻色谱（semi-prepSEC）技术，具体方法如前所述（Richter et al., 2025）。具体操作包括使用ECurity GPC系统（PSS Polymer Standards Service，德国美因茨）。实验设置包括三个HiLoad 26/60 Superdex 30预处理级柱（2.6 × 180厘米），柱子用150 mM醋酸铵和200 mM醋酸（pH 4.5）平衡；配备RI检测器（Refracto Max 524，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）和分馏收集器（FRAC-200，Pharmacia，瑞典乌普萨拉）。将5 mg/mL的壳聚糖溶液装入5 mL容量循环器中，洗脱流速设定为0.6 mL/min，并收集5分钟的洗脱液。将所需DP范围的组分合并，使用SEC-MS分析其组成，并多次冻干，得到白色粉末。

2.6. 对Syringae假单胞菌和Michigan枝孢菌的抗菌活性
壳聚糖的抗菌活性是通过液相96孔微量滴定板实验测定的，具体方法如前所述（Richter et al., 2025）。简要来说，Syringae假单胞菌pv. tomato在NYG琼脂上培养（pH 5.8，含有0.5%（w/v）胨、0.3%（w/v）酵母提取物、2%（v/v）甘油和1.5%（w/v）琼脂，同时添加利福平（100 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）；Michigan枝孢菌在Corynebacterium琼脂上培养（pH 6，含有0.5%（w/v）葡萄糖、0.5%（w/v）酵母提取物、1%（w/v）胨和0.5%（w/v）NaCl、1.5%（w/v）琼脂）。菌落转移到不含抗生素的液体NYG培养基（pH 5.8）中培养Syringae假单胞菌，或转移到含有0.4%（w/v）葡萄糖、0.4%（w/v）酵母提取物和1%（w/v）麦芽提取物的Gym Streptomyces培养基中培养（pH 6）中，培养条件为26°C下振荡（120 rpm）。将40 μL无菌过滤后的壳聚糖溶液或dH2O（对照组）加入到160 μL的细菌过夜培养物中（光密度OD600 = 0.0125，约10^8 CFU/mL），然后在无菌平底96孔板中记录OD600值，每15分钟记录一次，连续24小时，使用微孔板读数仪（SpectraMax M2；Molecular Devices，美国圣何塞）进行测量。从各实验数据中减去空白对照组值，将生长情况归一化到对照组水平，并使用GraphPad PRISM软件（GraphPad Software, Inc.，美国圣地亚哥）确定IC50值。实验重复三次，每种组分重复三次。统计分析采用单因素ANOVA和后续的Tukey检验进行。

2.7. 对禾本科镰刀菌的抗真菌活性
壳聚糖的抗真菌活性评估方法如前所述（Richter et al., 2025）。简要来说，禾本科镰刀菌（Brunel et al., 2013）的菌丝体首先在Complete Medium（CM，Pontecorvo et al., 1953）中于26°C和120 rpm下预培养96小时，然后转移到含有羧甲基纤维素的CM中以产生分生孢子悬浮液。在无菌平底96孔微量滴定板中，向150 μL CM（pH 5.8）中加入40 μL无菌过滤后的壳聚糖溶液或dH2O（对照组），再加入10 μL分生孢子悬浮液（7 × 10^3个分生孢子/mL）或dH2O（空白组）。板子密封后在26°C下搅拌培养四天，通过UV/Vis分光光度计测量OD600值来监测真菌生长。从各实验数据中减去空白对照组值后，将生长情况归一化到对照组水平，并使用GraphPad PRISM软件确定IC50值。实验重复三次，每种组分重复六次。统计分析采用单因素ANOVA和后续的Tukey检验进行。

