小麦黄花叶病毒 (Wheat yellow mosaic virus, WYMV) 抗性基因 Ym5的精细定位及其在育种中的应用

《The Crop Journal》：Fine mapping of Wheat yellow mosaic virus resistance gene Ym5 and its application in breeding

　　

土壤传播的小麦黄花叶病毒 (Wheat yellow mosaic virus， WYMV) 对全球秋播小麦生产构成重大威胁。种植抗WYMV的小麦品种是控制病害的最有效策略。在本研究中，我们对日本小麦品种西丰 (Xifeng) 中的一个主要WYMV抗性基因 Ym5(先前命名为 QYm.njau-5A.1) 进行了精细定位。通过对266份不携带 Ym1基因的小麦种质进行全基因组关联分析，将 Ym5定位在一个4.6?Mb的连锁区段 (位于5A染色体534.6–539.2?Mb)。比较基因组学分析揭示，西丰和欧洲品系ArinaLrFor共享的抗性单倍型，推测为一个来自一粒小麦 (Triticum monococcum) 的外源基因渐渗片段。研究人员开发了13个标记 (12个InDel标记和1个KASP标记) 并验证了其诊断性。从包含6882个单株的西丰 × 扬麦158 F2群体中鉴定出24个重组体，利用侧翼标记 ARI_106和 ARI_218将 Ym5缩小至1.1?Mb的区间 (对应于ArinaLrFor基因组的534.8–535.9?Mb)。追溯了中国育种项目中 Ym5的两个来源：西丰和澳大利亚品种Quality (品质)。进一步研究发现，Ym5的渐渗并未带来明显的产量损失。

论文主体内容解读

研究背景与目的

小麦黄花叶病毒 (Wheat yellow mosaic virus, WYMV) 是一种土壤传播病毒，隶属于马铃薯Y病毒科 (Potyviridae) 的Bymovirus属。该病毒在全球范围内，特别是在东亚和地中海地区，对小麦 (Triticum aestivumL.) 生产构成严重威胁，可导致高达70%的产量损失。WYMV由专性寄生真菌禾谷多粘菌 (Polymyxa graminis) 传播，病毒可在土壤中通过带毒游动孢子长期存活和广泛扩散，使得常规的田间管理和化学防控措施基本无效。因此，利用遗传抗性被认为是控制WYMV最可持续的策略。

尽管已有多个WYMV抗性基因被报道，但其中许多基因尚未被克隆或得到深入研究，其抗性机制和来源尚不明确。在先前的研究中，一个被命名为 QYm.njau-5A.1的数量性状位点 (QTL) 被定位在日本小麦品种西丰的5AL染色体臂上。该QTL在不同品种中表现出对WYMV的抗性，可被视为一个主效显性抗性基因。为了推动该基因的图位克隆和分子标记辅助育种，本研究正式将其命名为 Ym5，并旨在通过精细定位明确其基因组区间、探究其起源、开发实用诊断标记，并评估其在育种中的应用价值。

主要关键技术方法

本研究采用了多项关键技术。首先，研究人员构建了一个包含372份小麦种质的面板，并使用小麦55K SNP芯片进行基因分型。为排除已知抗性基因 Ym1的影响，从该面板中筛选出266份不携带 Ym1的种质，利用其WYMV病害严重度最佳线性无偏预测 (BLUP) 值，采用混合线性模型 (Q+K) 进行了全基因组关联分析 (GWAS)。其次，利用西丰 (抗病，携带 Ym5) 与感病品种扬麦158杂交，构建了一个包含6882个单株的大型F₂群体用于重组体筛选和精细作图。病害严重度采用0-5级量表进行评估，并通过反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 检测WYMV外壳蛋白 (CP) 基因的表达以验证抗感性。此外，研究人员选取了包括中国春 (Chinese Spring)、ArinaLrFor、Fielder等在内的17个已测序普通小麦基因组以及二倍体一粒小麦 (Triticum monococcum) 的基因组，利用SyRI软件对 Ym5所在区域进行了共线性 (collinearity) 和结构变异 (SV) 分析。通过将一粒小麦和乌拉尔图小麦的短序列读数 (Illumina reads) 分别比对到ArinaLrFor和中国春的5A染色体上，进行了读段深度分析以追溯外源片段起源。最后，基于ArinaLrFor与中国春的基因组序列差异，开发了12个插入缺失 (InDel) 标记和1个竞争性等位基因特异性PCR (KASP) 标记用于基因分型和育种应用。

