miR-128–1在调节抗氧化NRF2通路中的潜在作用：来自流行病学和毒理学证据的见解

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Potential role of miR-128–1 modulating antioxidant NRF2 pathway in linking acrylamide exposure with type 2 diabetes risk: Insight from epidemiological and toxicological evidence

　　霍志英|宋家豪|范利亚阳|万书慧|游晓洁|张永芳|刘青|雷洪|熊雅妮|陈鹏飞|王菲菲|陈卫红|王斌
中国湖北省武汉市华中科技大学同济医学院公共卫生学院职业与环境健康系，430030

**摘要**
miR-128-1是一种新兴的2型糖尿病（T2D）治疗靶点，同时也是抗氧化主因子红系相关因子2（NRF2）的靶向转录后抑制剂。目前尚不清楚miR-128-1在将丙烯酰胺（ACR）这种全球性关注的、终生暴露的污染物与T2D联系起来中的作用机制，这一问题亟待阐明。通过流行病学研究，我们从武汉-珠海队列中招募了482名中国成年人，利用广义线性模型评估了尿液中ACR暴露生物标志物（N-乙酰-S-[2-氨基甲酰乙基]-L-半胱氨酸 [AAMA]、N-乙酰-S-[2-氨基甲酰-2-羟基乙基]-L-半胱氨酸 [GAMA]、AAMA+GAMA [ΣUAAM] 和 GAMA/AAMA）与血浆中miR-128-1水平之间的关联，以及miR-128-1在ACR与T2D关系中的中介作用。从毒理学角度来看，我们用ACR和miR-128-1模拟物/抑制剂处理INS-1细胞24小时，以探讨miR-128-1调节NRF2通路对β细胞功能氧化损伤的机制，这种损伤表现为葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）下降。研究发现，ACR暴露生物标志物与miR-128-1（β系数：0.63–1.45；P < 0.05）及T2D（比值比：1.42–4.60；P < 0.05）之间存在线性正相关关系；miR-128-1本身也与T2D（比值比：1.34；P < 0.05）相关。miR-128-1的升高解释了ACR与T2D关系的18.39–24.54%。经ACR处理的INS-1细胞表现出NRF2通路激活以及GSIS下降，同时miR-128-1水平和氧化应激（活性氧和丙二醛）也升高。与仅用ACR处理的INS-1细胞相比，用ACR+miR-128-1模拟物/抑制剂处理的细胞中NRF2及其下游抗氧化因子的mRNA和蛋白质水平变化显著，氧化应激水平则有不同变化。总体而言，miR-128-1可能在ACR暴露与T2D风险之间起中介作用，可能涉及对NRF2通路的靶向抑制和β细胞功能的氧化损伤。

**1. 引言**
2型糖尿病（T2D）是一种严重的代谢性疾病，其特征是由于胰腺β细胞功能障碍（如葡萄糖刺激的胰岛素分泌[GSIS]下降）导致的持续高血糖，并伴有胰岛素抵抗（Lu等人，2024年）。T2D占全球死亡和残疾原因的第八位，2021年有5.29亿人患有糖尿病，医疗费用达到9660亿美元；预计到2050年患病人数将增至13.1亿，医疗费用将达10540亿美元，对全球健康和经济造成巨大负担（Ong等人，2023年）。除遗传因素外，环境污染已成为T2D的主要诱因（Ong等人，2023年；Xu等人，2022年）。因此，识别导致T2D的环境污染物并阐明其潜在机制对于控制这种全球性流行病至关重要。丙烯酰胺（ACR）是一种具有内分泌干扰特性的全球性污染物，在化工产业中广泛应用，日常生活中普遍存在，如烟草烟雾、家庭用水、消费品（如化妆品、纺织品、面包和塑料），以及日常饮用品和食物（如咖啡及相关产品、薯片及相关土豆制品、吐司、饼干和谷物）中（Wang等人，2024年），导致人们通过摄入、吸入和皮肤接触长期暴露于ACR中，引发了全球健康警报（Bu?ová等人，2020年；Wang等人，2022年；Stadler等人，2002年；Kapp，2002年）。世界卫生组织呼吁对ACR的健康危害进行进一步研究（Kapp，2002年），并且已在动物实验中发现其致糖尿病作用（如高血糖、葡萄糖不耐受、胰腺β细胞损伤等）（Yue等人，2020年；Sto?i?等人，2018年；Quan等人，2022年），氧化应激被认为是关键机制（Markovi? Filipovi?等人，2022年）。尽管我们早期研究表明普通成年人日常暴露于ACR与氧化应激介导的高血糖有关（Wang等人，2020a），但目前关于ACR暴露与T2D关联的证据仍有限且存在争议（阳性/阴性/无关联），其潜在机制仍不明确。需要进一步研究ACR暴露与T2D之间的关联及其背后的氧化应激机制。

