基于mNGS的“三阶段四层级”脑脊液病原体评估系统的构建：以隐球菌和EB病毒共检案例为切入点

《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Construction of a "Three-Stage and Four-Level" Evaluation System for Cerebrospinal Fluid Pathogens Based on mNGS: Insights from a Case of Co-detection of Cryptococcus and Epstein-Barr Virus

　　洪芳洁 | 姜晓荣 | 吴先斌 | 李少琪
中国广西玉林市玉林中医院实验医学科

**摘要**
背景：脑脊液（CSF）的宏基因组下一代测序（mNGS）为中枢神经系统（CNS）感染的诊断带来了革命性的变化。然而，对于检测到多种病原体的结果解读仍然面临重大临床挑战。
目的：初步探讨所开发的“三阶段、四层次”评估系统在解读mNGS脑脊液检测报告中的应用价值。

**方法**：基于对国内外相关文献的系统性回顾，并结合该领域的实践经验，构建了一个以临床-微生物证据链为中心的多维度“三阶段、四层次”评估系统。本研究通过一个脑脊液中同时检测到隐球菌（Cryptococcus）和Epstein-Barr病毒（EBV）的案例，探讨了该系统的应用价值。

**结果**：该系统有效整合了多源信息，有助于准确且分层地解读mNGS结果。它成功区分了隐球菌作为致病因子和EBV作为潜伏病原体。因此，患者及时接受了抗真菌治疗，症状逐渐改善，预后良好。

**结论**：本病例初步证明，“三阶段、四层次”评估系统为解读mNGS脑脊液多重病原体检测结果提供了一个标准化和可操作的框架，在精确区分病原体类型方面显示出初步价值；然而，仍需通过更大样本量进行进一步验证。

**1. 引言**
中枢神经系统（CNS）感染性疾病是指由细菌、病毒、真菌或寄生虫等病原体侵入脑实质、脑膜或脊髓引起的炎症性疾病[1]。这些疾病通常起病急骤，进展迅速，需要及时诊断和治疗以防止严重后遗症[2]。它们的死亡率相对较高，且致病因素的多样性给诊断带来了困难。传统的检测方法可能无法识别罕见或未知的病原体，从而导致漏诊或误诊[3]。mNGS在临床实践中的应用使得能够快速准确地检测出多种病原体（病毒、细菌、真菌、寄生虫），显著提高了CNS感染的诊断率[4]。然而，这项技术也带来了一个挑战：“检测到”并不等同于“具有致病性”[5]。尽管脑脊液是一种相对无菌的体液，使得mNGS结果解读比其他样本更为简单，但仍存在一些难题[6]：（1）如何科学设定阈值以区分真实感染与背景噪声或试剂污染？（2）如何解读序列读取量低和/或相对丰度低的病原体，尤其是潜伏病原体？

**2. “三阶段、四层次”评估系统的构建**
本研究构建的“三阶段、四层次”评估系统主要基于夏伟星团队进行的大规模前瞻性病例系列研究（包含213个样本[7]），并结合了中国血液学会抗感染研究小组中血液学、微生物学和mNGS技术专家的共识[8]。该共识涵盖了临床指征、样本采集、质量控制及结果解读等方面，有助于明确mNGS检测的医学指征，优化报告解读，并为全球实践提供参考。其构建和应用流程如下：