研究结果

3.1. 通过GWAS定位 Ym5

对266份不携带 Ym1的种质进行GWAS分析，在5AL染色体臂上鉴定出三个显著关联峰，其中位于535.5–536.7?Mb的PK3峰与先前报道的 QYm.njau-5A.1位点重叠。连锁不平衡 (LD) 分析进一步在534.6–539.2?Mb区域内识别出一个4.6?Mb的连锁区段，该区段包含 Ym5。基于该区域63个SNP的单倍型分析将372份种质划分为6个单倍型，所有携带 Ym5的抗性种质 (共40份) 均属于Hap_i单倍型，且该单倍型种质在多个SNP位点表现出较高的基因分型失败率，提示该区域可能存在显著序列分歧，可能来源于外源基因渐渗。

3.2. 携带 Ym5的区域来源于一粒小麦的假定外源渐渗

共线性分析显示，在 Ym5连锁区段，欧洲品系ArinaLrFor与中国春及其他16个普通小麦品种的基因组序列共线性很低，表明ArinaLrFor中该区域的起源不同。有趣的是，ArinaLrFor对WYMV同样表现高抗。SNP基因分型和序列比对证实，ArinaLrFor与西丰共享相同的Hap_i单倍型，且从该区段随机挑选的10个基因在两者间序列完全一致，但在中国春和Fielder中则不同。这表明ArinaLrFor也含有 Ym5。进一步的基因组比对发现，该区域与二倍体一粒小麦 (TA10622) 的序列具有较高共线性。通过将一粒小麦和乌拉尔图小麦的短序列读数分别比对，发现仅有一粒小麦的读数在ArinaLrFor 5AL染色体的特定区域 (534.0–540.0?Mb) 显示出覆盖度峰值，而乌拉尔图小麦则无此现象。综合这些证据，研究认为 Ym5所在的区域是一个可能来源于一粒小麦的外源渐渗片段。

3.3. 标记开发与 Ym5精细定位

基于中国春与ArinaLrFor的序列差异，研究人员开发了13个与 Ym5紧密连锁的分子标记 (12个InDel，1个KASP)，经验证可有效区分携带与不携带 Ym5的品种。利用西丰 × 扬麦158的F₂大群体，研究人员鉴定了24个重组体，并通过对衍生出的纯合F_2:3家系进行基因型和表型分析，将这些重组体划分为7种类型。抗病性鉴定表明，前4种重组类型 (1-4) 为抗病，后3种 (5-7) 为感病。Ym5与标记 ARI_168和 ARI_197完全共分离，并被侧翼标记 ARI_106和 ARI_218限定在一个1.1?Mb的物理区间内 (对应于ArinaLrFor基因组的534.8–535.9?Mb)。在该区间内注释了14个基因，其中不包含典型的核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列 (NBS-LRR) 类抗病基因，提示 Ym5可能采用不同于 Ym1和 Ym2的抗病机制。区间内存在两个相邻的细胞壁关联激酶 (WAK) 编码基因 (TraesARI5A01G339500和 TraesARI5A01G339600)，它们是潜在的 Ym5候选基因。

3.4. Ym5在小麦育种中的利用

对中国307个小麦品种的分析显示，Ym5是继 Ym1之后在中国使用频率第二高的WYMV抗性基因，主要部署在WYMV高发的黄淮海、北部和长江中下游冬麦区。系谱分析揭示了中国品种中 Ym5的两个主要来源谱系：一个来源于日本品种西丰 (例如宁麦9号、扬麦18)，另一个来源于澳大利亚品种Quality (例如碧蚂系列、内乡5号)。对来源于Quality谱系的四个品种的基因测序证实，其 Ym5区域序列与西丰完全一致，表明两个来源的 Ym5可能同源。最后，通过比较不同单倍型在15个农艺性状上的表现，研究发现 Ym5的渐渗并未对产量性状造成明显的负面影响，这为其在育种中的安全利用提供了支持。

讨论与结论

讨论部分总结：分子标记辅助选择可加速抗WYMV品种的选育进程。本研究通过比较基因组学确认了ArinaLrFor也携带 Ym5，并以其序列为参考开发了紧密连锁的分子标记，这些标记虽因序列高度分化限制了其在图位克隆中的应用，但对育种选择极具价值。GWAS中在5DL末端检测到的显著关联峰，经重新比对证实是由SNP探针错误定位到5A所致。对 Ym5起源的分析表明，该片段是一个可能来源于一粒小麦的外源渐渗，这与一粒小麦作为小麦抗病基因 (如 Sr35, Lr63) 供体的历史角色一致，同时也再次凸显了小麦野生近缘种作为抗病基因库的重要价值。在中国育种中，Ym5主要通过西丰和Quality两个亲本被广泛利用，分别影响了南方和北方麦区的品种选育。

研究结论翻译：综上所述，我们鉴定了一个推测来源于外源物种的WYMV抗性基因 Ym5，并开发了与之共分离的标记用于分子育种，为培育抗WYMV的小麦品种提供了有用的资源。