越来越多的证据表明， microRNAs（miRNAs）是一种小的非编码RNA，通过与目标基因的3′-非翻译区（3′-UTR）杂交来发挥负向转录后调控作用，通过调节红系相关因子2（NRF2）的细胞氧化应激信号通路来影响细胞的氧化状态。NRF2是最重要的内源性抗氧化调节因子，对胰腺β细胞的数量和功能起关键作用，其功能障碍可能与T2D有关（Ashrafizadeh等人，2020年；Vezza等人，2021年；Baumel-Alterzon等人，2021年；Bhakkiyalakshmi等人，2015年；Friedrich和Krenning，2020年）。在氧化应激条件下，游离形式的NRF2和新合成的NRF2会在核内积累并移位，与抗氧化响应元件结合，激活下游抗氧化基因（如血红素加氧酶1 [HO-1] 和NADPH醌氧化还原酶1 [NQO1]）的表达，从而发挥抗氧化作用（Baumel-Alterzon等人，2021年）。在众多miRNAs中，miR-128-1是一种高度保守的miRNA，其成熟形式miR-128-3p具有最高的表达量和广泛的效应，已成为T2D的新治疗靶点，因为最新研究表明miR-128-1抑制可改善全身葡萄糖稳态（Kiel等人，2024年；Wang等人，2020b）。鉴于NRF2是miR-128-1的靶基因（Jiang等人，2024年），且miR-128-1可被环境污染物上调（Vrijens等人，2015年），我们推测miR-128-1可能在ACR暴露与T2D风险之间起中介作用，涉及对NRF2通路的靶向调控和β细胞功能的氧化损伤。为此，我们进行了这项综合流行病学和毒理学研究，评估了中国普通成年人尿液中ACR暴露生物标志物、血浆miR-128-1与T2D之间的关联，以及miR-128-1在这些关联中的中介和联合作用，并在INS-1细胞中探讨了miR-128-1调节NRF2通路在ACR相关β细胞氧化损伤中的潜在机制。我们旨在研究miR-128-1在ACR暴露与T2D风险之间的潜在作用。

**2. 材料与方法**
2.1. 研究人群
研究人群来自武汉-珠海队列的第二次随访（2017–2018年），该队列招募了在中国城市（武汉或珠海）居住超过5年的成年人作为研究对象。有关该队列的详细信息已发表（Song等人，2014年；Song等人，2026a）。参与者接受了身体检查和面对面调查，提供包括年龄、体重指数（BMI）、性别、饮酒情况、吸烟状况、饮食（谷物；粗粮；水果和蔬菜；肉类；鱼类产品；鸡蛋和牛奶；腌制和熏制食品）、体力活动、教育水平、收入以及糖尿病家族史等协变量数据（详见文本S1）。在检查当天收集的晨尿和空腹外周血分别冷冻保存在-20°C和-80°C。在这项研究中，从没有严重心血管/肺部疾病或癌症的参与者中随机选择了482名提供完整ACR暴露、T2D结果和协变量数据的参与者，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测定血浆中miR-128-1的水平。使用G*Power（版本3.1.9.7）进行的事后功效分析显示，482名参与者的样本具有足够的统计功效（1-β > 0.85）（Wang和Ji，2020年）。所有参与者均签署了知情同意书。华中科技大学同济医学院的伦理与人类研究委员会批准了该项目（项目编号：2011–17）。