2.8. 对Ustilago maydis的抗真菌活性
Ustilago maydis的抗菌活性评估方法如前所述（Richter et al., 2025）。简要来说，Ustilago maydis首先在YEPSlight培养基（1%酵母提取物（w/v）、0.4%胨（w/v）和0.4%蔗糖（w/v）中于28°C和200 rpm下预培养5小时。培养后，将200 μL预培养物加入50 mL CM培养基（pH 5.8）中，补充2%（w/v）葡萄糖，然后于28°C和200 rpm下培养过夜。在无菌平底96孔微量滴定板（Greiner Bio-One GmbH，德国弗里克恩豪森）中，将OD600调整为0.0125的真菌过夜培养物160 μL加入40 μL无菌过滤后的壳聚糖溶液或dH2O（对照组）。板子密封后，在26°C下培养24小时，使用UV/Vis分光光度计测量起始OD600值。然后将培养物转移到具有V形底的锥形96孔微量滴定板（Greiner Bio-One GmbH，德国弗里克恩豪森）中继续培养24小时。培养结束后，再将内容物转移回平底96孔微量滴定板中，再次测量OD600值。从各实验数据中减去空白对照组值后，将真菌生长情况归一化到对照组水平，并使用GraphPad PRISM软件确定IC50值。实验重复三次，每种组分重复六次。统计分析采用单因素ANOVA和后续的Tukey检验进行。

3. 结果
3.1. 有明确结构定义的壳聚糖的系统性制备
在本研究中，使用了一种几乎完全脱乙酰化的壳聚糖聚合物样品（DP 1237，?M 1.89，FA 0.01），即高DP的聚葡萄糖胺，作为母材，并在严格定义的条件下将其转化为不同DP和FA系列的壳聚糖，确保每个系列中的壳聚糖仅在单一参数上有所不同。首先，这种零FA的聚合物进行N-乙酰化处理，生成了与母材具有相似高DP的壳聚糖，但FA值分别为0.13、0.27和0.41（表1）。接着，使用不同浓度的亚硝酸将这四种聚合物化学解聚，以获得不同的DP。通过这种方法，无论壳聚糖的FA值如何，都能成功制备出中等和低DP的壳聚糖聚合物（约130和约55），以及DP约为15的低聚壳聚糖。虽然在一个特定DP系列中的壳聚糖DP值由于生产过程和表征方法的存在而略有变化，但这些变化仍在可接受范围内，且整体分子量分散度较低，因此可以将其分类为仅FA值不同的DP系列（表1）。最终对所有样品的FA进行解析后发现，与母材相比，解聚后的FA值略有变化，尤其是当壳聚糖的DP值降低时，这种变化更为明显。这可能是由于纯化过程中较小的低FA壳聚糖损失较多，导致样品的平均FA值略有升高。不过，这些FA值的变化仍在可接受范围内，因此将它们分类为不同的FA系列是合理的。最终获得了16种不同的壳聚糖样品，包括高DP（约1100）、中等DP（约130）和低DP（约55）的聚合物，以及DP约为15的低聚壳聚糖，它们的FA值分别为约0.01、约0.15、约0.30和约0.45（表1）。

3.2. 壳聚糖对不同植物病原体的体外抗菌活性
为了初步了解壳聚糖与不同植物病原体之间的潜在结构-功能关系，我们首先分析了基于文献选择的四种壳聚糖的抗菌活性，其中包括我们最近关于该主题的系统综述（Eickelpasch et al., 2025）。大多数作者认为FA对抗菌活性有显著影响，FA值最低的壳聚糖具有最高的抗菌活性，而DP的影响则不那么明显，中等和低分子量的壳聚糖具有最高的抗菌活性。令人惊讶的是，我们的系统综述表明FA的影响比预期的要弱得多，但支持了文献中关于DP影响的结论。因此，我们从上述组中选择了两种零FA且DP值较低的壳聚糖（DP 47，FA 0.00；DP 116，FA 0.01），以及两种FA值中等且DP值较高的壳聚糖（DP 120，FA 0.14；DP 162，FA 0.27）。这些壳聚糖被用于测试四种植物病原体，分别是革兰氏阴性细菌Syringae假单胞菌pv. tomato、革兰氏阳性细菌Michigan枝孢菌、子囊菌Fusarium graminearum和担子菌Ustilago maydis。通过测量不同浓度壳聚糖存在下的光密度（OD600）随时间的变化来评估微生物的生长情况。根据24小时后的OD600值（图S2-S5）确定每种壳聚糖的半最大抑制浓度（IC50）。所有四种壳聚糖都对这四种微生物表现出强烈的抗菌活性，IC50值均低于55 μg/mL（图1）。虽然所有情况下真菌物种（IC50约10–30 μg/mL）对壳聚糖的处理更为敏感，但细菌物种（IC50约35–55 μg/mL）对壳聚糖的处理则不那么敏感。两种零FA壳聚糖的抗菌活性与DP值无关，而三种中等DP值的壳聚糖仅显示出轻微的FA影响。对于所有测试的物种，观察到随着FA值的增加抗菌活性略有下降的趋势，但在比较零FA和中等FA值的Michigan枝孢菌时这一趋势才显著。总体而言，不同壳聚糖之间没有显著差异。