**2.1 第一阶段：技术可靠性评估**
该阶段首先确认样本质量符合要求，然后使用对照组进行背景减法处理，定义基因组覆盖范围，并从三个维度（序列读取数、相对丰度和重复性）判断结果的可靠性。核心目标是排除污染，确保检测数据的真实性和有效性，同时完成分析后的质量控制闭环。
① 对照背景减法：必须确保试剂空白样本和阴性对照样本中未检测到相应病原体。如果在对照样本中检测到相同病原体，则直接判断为检测污染，并排除在后续评估之外。
② 序列读取值的临界值确定：根据病原体类别（如真菌、细菌、病毒）设置不同的阈值。阈值设定综合考虑了技术性能因素（物种特异性读取数[SSRN]、基因组覆盖均匀性、背景基线、相对丰度）和临床因素（样本类型、宿主免疫力），并根据实验室性能验证进行动态调整。本实验室预设的报告阈值如下：
- 细菌/真菌阈值：> 3次读取；由于真菌的细胞壁破坏效率较低且可检测序列数量有限，漏诊的后果较为严重，因此优先提高检测灵敏度，采用较低的阈值以避免假阴性结果。
- 病毒阈值：> 5次读取；这表明病毒提取效率较高，但潜伏感染较为常见，低水平序列可能导致假阳性，因此优先考虑特异性，采用稍高的阈值以减少假阳性。
- 相对丰度解释：样本中检测到的特定属或物种微生物的比例。较高丰度表明其占比较大。
- 重复性评估：对同一样本进行重复测序，或在24小时内重复取样/测序。如果结果一致（即检测到的病原体相同且相应读取数波动<20%），则认为检测结果可信，质量控制视为满意。
- 分析后质量控制验证：重点检查数据和质量控制，确保数据过滤和比对参数设置正确，排除低质量数据的干扰。在报告发布前，对整个检测过程、质量控制数据和判断依据进行全面审查。

**2.2 第二阶段：临床-微生物相关性分析**
该阶段是系统的核心，需要临床医生和实验室人员的共同参与。使用评分表从多个维度评估超过初步筛选阈值的每种病原体：

- **维度1：宿主因素（权重0.3）**：免疫状态（HIV感染、器官或造血干细胞移植、长期使用免疫抑制剂等）是评估机会性感染的关键因素；流行病学和暴露史（如前往流行地区、动物接触史、职业暴露等）。
- **维度2：病原体属性（权重0.3）**：被广泛认为是CNS常见致病物的病原体（如结核分枝杆菌、新型隐球菌）得分较高；常见的环境或皮肤定植菌（如痤疮丙酸杆菌）得分较低；潜伏病毒（如EBV、CMV）的致病性排名需综合考虑其他维度；序列特征（特定读取数、基因组覆盖度和均匀性）。高覆盖率和均匀分布的序列提示病原体可能处于活跃复制状态。
- **维度3：与临床表现和常规检查的一致性（权重0.4）**：症状和体征是否符合该病原体的典型或非典型表现；脑脊液常规检查和生化指标（淋巴细胞主导提示病毒、结核或真菌感染；中性粒细胞主导提示细菌感染）；影像学检查（头颅MRI/CT显示特征性改变）；传统微生物学检查（涂片、培养、抗原/抗体检测或特异性PCR结果是否阳性）。这些构成了最有力的佐证。

为了便于临床操作和标准化应用，上述三维评估被转化为定量评分系统。各维度的具体评分标准和综合评分标准详见表1。

**表1. mNGS病原体在脑脊液中临床意义的多元加权评分标准**
| 维度（权重） | 评估标准 |
| -------- | ---------- |
| A. 宿主因素（0.3） | 严重免疫抑制：HIV感染（CD4<200）、器官移植后、长期高剂量皮质类固醇或免疫抑制剂治疗等 | 3
| 中度免疫抑制：糖尿病、慢性肝肾疾病、需要免疫抑制治疗的自身免疫疾病等 | 2 |
| 轻度免疫缺陷：老年人、营养不良者、近期感染者或有流行病学暴露史但无明确免疫抑制者 | 1 |
| 正常免疫功能，无特定暴露史 | 0 |

- **B. 病原体属性（0.3）**：
| 高致病性病原体（如结核分枝杆菌和新型隐球菌） | 3 |
| 中度致病性/机会性细菌（如肺炎链球菌、EBV、CMV等；或序列特征表明活跃复制） | 2 |
| CNS低致病性/常见定植菌（如凝固酶阴性葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌） | 1 |
| 无致病性/常见背景细菌，序列特征表明低覆盖或不均匀分布 | 0 |

