Clonal and plasmid-mediated dissemination of mcr-1 in Escherichia coli strains at the human–companion animal interface: genomic characterisation of colistin resistance plasmids

《Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases》：Clonal and plasmid-mediated dissemination of mcr-1 in Escherichia coli strains at the human–companion animal interface: genomic characterisation of colistin resistance plasmids

　　

质粒介导的粘菌素耐药基因(mcr-1)的全球出现因其水平传播能力而对人类和动物健康构成重大威胁。尽管食源动物的作用已得到广泛认可，但伴侣动物和家庭环境对mcr-1的持续存在和传播的潜在贡献仍知之甚少。本研究调查了葡萄牙（2018-2020年）犬及其同居人类中携带mcr-1的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株及其相关质粒的遗传相关性。对17株菌株进行了全基因组测序(whole-genome sequencing)，其中包括对同一宿主随时间推移的重复采样。核心基因组单核苷酸多态性(core genome SNP)分析显示，来自同一宿主内及家庭成员（≤6 SNPs）的多个菌株之间存在克隆相关性。共鉴定出14个携带mcr-1的质粒，分为三个主要的不相容群(Incompatibility groups)：IncX4 (n=2)、IncHI2 (n=5)和IncI2 (n=7)。IncX4质粒在同一个人宿主的克隆相关菌株中被检测到且完全相同，表明其在持久谱系内的维持。一部分IncI2质粒在遗传上不同的宿主间形成了一个密切相关的簇（1–6 SNPs），支持了水平传播的潜在可能性。IncHI2质粒表现出更大的结构多样性，并携带多种抗菌素和金属抗性决定因子。值得注意的是，在三株菌株中发现了mcr-1的染色体整合，这表明了粘菌素耐药性稳定的潜在途径。总体而言，这些发现强调了克隆扩增和质粒循环在塑造社区环境中mcr-1基因流行病学中的共同作用，加强了在“同一健康(One Health)”框架下开展基因组监测的重要性。

论文解读：人-伴侣动物界面大肠杆菌mcr-1基因的克隆与质粒介导传播及耐药质粒基因组特征

研究背景与意义

粘菌素长期以来被视为治疗由多重耐药革兰氏阴性菌，特别是碳青霉烯耐药肠杆菌目(Carbapenem-resistant Enterobacterales)引起感染的最后手段。过去认为粘菌素耐药仅源于染色体突变，限制了其水平传播。然而2015年质粒介导粘菌素耐药基因mcr-1的发现改变了这一范式，揭示了耐药性的可转移性潜力。虽然食源动物及食物链在mcr-1传播中的作用已被广泛记录，但伴侣动物在此过程中的作用关注较少。犬猫与人类密切接触，共享家庭环境，且频繁接触兽医抗菌药物，为耐药菌的维持与交换创造了条件。然而，关于家庭内部及密切接触环境中携带mcr-1质粒的多样性、持久性及亲缘关系的详细基因组学研究仍然有限。本研究基于PET-Risk联盟的数据，旨在通过全基因组测序和质粒重建，表征葡萄牙社区及家庭环境中犬与人携带的mcr-1质粒的传播模式。

关键技术方法

研究人员对来自葡萄牙PET-Risk项目的菌株进行了全基因组测序(WGS)，包括从犬、猫及其同居人类粪便样本中收集的mcr-1阳性大肠杆菌。基因组DNA经提取后，利用Illumina NovaSeq 6000进行短读长测序，部分未能重建质粒的样本辅以Oxford Nanopore Technology长读长测序。数据处理包括质控(FastQC, PRINSEQ)、组装(SPAdes)及抛光(Pilon)。基因注释使用Prokka，耐药基因和质粒复制子分别通过ResFinder和PlasmidFinder分析。核心基因组单核苷酸多态性(core genome SNP)分析使用Parsnp结合Gubbins过滤重组区域，并通过RaxML-NG构建最大似然系统发育树。质粒比较分析采用BRIG进行。