3.3. 结构多样的壳聚糖对Syringae假单胞菌的抗菌活性详细分析
由于在四种微生物中观察到的抗菌活性没有显著差异，这与我们在最近的系统综述（Eickelpasch et al., 2025）中观察到的这一DP和FA范围内的情况类似，我们决定仅针对Syringae假单胞菌测试更广泛的壳聚糖。根据24小时后的OD600值（图S6，表S4）从剂量-反应曲线确定每种壳聚糖的IC50值。将IC50值（表S4）与不同DP和FA系列的结构参数进行对比后，某些结构-功能关系的趋势变得明显（图2）。对于所有壳聚糖样品，抗菌活性似乎随FA值的增加而降低（图2a，表2）。这一趋势在高DP值的壳聚糖中最明显，其中FA值为0.27和0.41的壳聚糖的IC50值显著高于低乙酰化壳聚糖（表2）。这种趋势在低聚壳聚糖中类似但不明显，而在中等DP值的壳聚糖中几乎不存在。DP对抗菌活性的影响在不同FA范围内的一致性较差（图2b，表2）。对于零FA值的壳聚糖，抗菌活性随DP值的增加而略有增加，而对于中等和高FA值的壳聚糖则相反（图2b），其中高DP值的壳聚糖表现出最低的抗菌活性，而低FA值的壳聚糖几乎没有检测到DP的影响。

3.4. 壳聚糖对不同植物病原体的抗菌活性
由于在四种微生物中观察到的抗菌活性没有显著差异，这与我们最近的系统综述（Eickelpasch et al., 2025）中的结果一致，我们决定仅针对Syringae假单胞菌测试更广泛的壳聚糖。根据24小时后的OD600值从剂量-反应曲线确定每种壳聚糖的IC50值（图S6，表S4）。将IC50值（表S4）与不同DP和FA系列的结构参数进行对比后，某些结构-功能关系的趋势变得明显（图2）。对于所有壳聚糖样品，抗菌活性似乎随FA值的增加而降低（图2a，表2）。这种趋势在高DP值的壳聚糖中最明显，其中FA值为0.27和0.41的壳聚糖的IC50值显著高于低乙酰化壳聚糖（表2）。这种趋势在低聚壳聚糖中相似但不明显，而在中等DP值的壳聚糖中则最不明显。DP对抗菌活性的影响在不同FA范围内的一致性较差（图2b，表2）。对于零FA值的壳聚糖，抗菌活性随DP值的增加而略有增加，而对于中等和高FA值的壳聚糖则呈现相反的趋势（图2b），其中高DP值的壳聚糖表现出最低的抗菌活性，而低FA值的壳聚糖几乎没有检测到DP的影响。在本研究中，测试了壳聚糖对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）生长的半最大抑制浓度（IC50；单位：μg/mL）。所提供的数据为三次独立实验的平均值 ± 标准差。统计分析采用了单因素方差分析（One-way ANOVA）和事后Tukey检验。如果没有相同上标字母的平均值，则表示它们之间存在显著差异（p < 0.05）。DP表示聚合度；FA表示乙酰化比例。

为了进一步缩小零乙酰化壳聚糖的有效聚合度范围，并确定其潜在的最小和最佳聚合度，我们通过半制备液相色谱（semi-prepSEC）技术从平均聚合度为11、乙酰化比例为0.01的壳聚糖寡聚物样品中分离出不同组分（图S7），主要包含DP 4、DP 8、DP 16或DP 27，这通过SEC-MS得到验证。当这些寡聚物样品被测试其抗菌活性时，观察到聚合度具有显著影响（图3和表S4），其中DP 16样品显示出最高的活性，而四聚体则没有抗菌活性。

