TaMYB72-B和TaGSK3通过TN1的转录和翻译后修饰协同调控小麦分蘖

《The Crop Journal》：TaMYB72-B and TaGSK3 coordinately modulate wheat tillering through transcriptional and post-translational regulation of TN1

　　

摘要： 分蘖数是直接决定小麦（Triticum aestivum L.）谷物产量的关键农艺性状。虽然TN1是分蘖的一个关键正向调控因子，但其调控网络尚未被完全阐明。本研究鉴定出TaMYB72-B和TaGSK3是TN1的汇聚合调控因子，共同微调分蘖数。启动子分析表明TaMYB72-B是TN1的上游转录抑制因子，其过表达减少了分蘖数，证实了TaMYB72-B通过TN1抑制分蘖。独立地，激酶TaGSK3与TN1发生物理相互作用并使其磷酸化，从而降低蛋白稳定性并加速其降解；TaGSK3的过表达同样显著减少了分蘖数。总之，这些发现定义了一个双层调控机制，其中转录抑制和翻译后修饰汇聚于TN1，以精确控制分蘖发育。对全球小麦种质资源的单倍型分析确定TaMYB72-B Hap 1是一种优良单倍型，与分蘖数减少和每穗粒数增加之间的最佳平衡相关，这种组合在现代育种中被优先选择。因此，本研究揭示了一个调控小麦分蘖的新调控模块，并为旨在优化株型和产量的分子设计育种提供了可操作的遗传靶点。

论文解读

研究背景、问题与研究动机

小麦是全球粮食安全的基础，单位面积产量由单位面积穗数、每穗粒数和千粒重三个主要组分决定。其中，分蘖数占据核心地位，它塑造植株结构，决定单位面积的有效穗数，并最终决定产量。因此，解析控制分蘖的分子网络是分子设计育种和突破产量瓶颈的基础。分蘖发育受多层次遗传网络、激素信号通路（包括赤霉素、油菜素内酯和独脚金内酯）以及动态环境信号的调控。在水稻中，TCP转录因子和GSK3激酶是分蘖调控网络的核心。尽管取得了这些进展，但小麦中的调控网络，特别是不同基因和信号通路之间的相互作用，在很大程度上仍未得到探索。这具有重要的农学意义：在现代小麦生产普遍采用的高密度、高投入栽培体系下，过度的分蘖会产生不成比例的无效果穗，从而降低收获指数并限制产量潜力。因此，优化分蘖数，确保足够的成穗分蘖同时减少无效分蘖，是提高产量稳定性的主要育种目标。在小麦中，TCP同源基因TaTB1已被功能验证为通过整合独脚金内酯信号抑制腋芽伸长从而抑制分蘖生长的负调控因子。然而，分蘖调控网络的完整多样性以及小麦GSK3激酶的具体底物仍不清楚。研究人员先前分离出了分蘖数1（tn1）突变体，其编码一个具有跨膜结构域的锚蛋白重复蛋白（ANK-TM），其功能丧失会显著减少分蘖数。这引发了一些基本问题：TN1是否作用于经典TB1通路的下游？其表达是否受一个独特的、TB1非依赖性的转录因子调控？TN1是否受磷酸化介导的翻译后调控？作用于TN1的上游转录和翻译后调控输入仍完全未知，阻碍了对分蘖发育连贯分子图景的认识。为了阐明TN1的上游调控机制并探索其在育种中的应用潜力，研究人员开展了本研究。这项研究有助于深入理解小麦分蘖的分子基础，并为高产育种提供新的遗传资源。

研究方法概要

研究人员利用高度可转化的小麦品种KN199进行遗传转化。为解析TaMYB72-B对TN1的调控，研究人员进行了启动子生物信息学分析、酵母单杂交（Yeast one-hybrid, Y1H）实验、双荧光素酶报告基因检测、电泳迁移率变动分析（Electrophorous Mobility Shift Assay, EMSA）和染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR, ChIP-qPCR）。为验证TaMYB72-B的功能，研究人员构建了TaMYB72-B过表达（Overexpression, OE）的转基因小麦株系，并在北京和河北石家庄的田间条件下评估了其农艺性状。为研究TaGSK3对TN1的翻译后调控，研究人员采用了萤火虫荧光素酶互补成像（Firefly Luciferase Complementation Imaging, LCI）、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）和体内共免疫沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验来验证蛋白互作。通过体外激酶实验和半体外蛋白降解实验验证了TaGSK3对TN1的磷酸化及其对TN1蛋白稳定性的影响。此外，研究人员对来自全球七个主要地理区域的306份六倍体小麦种质（样本队列）进行了TaMYB72基因的单倍型（Haplotype）分析，并结合前期研究中的293份四倍体和六倍体小麦种质数据，研究了其自然变异与农艺性状的关联及地理分布。统计分析方法包括学生t检验和最小显著差法。