2.2. ACR暴露生物标志物的测定
根据已发表的研究（Wang等人，2022年；Wang等人，2020a；Alwis等人，2012年；Boettcher等人，2005年；Wang等人，2020c；Wang等人，2021年；Wan等人，2024年），通过液相色谱-质谱（LC-MS）测定了尿液中的N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酸（AAMA；直接由ACR代谢产生的生物标志物）、N-乙酰-S-(2-氨基甲酰-2-羟基乙基)-L-半胱氨酸（GAMA；由ACR生物转化而来的更具遗传毒性的环氧产物）、AAMA+GAMA（ΣUAAM）和GAMA/AAMA作为可靠的ACR暴露生物标志物。分析方法和质量保证/控制的详细信息见文本S2。GAMA的检测限（LODs）为1.5 ng/mL，AAMA的检测限为0.6 ng/mL。低于LODs的浓度按LODs的√2值进行调整。测量得到的浓度最终会校正尿肌酐（Cr）的影响，使用BS-200全自动生化分析仪（深圳美迪仪公司，中国）进行测定，并以μg/mmol Cr表示。

2.3. 血浆miR-128-1的测定
具体操作如下：血液样本收集在含有EDTA的管中，在4°C下以3000 rpm离心10分钟。所得血浆分别保存在-80°C直至分析。RNA提取时，将血浆样本在冰上解冻，使用Qiagen公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit按制造商说明书进行提取。随后使用Qiagen公司的miScript II RT Kit进行逆转录，再利用相应的miScript SYBR Green PCR Kit进行qRT-PCR。序列详细信息见表S1。miR-128-1的表达值通过2^-ΔCT方法（Livak和Schmittgen，2001年）相对于cel-miR-39–3p进行标准化，在后续统计模型中考虑了批次效应。

2.4. T2D的确定
符合以下任一标准的参与者被诊断为T2D：空腹血浆葡萄糖≥7.0 mmol/L或126 mg/dL，自我报告使用抗糖尿病药物，或自我报告被医生诊断为T2D（美国糖尿病协会专业实践委员会，2024年；Yu等人，2024年）。空腹血浆葡萄糖的测量使用Randox Laboratories公司的RX Daytona全自动生化分析仪进行（Yang等人，2026年；Zhang等人，2025年）。

2.5. 细胞培养和转染
本研究使用INS-1细胞系，因为该细胞系具有与初级胰腺β细胞相似的内分泌功能，并对氧化应激高度敏感，是研究氧化应激介导的β细胞损伤和功能障碍的理想模型，广泛用于糖尿病研究的体外实验（Zhuang等人，2025年）。INS-1细胞（Cyagen公司，中国）在37°C、5% CO?条件下培养于完全培养基中（详见文本S3）。选择的ACR处理剂量、实际ACR暴露水平以及参考文献和初步实验结果均被考虑在内。根据先前的毒理学研究（Pan等人，2015年；Komoike和Matsuoka，2019年）和我们的初步实验，选择ACR浓度（0、0.5、1、2和4 mM）用于INS-1细胞处理。在干预实验中，分别使用Lipofectamine 3000（Invitrogen公司，美国）将miR-128-1模拟物（50 nM）、抑制剂（100 nM）和相应的阴性对照（NC）转染到细胞中（暴露/未暴露于ACR [2 mM]）24小时。转染效率通过qRT-PCR定量miR-128-1的表达来验证。

2.6. 细胞活力测定
使用Dojindo公司的Cell Counting Kit-8（CCK-8）根据制造商指南评估细胞活力。简要来说，将细胞在不同浓度的ACR处理不同时间后，用10 μl/well的CCK-8在37°C下孵育1.5小时，然后使用Microplate Reader（Spark 2000，TECAN公司，奥地利）测量450 nm处的吸光度。

2.7. 活性氧（ROS）测定
使用Beyotime公司的活性氧检测试剂盒测定细胞内ROS水平。简要来说，将细胞在37°C下与10 μM DCFH-DA探针孵育20分钟，然后用无血清培养基洗涤三次以去除细胞外的探针，使用Microplate Reader（Spark 2000，TECAN公司，奥地利）测量荧光强度（激发波长488 nm/发射波长525 nm）。

2.8. 丙二醛（MDA）测定
使用Beyotime公司的脂质过氧化MDA检测试剂盒测定MDA水平。将样品与新鲜配制的MDA检测工作液混合，加热至100°C 15分钟后冷却并离心，取200 μl上清液在532 nm处使用Microplate Reader（Spark 2000，TECAN公司）测定吸光度。

2.9. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）测定
培养的细胞先用Krebs-Ringer Bicarbonate HEPES（KRBH）缓冲液冲洗一次，然后在KRBH中孵育1.5小时。接着用含有3.3 mM或16.7 mM葡萄糖的KRBH刺激细胞1.5小时，收集上清液使用Mercodia公司的Rat Insulin ELISA Kit进行胰岛素定量。