**图3.** 通过半制备液相色谱（semi-prepSEC，图S7）从平均聚合度为11、乙酰化比例为0.01的壳聚糖样品中分离出的不同组分（DP 4（深蓝色）、DP 8（浅蓝色）、DP 16（橙色）和平均DP 27（红色）制备的样品对丁香假单胞菌番茄致病变种的抑制效应的剂量-反应关系。数据为两次独立实验的平均值，每组三次重复实验的平均值。DP表示聚合度；FA表示乙酰化比例；n.d.表示无法确定。

**讨论：**
在本研究中测试的所有壳聚糖都表现出强烈的抗菌活性，IC50值始终较低。即使是对抗丁香假单胞菌的最高IC50值（DP 1024，FA 0.41），也低于100 μg/mL（表2）。唯一的例外是分离出的DP 8和DP 4样品，它们分别表现出弱或无活性（图3）。尽管总体活性较高，但在四种微生物之间观察到了敏感性的差异：真菌种类对壳聚糖处理的敏感性高于细菌种类。虽然两种真菌门之间存在差异（图1），但革兰氏阴性菌丁香假单胞菌受壳聚糖处理的影响略小，但不显著低于革兰氏阳性菌C. michiganensis。关于这一点，文献中的研究结果存在分歧。一些研究表明革兰氏阳性菌对壳聚糖更敏感（Jeon, 2001; No et al., 2002; Tayel et al., 2010），而其他研究则认为革兰氏阴性菌更为敏感（Chung & Chen, 2008; Younes et al., 2014）。显然，需要在相同条件下测试更广泛的物种，才能得出明确结论。除了系统发育关系外，还需要考虑是否存在壳聚糖酶，因为这也会影响不同微生物对壳聚糖的敏感性（Aktuganov et al., 2018; Ghinet et al., 2010; Lacombe-Harvey et al., 2009; Oliveira et al., 2008）。有趣的是，比较最初测试的四种壳聚糖的抑制效应时，未观察到显著的抗菌活性差异（图1）。这与最近关于壳聚糖抗菌性质的系统性分析结果一致，该分析指出中等聚合度的壳聚糖具有最高的抗菌活性，而且有趣的是，这种活性似乎几乎不受乙酰化比例的影响（Eickelpasch et al., 2025）。尽管系统性综述比较了在不同条件下使用不同来源的壳聚糖的研究结果，但本研究使用的是从同一母壳聚糖生成的壳聚糖，并在标准化条件下进行测试，至少对于所选微生物来说，这一结论得到了验证。

当我们扩大壳聚糖的聚合度和乙酰化比例范围时，发现其对丁香假单胞菌的抗菌活性存在差异。将IC50值（表2）与聚合度和乙酰化比例的关系显示出来，分析这些结构参数单独的影响（图2），发现乙酰化比例的影响明显且在某些情况下显著，而聚合度的影响则不那么一致。总体而言，随着乙酰化比例的增加，抗菌活性降低，这与先前的报告一致（Confederat et al., 2021; Goy et al., 2009; Raafat & Sahl, 2009; Wattjes, Sreekumar, et al., 2020）。低乙酰化比例壳聚糖的增强抗菌效果通常归因于其较高的电荷密度，因为含有更多的GlcN单元，从而能够与带负电的微生物细胞表面成分和膜发生更强的静电相互作用。然而，这种趋势取决于壳聚糖的聚合度：对于高聚合度聚合物来说这种影响最强且显著，对于寡聚体来说较弱，而对于中等聚合度聚合物则几乎不存在（图2a，表2）。同样，聚合度的影响也强烈依赖于乙酰化比例。对于零乙酰化和低乙酰化比例的壳聚糖，抗菌活性随着聚合度的增加而略微降低或保持不变；而对于中等和高压酰化比例的壳聚糖，抗菌活性随着聚合度的增加而增加（图2b）。然而，这些差异并不显著，除非是将高聚合度/高乙酰化比例的壳聚糖与其他较低聚合度/较低乙酰化比例的壳聚糖进行比较。尽管如此，仍可以观察到一定的趋势，显然，聚合度和乙酰化比例对壳聚糖抗菌活性的影响要比之前认为的更为复杂。这一点在图4所示的二维壳聚糖矩阵中表现得更为清晰。