研究结果

3.1. TaMYB72-B结合TN1启动子以抑制其表达

为鉴定TN1的上游调控因子，研究人员分析了TN1启动子，发现其含有多个转录因子家族的结合位点，其中在2000 bp的近端启动子内预测到175个潜在的MYB结合位点。酵母单杂交实验证实TaMYB72-B能与TN1启动子的P6片段结合。在小麦和本氏烟草原生质体中的双荧光素酶报告基因实验表明，共表达35S::TaMYB72-B会显著抑制由TN1启动子驱动的荧光素酶活性，证明其具有转录抑制功能。电泳迁移率变动分析进一步显示，TaMYB72-B能与TN1启动子上预测的MYB结合基序（AAGGAATCAA，位于-133至-142 bp）探针特异性结合。染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应结果也显示，在TaMYB72-B过表达株系中，TN1启动子的P6片段被显著富集。这些数据共同确立了TaMYB72-B是TN1的直接转录抑制因子。

3.2. TaMYB72-B负调控分蘖数

为了明确TaMYB72-B在分蘖中的作用，研究人员在KN199背景中构建了由泛素启动子驱动的TaMYB72-B过表达株系。实时定量聚合酶链反应（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）证实了转基因株系中TaMYB72-B的显著上调。与KN199相比，过表达株系表现出分蘖数显著减少，同时株高、穗长、每穗小穗数、每穗粒数、籽粒大小和千粒重也有所下降。在分子水平上，过表达株系中TN1的表达显著下调。这些结果表明，TaMYB72-B通过转录抑制TN1来抑制分蘖。

3.3. TaGSK3磷酸化TN1并降低其稳定性以抑制分蘖数

研究人员进一步探究了TN1的翻译后调控，并聚焦于丝氨酸/苏氨酸激酶TaGSK3。在KN199中过表达TaGSK3或其功能获得型突变体Tagsk3（TaGSK3^E285K，具有增强的蛋白稳定性）均导致田间条件下分蘖数显著减少，其中Tagsk3过表达株系表型变化更严重。萤火虫荧光素酶互补成像、双分子荧光互补和体内共免疫沉淀实验均证实TaGSK3与TN1在体内外发生物理相互作用。体外激酶实验结合Phos-tag SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析表明，TaGSK3能直接在体外磷酸化TN1蛋白的锚蛋白重复结构域（TN1^ANK）。半体外蛋白降解实验显示，在Tagsk3过表达植株的蛋白提取物中孵育时，TN1^ANK蛋白的降解速度明显快于在野生型KN199提取物中。这些数据定义了一个关键的调控环节：TaGSK3通过磷酸化和 destabilizing（降低稳定性）正向调控因子TN1来抑制分蘖数。

3.4. TaMYB72-B和TaGSK3协同调控小麦分蘖数

研究结果支持一个整合模型，即TaMYB72-B和TaGSK3通过不同但互补的机制汇聚于TN1，协同抑制分蘖。在转录水平，R2R3-MYB转录因子TaMYB72-B直接结合TN1启动子抑制其表达。在翻译后水平，TaGSK3磷酸化TN1蛋白，引发其降解，从而削弱其促分蘖活性。这种双层调控架构允许对分蘖发育进行精确的多点控制。

3.5. TaMYB72的自然变异及其与农艺性状的关联

3.5.1. 全球小麦群体中的遗传多样性

为了评估TaMYB72-B作为该调控模块转录调控臂的育种相关性，研究人员在代表七个主要地理区域的306份六倍体小麦种质中表征了其自然变异。TaMYB72-A和TaMYB72-D同源基因高度保守，未检测到纯合单核苷酸多态性，而TaMYB72-B则具有丰富的遗传多样性，因此成为后续单倍型分析的唯一焦点。