研究结果

3.1. 耐粘菌素菌株的系统发育关系

对来自8个家庭共8只犬和4个人的17株mcr-1阳性大肠杆菌进行分析。核心基因组系统发育分析显示，聚类主要由宿主或家庭来源驱动。来自家庭PT102的人和犬的菌株差异仅为≤6 SNPs，表明存在跨宿主的共享克隆。同样，来自同一人类宿主不同时间点的菌株差异仅为2 SNPs，符合体内持久性特征。相反，不同家庭的分离株通常表现出较高的SNP距离(>20,000 SNPs)，表明是无关联的谱系。

3.2. mcr-1质粒骨架的分布与多样性

共鉴定出14个携带mcr-1的质粒，分为三大不相容群：IncX4 (n=2)、IncHI2 (n=5) 和 IncI2 (n=7)。在另外三株来自家庭PT118的菌株中，尽管进行了长读长测序，仍未能重建质粒，mcr-1基因位于染色体上，嵌入在包含氢酶操纵子(HybABCDEFG)和管家基因(dnaG, rpoD)的保守基因组区域，周围存在转座酶和插入序列(ISL30, IS2, IS3)，提示其可能通过可移动遗传元件获得。

3.3. IncX4 mcr-1质粒的比较分析

两个IncX4质粒(pPT219/1-H2F7E1和pPT219/2-H2F7E1)完全相同，且均携带mcr-1.1基因，位于pHNSHP49-like IncX4骨架内。这两个质粒来自同一人类宿主的不同采样时间点。该质粒与巴西鸡肉来源的质粒pMFDS2258.1及中国猪源质粒pHNSHP49具有极高的相似性(>99.99%)，但未携带除mcr-1.1外的其他耐药基因。

3.4. IncHI2 mcr-1质粒的比较分析

五个IncHI2质粒大小约为247至266 kb，分为ST4 (n=4)和ST2 (n=1)两种质粒多位点序列分型(plasmid MLST)。来自家庭PT102的质粒间无SNP差异，与参考质粒pS38相比差异极小(≤12 SNPs)。所有IncHI2质粒均携带典型的接合转移(tra operon)和维持(par genes)系统。mcr-1.1基因上游均关联ISApI1，下游为pap2基因。这些质粒还携带碲抗性基因(terZABCDEF等)，部分还携带银(sil operon)和铜(pco operon)抗性基因。此外，IncHI2质粒还携带多种其他耐药基因，如四环素类(tet(A))、氨基糖苷类(aph(4)-Ia, aac(3)-IV, aadA1)等。

3.5. IncI2 mcr-1质粒的比较分析

七个IncI2质粒（约60 kb）是数据集中最常见的类型。来自不同家庭的人类和犬源的质粒pPT219/3-H1F7E1和pPT025/0-D1F4E1结构几乎相同（仅1 SNP差异）。来自克隆相关菌株的质粒无SNP差异。值得注意的是，来自家庭PT115和PT051的质粒及pPT214/3-D1F3E1形成了一个密切相关的簇（1–6 SNPs），尽管它们存在于遗传上不同的细菌宿主中，这支持了水平传播。这些IncI2质粒与中国的pHNSHP45-like质粒相似，但均未携带上游的ISApI1插入序列。mcr-1.1–pap2元件始终位于IncI2骨架的nikB基因下游，且未携带除mcr-1.1外的其他耐药基因。

结论与讨论

本研究表明，IncX4质粒的高度保守性主要归因于克隆相关大肠杆菌谱系的持久性，而非独立的质粒转移事件。相比之下，IncHI2质粒表现出显著的结构异质性，是多种耐药和金属抗性基因的载体，强调了其作为多重耐药平台的作用。IncI2质粒则显示出高度的保守性，并在遗传上不同的宿主间观察到了水平传播的迹象（1–6 SNPs）。染色体整合的mcr-1发现提示了耐药性稳定的另一种进化路径。研究人员指出，粘菌素耐药性的传播是由质粒稳定性、水平转移以及细菌克隆在家庭内的持久性和传播共同驱动的。在研究的家庭环境中，克隆扩增往往起主导作用。这些发现强调了在“同一健康(One Health)”框架下，考虑宿主细菌系统发育和质粒系统发育的综合基因组方法对于准确推断传播途径的重要性，并凸显了家庭作为抗菌素耐药性维持和传播的重要界面。