- **C. 与临床表现和常规检查的一致性（0.4）**：
| 临床表现、脑脊液常规/生化检查、影像学发现和传统微生物学检查结果均高度符合该病原体的典型感染特征 | 3 |
| 上述四个标准中至少满足3项且无明显矛盾 | 2 |
| 其中1和2项一致，部分矛盾或发现非典型 | 1 |
| 上述四个项目均不符合或存在明显矛盾 | 0 |

**计算公式：** 总分 = A×0.3 + B×0.3 + C×0.4

**临床分级**：根据综合评分标准进行分级：
- ≥2.0 → 一级（确定病原体）：致病性证据充分，建议针对性治疗。
- 1.5–1.9 → 二级（高度可能致病）：致病性可能性高，应立即开始治疗并动态监测。
- 1.0–1.4 → 三级（潜在相关/定植/再激活）：致病性可能性低，需进行全面临床评估。
- <1.0 → 四级（背景核酸/污染）：致病性极低或不存在，致病因子更可能是背景细菌或污染。

**2.3 第三阶段：综合决策和分层确定**
整合前两个阶段的信息，为每种病原体确定最终的临床意义等级并提出管理建议：
- 一级（确定病原体）：病原体是公认的CNS病原体，并通过金标准传统微生物学方法（涂片、培养、PCR等）或高度特异性的检测方法确认。建议开始针对性治疗。
- 二级（高度可能致病）：病原体是公认的或常见的CNS病原体，虽未通过传统方法确认，但mNGS读取数高，且结果与患者的临床表现、宿主因素和其他检测结果高度一致，无法用其他原因解释。强烈建议对该病原体进行经验性治疗。
- 三级（潜在相关/定植/再激活）：检测到的病原体可能是致病因素，也可能是偶然发现（如潜伏病毒的再激活、呼吸道定植菌进入血液）。读取数通常较低，临床相关性不明确，或存在更明确的一级/二级病原体。无需立即治疗，但需密切监测临床反应并重新检查相关指标（如重复mNGS）。
- 四级（背景核酸/污染）：高度怀疑为实验过程污染、样本采集污染或非存活病原体的残留核酸，无临床意义。忽略该结果。

**3. 病例介绍和系统应用**
2025年7月14日，一名68岁男性因“突发头晕伴头痛一天”就诊于玉林中医院。既往病史无异常，无HIV感染、器官移植或长期使用免疫抑制剂史。入院检查：体温36.4°C，意识清醒，脑膜征阴性。实验室检查：血常规显示轻度白细胞增多；HIV抗体阴性。7月21日，患者头痛加重，伴视觉幻觉和言语行为异常，临床状况显著变化。头颅MRI平扫和增强扫描显示：头部和颈椎脑膜多处异常增强，提示感染性病变。7月23日首次腰椎穿刺：脑脊液压力170 mmH2O，外观清澈；白细胞计数为226×10^6/L（参考范围：8×10^6/L），约高出上限2725%；脑脊液蛋白水平为2699 mg/L（参考范围：200–400 mg/L），约高出上限575%；脑脊液葡萄糖水平为1.01 mmol/L（参考范围：2.5–4.5 mmol/L），低于下限约60%。脑脊液细菌培养和隐球菌印度墨水涂片均为阴性。7月26日，根据关键mNGS结果进行针对性验证，第二次腰椎穿刺结果呈隐球菌印度墨水涂片、荚膜抗原检测和真菌培养阳性。进一步进行EBV特异性检测：EBV DNA定量PCR结果<500拷贝/μL。

**3.3 mNGS检测和报告**
脑脊液被送检进行mNGS检测。报告显示检测到：新型隐球菌（21次读取，相对丰度5.71%）和Epstein-Barr病毒（9次读取，相对丰度69.24%）。其他微生物的检测结果极低，被认为是可疑或人体共生微生物群。3.3. “三阶段、四级别”系统的应用。请参见图1以了解简化的流程图。