3.5.2. 现代小麦中TaMYB72-B的单倍型-性状关联

基于17个SNP位点，TaMYB72-B解析为六个主要单倍型（Hap 1–Hap 6）。Hap 1在全球最为普遍，在亚洲、欧洲、大洋洲和美洲占主导地位。表型评估揭示了显著的单倍型-性状关联：Hap 1结合了较少的分蘖数与较长的穗、更多的每穗小穗数、更高的每穗粒数和更大的千粒重，这是一种对高产结构有利的性状组合。相比之下，Hap 6与更多的分蘖数但更少的每穗小穗数和更低的每穗粒数相关，而Hap 4的千粒重显著高于其他单倍型。

3.5.3. 多倍体小麦中TaMYB72-B Hap 1的进化分析

研究人员将分析扩展到另外293份种质，包括121份四倍体和172份六倍体小麦。值得注意的是，优良单倍型Hap 1仅存在于六倍体材料中，在四倍体小麦中未发现，这表明Hap 1在育种过程中受到了青睐。相反，高分蘖的Hap 6可能起源于四倍体小麦，并未被整合到现代栽培品种中。综上所述，群体水平分析确定TaMYB72-B Hap 1是全球小麦种质中主要的优良单倍型，与分蘖数和穗育性（决定产量的两个关键因素）之间的最佳权衡相关。

讨论与结论总结

讨论部分要点：

本研究揭示了一个多层级的调控模块，其中新颖的转录抑制因子TaMYB72-B和保守的激酶TaGSK3汇聚于TN1，以精确调控小麦分蘖。TaMYB72-B的过表达显著降低了分蘖数，并与TN1的下调相一致。鉴于GSK3激酶的保守作用，研究人员进一步假设TaGSK3可能在翻译后水平调控TN1，这通过蛋白互作和磷酸化实验得到了证实。TaMYB72-B和TaGSK3并非形成简单的线性级联，而是作为独立但汇集的调控层运作——一个抑制TN1转录，另一个加速TN1蛋白降解——共同实现了对分蘖发育的精确、多点控制。这种结构可能比单一机制赋予更大的动态范围和对外部信号的响应能力。未来研究需要通过TaMYB72-B功能缺失突变体以及TN1转基因材料与TaMYB72-B或TaGSK3过表达株系间的杂交进行上位性分析，以严谨确立该模块的遗传层级。此外，将TaMYB72-B的分蘖特异性功能与其对其他农艺性状的多效性影响区分开来，也是未来工作的重要目标。

自然遗传变异是作物改良的基础。研究人员对TaMYB72变异进行的系统调查揭示了一个显著的同源基因特异性模式：TaMYB72-A和TaMYB72-D几乎单态，而TaMYB72-B则具有丰富的多态性。这种模式符合多倍体小麦的常见模型，即一个或两个同源基因维持核心功能，而第三个则作为适应性变异和育种的储存库。单倍型-性状关联分析揭示了由TaMYB72-B介导的显著的产量相关权衡。全球主导的Hap 1将较少的分蘖数与具有更多小穗和每穗粒数的较长穗结合起来，这是一种对产量有利的结构特征。相比之下，Hap 6与更高的分蘖数但降低的穗育性相关，表明在营养分枝和生殖发育之间存在反向的资源分配，最终限制了产量。优良单倍型Hap 1在四倍体材料中的缺失与其在六倍体化后出现或受到正向选择相一致。综合来看，TaMYB72-B Hap 1作为一种支持高产植株结构的优良、历史上被选择的等位基因出现。这些单倍型代表了可用于精准育种的易处理分子标记，为培育具有优化分蘖-穗平衡和更高谷物产量的小麦品种提供了途径。

研究结论（翻译自原文第5节）：

总之，本研究强调了TaMYB72-B和TaGSK3对TN1的汇聚合调控是微调小麦分蘖的关键机制。TaMYB72-B直接抑制TN1转录，而TaGSK3磷酸化TN1以促进其蛋白水解降解，这种双层架构得到了转基因实验的验证，其中任一调控因子的过表达均显著降低了分蘖数。总之，这些发现定义了一个整合转录和翻译后控制以精确调控植株结构的分子框架。优良TaMYB72-B Hap 1等位基因的鉴定进一步证明，该模块为旨在优化分蘖-穗平衡和提高产量的分子设计育种带来了切实的希望。