**图4.** 对于结构明确的壳聚糖，根据其DP和FA系列对丁香假单胞菌番茄致病变种的生长抑制作用进行了抗菌活性分析。轴上显示了结构参数DP和FA，每个数据点的颜色表示其半最大抑制浓度（IC50；单位：μg/mL）的活性。颜色渐变范围从红色（表示低活性）到深蓝色（表示高活性）。矩阵中每个数据点内写的数值即为实际的IC50值。数据为三次独立实验的平均值，每组三次重复实验的平均值。统计分析采用了单因素方差分析（One-way ANOVA）和事后Tukey检验。如果没有相同上标字母的平均值，则表示它们之间存在显著差异（p < 0.05）。DP表示聚合度；FA表示乙酰化比例。

我们认为，聚合度和乙酰化比例的这种复杂影响是文献中关于壳聚糖抗菌活性结构-功能关系矛盾结果的重要原因，因为以前的研究通常只考虑了一个参数。据我们所知，这是首次对覆盖广泛DP和FA值范围的壳聚糖生物活性进行系统分析，所有壳聚糖都是从相同的母壳聚糖样品中以相同方式制备的，因此它们的分散度DDP和DFA也相似，从而最小化了其他结构参数的影响。

聚合度和乙酰化比例在决定壳聚糖对丁香假单胞菌抗菌活性方面的复杂相互作用可能是由于不同壳聚糖的作用机制不同所致。虽然当前研究关注了结构-功能关系，但后续研究将需要实验探究其潜在的作用机制。事实上，文献中已经广泛讨论了壳聚糖的抗菌活性机制。聚合物壳聚糖的抗菌活性主要归因于它们与带负电的微生物细胞膜或细胞壁成分的相互作用，导致膜破坏、细胞通透性增加和细胞内容物泄漏，最终导致细胞死亡（Chung & Chen, 2008; Helander et al., 2001; Pe?a et al., 2013; Raafat et al., 2008; Tsai & Su, 1999; Wang et al., 2015; Zhang et al., 2024）。壳聚糖抗菌作用的另一种或额外解释包括其在微生物表面形成薄膜，阻碍养分吸收以及其螯合金属和其他必需营养素的能力（da Silva Mira et al., 2017），从而使这些养分无法被微生物利用。在分析壳聚糖聚合物的抗菌活性时，还需要考虑聚合物的溶解度随乙酰化比例增加而降低的因素。在这里进行的液体测定中，特别是对于高乙酰化程度的聚合物，溶解度的影响无法排除，这可能是聚合物活性随乙酰化比例增加而降低的原因。此外，聚合物可能自聚并形成二级结构，这也可能影响其抗菌活性。

特别是寡聚态壳聚糖，由于其较小的尺寸，可以通过穿透细胞并与关键细胞成分（如RNA或DNA）相互作用来发挥其抗菌活性。然而，壳聚糖穿透细胞并干扰细胞内过程（如蛋白质翻译或RNA合成）的能力在多项研究中仍存在争议（Fei Liu et al., 2001; Galván Márquez et al., 2013; Hadwiger et al., 1986; Rabea et al., 2003）。可以合理假设，大分子壳聚糖引起的膜通透性可能使寡聚体能够进入细胞，从而产生协同效应（Attjioui et al., 2021; Richter et al., 2025）。中等聚合度的壳聚糖样品可能同时含有足够大的聚合物以实现膜通透性，以及足够小的寡聚体以穿透受损的膜并与目标成分相互作用，这解释了它们在这里对丁香假单胞菌的强抗菌活性。通常，所有提出的作用机制可能同时发生，但强度不同，具体取决于壳聚糖的类型。