第一阶段（生物信息学过滤）：两种病原体均超过了实验室预设的报告阈值（细菌/真菌 >3，病毒 >5），从而进入下一阶段。3.3.1. 第二阶段（临床-微生物相关性分析）对于新生隐球菌：这是一种公认的中枢神经系统（CNS）病原真菌，具有很高的致病性。其检测数量为21个，相对丰度为5.71%。第一步是评估患者的免疫状态。免疫抑制严重的人员通过路径A进行相关性分析；免疫抑制轻微或免疫功能正常的人通过路径B进行相关性分析。该患者没有典型的免疫抑制病史，但临床表现与之相符（头痛逐渐加重、视觉幻觉、行为异常）。影像学检查显示明显的脑膜增强，支持隐球菌感染的诊断。随后的特异性实验室确认测试结果为阳性，与临床表现高度一致。对于EB病毒：这种嗜神经性的潜伏病毒，在免疫调节失常时可以被检测到。其检测数量相对较低。患者没有传染性单核细胞增多症的临床表现，也没有明确的免疫缺陷，MRI检查也没有特征性异常（例如颞叶）。脑脊液细胞分类显示单核细胞占多数，这在病毒性脑炎中可见，但并不具有特异性。因此，与临床表现的一致性较低。

基于上述分析，应用加权评分系统进行定量评估：新生隐球菌：宿主因素 score：1 × 0.3 = 0.3；病原体属性 score：3 × 0.3 = 0.9；与临床表现和常规检查的一致性：3 × 0.4 = 1.2；总分为2.4分（明确病原体）。立即开始抗真菌治疗。EB病毒：宿主因素 score：1 × 0.3 = 0.3；病原体属性 score：2 × 0.3 = 0.6；与临床表现和常规检查的一致性：1 × 0.4 = 0.4；总分为1.3分（潜在相关/定植/重新激活）。该感染被归类为潜伏性，不推荐抗病毒治疗。3.3.2. 第三阶段（综合决策和分级）根据“金标准确认”和“强临床关联”的标准，新生隐球菌被分类为I级（明确病原体）。由于EB病毒的检测数量较低，缺乏特异性临床特征以及确认测试结果（DNA <500个拷贝），决定立即开始标准联合抗真菌治疗（脂质体两性霉素B加氟胞嘧啶以针对I级病原体新生隐球菌）。对于III级病原体EB病毒，则不进行抗病毒治疗。

3.4. 治疗结果和随访经过两周的标准治疗后，患者的头痛和头晕症状明显缓解。躁动和谵妄症状消失。患者病情稳定，并在服药后出院。在出院后五个月的随访期间，没有出现感染症状的复发。神经系统功能恢复到正常水平，表明预后良好。

4. 讨论许多研究和病例报告[[9], [10], [11], [12]]已经证明了mNGS在优化传染病的精准预防、治疗和病原体追踪方面的显著效果。然而，鉴于mNGS能够覆盖几乎所有可能的病原体[13]，核心挑战在于准确区分主要致病因子和定植或共检测到的微生物。传统的微生物学方法通常不足以全面检测神经侵袭性病原体。mNGS不仅可以有效筛查与CNS感染相关的病原体，还能准确识别罕见或新型病原体，显著弥补了传统技术的不足[14]。解读单一病原体的mNGS结果相对简单，但解读多重病原体的报告仍然是临床实践中的主要关注点和难点。在一项为期一年的多中心前瞻性研究[15]中，Charles Chiu团队在美国八家医院对204名原发性脑炎、脑膜炎或脊髓炎患者的脑脊液样本进行了mNGS分析，为脑脊液宏基因组下一代测序（mNGS）的病原体识别标准制定了参考标准，为标准化解读提供了重要依据。同样，其他研究人员也进行了前瞻性多中心病例系列研究[16]，对20家中国医院的276名脑炎或脑膜炎患者的脑脊液样本进行了mNGS分析，基于20M标准化测序数据量内的物种特异性检测数量（SSRN）提出了解释方法，进一步细化了mNGS的临床应用规范。该研究构建的系统核心价值在于建立了从“技术报告”到“临床诊断”的标准化桥梁，是对现有CNS感染管理指南的重要补充和改进。它实现了“以免疫状态为首要维度的阶段性精准解读；分层治疗以明确病原体的临床优先级；以及多维信息整合”的目标。通过强制执行分阶段推理，该系统有助于减少临床医生在面对阳性结果时可能做出的直觉性误判。第一阶段依赖于实验室质量控制，这是技术可靠性的基础。第二阶段引入了多维度加权评分，将客观数据与主观经验相结合进行系统评估。第三阶段生成明确的行动指南。在本案例中，如果没有这个系统的指导，EB病毒的检测可能会引发病毒性脑膜脑炎的怀疑，可能导致不必要的抗病毒药物使用，增加医疗成本和潜在毒性。