如果壳聚糖聚合物上的正电荷与细胞膜或其他细胞表面结构上的负电荷之间的静电相互作用是其抗菌活性的原因，那么可以合理假设需要壳聚糖具有最小的电荷密度（即最低的乙酰化比例）和最小的尺寸（即最低的聚合度）。这种依赖性也在壳聚糖在植物细胞中诱导抗性的研究中得到证实（Kauss et al., 1989）。另一方面，壳聚糖寡聚体与蛋白质或核酸等分子的细胞内相互作用可能是由GlcN残基的静电相互作用（在中性细胞质pH下较弱）和GlcNAc残基的疏水性相互作用共同驱动的。虽然我们的当前研究没有包括PA的变化，但可以合理假设不仅DA和FA，PA也起着关键作用。中等乙酰化比例的壳聚糖可能含有更多具有所需PA的域，而低或高乙酰化比例的壳聚糖则可能含有较少的此类域，这些域可能通过细菌壳聚糖酶的作用释放。实际上，有证据表明，通过酶促N-乙酰化产生的具有更规则PA的壳聚糖比通过化学N-乙酰化产生的随机PA的壳聚糖具有更高的活性（Sreekumar et al., 2022）。

总之，DP和FA对细胞表面相互作用和膜通透性的不同影响，以及细胞摄取和细胞内靶标的干扰，可以解释壳聚糖对丁香假单胞菌抗菌活性的复杂结构-功能关系。高聚合度壳聚糖聚合物可能主要通过静电表面相互作用发挥作用，这可以解释随乙酰化比例增加而导致抗菌活性降低的现象。中等聚合度的壳聚糖样品可能含有既适合膜通透性的较大分子，也适合细胞内干扰的较小分子。这两种不同的作用机制相结合，可能导致这些中等聚合度壳聚糖样品的抗菌活性相对独立于乙酰化比例。低聚合度的壳聚糖样品在低到中等乙酰化比例下具有最高的抗菌活性。低乙酰化比例的样品可能缺乏进行细胞内干扰所需的部分乙酰化域，而高乙酰化比例的样品可能缺乏进行膜通透性所需的大分子去乙酰化域。壳聚糖寡聚物（DP 4，FA 0.01）本身无活性，可能是因为它们无法穿透细胞。关于这种作用机制的实验验证将需要在后续研究中进行。低聚合度壳聚糖在非常低的乙酰化比例下仍表现出惊人的高抗菌活性，这表明我们对它们的作用机制尚未完全理解。为了更深入地理解这一现象，需要进一步研究纯化的、具有单一 DP（脱聚度）以及不同组成 fatty acid (FA) 和 phenolic acid (PA) 的壳聚糖寡聚物。不含 FA 的壳聚糖对 P. syringae 具有很强的抗菌活性，这种活性几乎不受 DP 的影响，只要其分子量大于临界值（> DP 8）。同样，中等 FA 含量的壳聚糖的抗菌活性仅受 DP 的轻微影响。高 FA 含量的壳聚糖在中等 DP 时表现出最强的抗菌活性，因为这类样品同时具备细胞表面和细胞内的协同抗菌作用；而高 DP 的样品在细胞内活性较弱，低 DP 的样品在细胞表面活性上也较弱。这些关于壳聚糖抗菌活性与结构-功能关系的深入见解可以为后续研究提供基础，以验证有关抗菌壳聚糖聚合物和寡聚物作用机制的假设，并最终有助于提高基于壳聚糖的应用和产品（如农业作物保护、消毒创可贴、食品和饲料防腐剂或化妆品）的可靠性和有效性。然而，需要指出的是，这些结论目前仅基于一种微生物，因此不能未经进一步研究就普遍应用于其他细菌物种。至于这些结论是否也适用于抗真菌作用，还有待进一步的实验验证。

**作者贡献声明：**
- Katharina Eickelpasch：撰写初稿、数据可视化、实验设计、概念构建。
- Leonie Brussel：实验实施。
- Stefan Cord-Landwehr：撰写与编辑、实验设计。
- Bruno M. Moerschbacher：撰写与编辑、监督工作、资金争取、概念构建。
- Carolin Richter：撰写与编辑、监督工作、实验实施、概念构建。

**资金来源：**
本项工作部分由德国研究基金会（DFG）在优先项目 SPP 2416 “CodeChi”（https://codechi.de）下的项目 525858767 资助。