4.1. 局限性和未来展望本研究仅代表单一病例的初步探索。评估系统需要通过多中心、大样本的前瞻性临床试验（包括成功和失败病例）进行进一步验证和优化，以确定所有维度的更精确加权分数。此外，其普遍性需要根据不同医疗资源水平的机构进行调整。未来的研究方向包括：（1）整合宿主免疫反应基因表达谱以帮助区分感染和炎症；（2）开发基于AI的自动化辅助分级系统以提高解读效率和一致性；（3）基于该系统进行临床路径研究，最终改善患者预后。

5. 结论本研究初步探索了一种适用于脑脊液mNGS报告的“三阶段、四级别”临床分级评估系统。通过结构化的三步流程，该系统有效地整合了实验室数据与临床信息，能够科学区分主要致病因子和次要偶然信号。在同时检测到新生隐球菌和EB病毒的复杂病例中系统应用表明，该系统可以提高mNGS报告的临床解读质量，指导精准治疗决策，并有助于减少误诊和过度治疗。该系统为CNS感染领域mNGS技术的标准化和精准应用提供了有价值的参考框架。

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图1. 分级评估系统简化流程图

解释文字：第1阶段：技术可靠性评估：进行生物信息学过滤，脑脊液mNGS同时检测到新生隐球菌和EB病毒。第2阶段：临床-微生物相关性分析：第一步是评估免疫状态，随后使用A/B路径进行相关性分析。第3阶段：综合决策和分级：整合前两阶段的信息，为每种病原体分配最终的临床意义等级并制定管理建议。HSV（单纯疱疹病毒）；VZV（水痘-带状疱疹病毒）；HHV-6（人类疱疹病毒6型）；PML（进行性多灶性白质脑病）。

缩写：mNGS宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing）；CSF（脑脊液，cerebrospinal fluid）；CNS（中枢神经系统，central nervous system）；EBV（Epstein-Barr病毒，Epstein-Barr virus）；CMV（巨细胞病毒，cytomegalovirus）；PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）；SSRN（物种特异性检测数量，species-specific read numbers）；AI（人工智能，Artificial Intelligence）。

工具使用声明：在准备本手稿期间，作者使用了DeepAI和WPS AI进行英文润色和语法检查。所有由AI生成或修改的文本均经过作者仔细审核、重写，并最终得到作者的确认，作者对整个出版物的内容负全责。

资金声明：本研究未接受任何资助机构的特定资助。

伦理批准和患者同意：本研究使用了现有数据，并获得了玉林中医院伦理委员会的批准，免去了知情同意的要求（批准编号：[2026LW001]）。所有患者数据均经过匿名处理以保护隐私。本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》的原则。

作者贡献声明：Que Hongfang负责概念化、方法学、软件、验证、正式分析、数据整理、手稿撰写和可视化。Li Shaochi（通讯作者）负责研究的构思、资源提供、研究监督、项目管理和手稿审稿及编辑。Jiang Xiaorong负责部分数据及图表分析，以及手稿审稿和修订。Wu Xianbin参与了一些调查、数据收集和手稿审稿。所有作者参与了结果讨论和分析，并审核并批准了最终手稿。

作者贡献声明：Que Hongfang：撰写 - 原始草稿、可视化、验证、调查、正式分析、数据管理、概念化。Jiang Xiaorong：撰写 - 审稿与编辑、正式分析。Wu Xianbin：撰写 - 审稿与编辑、调查。Li Shaochi：撰写 - 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学。