2.10. qRT-PCR测定
使用Trizol（Invitrogen公司，美国）从INS-1细胞中提取RNA。miR-128–1、NRF2 mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA的表达水平通过qRT-PCR进行量化，然后使用U6或β-actin进行归一化，最后使用2?ΔΔCt方法计算（Livak和Schmittgen，2001）。所有引物序列（表S1）由Ribobio（中国广东）和Servicebio（中国武汉）合成。

2.11. 西部印迹（Western blot）
Western印迹主要检测NRF2及其典型下游目标基因NQO1和HO-1的蛋白质表达水平，这些基因均广泛参与氧化应激，并被认作抗氧化标志物（Morgenstern等人，2024）。蛋白质从INS-1细胞中提取，并使用BCA蛋白质测定试剂盒（Beyotime，上海，中国）进行定量。20微克的蛋白质在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（罗氏，德国）。膜在4°C下过夜与NRF2（1:1000，CST，美国）、HO-1（1:1000，CST，美国）、NQO1（1:1000，Huabio，中国）和β-actin（1:1000，Servicebio，中国）的一抗孵育。孵育后，使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（1:4000，Absin，中国）进行1小时的孵育，然后用电化学发光（ECL）试剂（Thermo Fisher，美国）检测蛋白质。使用ImageJ（版本1.8.0）分析条带强度。

2.12. 双萤光素报告基因检测
将NRF2 3′-UTR的野生型（WT）和突变型（MT）插入GP-miRGLO载体（Jinkairui，中国）中，分别生成GP-miRGLO-NRF2-WT和GP-miRGLO-NRF2-MT报告基因构建体。293T和INS-1细胞与miR-128–1模拟物或NC以及GP-miRGLO-NRF2-WT或-MT报告基因载体共转染24小时。使用双萤光素报告基因检测试剂盒（Jinkairui，中国）测量萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性。

2.13. 统计分析
所有细胞实验至少进行三次独立的生物学重复。细胞实验数据以平均值±标准误差表示。对于总体数据，正态分布的连续变量、偏态分布的连续变量和分类变量分别以平均值±标准差（SD）、P50（P25，P75）和数量（百分比）表示。组间差异通过单因素方差分析、Kruskal-Wallis检验和卡方检验进行适当测试。ACR暴露生物标志物和血浆miR-128–1数据分别进行自然对数（ln）和对数2（log?）转换，以改善正态分布（Hong等人，2025）。广义线性模型用于评估连续和四分ACR暴露生物标志物与miR-128–1的关联（估计β系数和95%置信区间[CI]），以及连续和四分ACR暴露生物标志物与miR-128–1与普遍存在的T2D的关联（估计比值比[OR]和95%置信区间[CI]）。使用限制性三次样条（RCS）模型（Li等人，2025）（R包“rms”）测试关联的线性/非线性，分别在ACR暴露生物标志物的第5、50和95百分位设置3个结点（Crippa等人，2019）。根据人群特征（年龄、性别、BMI、吸烟状态等）进行分层分析，并测试修饰效应对上述关联的影响。

通过进行中介分析以及交互作用分析，研究了miR-128–1在ACR暴露生物标志物与T2D关系中的作用。中介分析假设时间先后顺序（即暴露先于中介，中介先于结果），以及暴露-中介、暴露-结果和中介-结果关系中没有未测量的混杂因素。然而，鉴于流行病学数据的横断面性质，这些假设无法完全验证，这是此类设计中介分析的一个公认限制（Maxwell和Cole，2007）。在本研究中，通过将ACR暴露生物标志物对T2D的总体效应分解为直接效应（不由miR-128–1解释）和中介效应（由miR-128–1解释）来执行中介分析（R包“mediation”）（Song等人，2026b）。miR-128–1的中介比例计算为中介效应相对于总体效应的百分比（MacKinnon等人，2007）。为了研究ACR暴露生物标志物和miR-128–1对T2D的交互/联合效应，根据Liang等人（2024，Wang等人，2026）的分类将受试者分为四组。构建敏感性分析模型以评估结果的稳健性。我们还调整了Cr作为协变量，而不是使用Cr校正后的暴露水平来评估ACR暴露生物标志物与miR-128–1和T2D的关联。所有模型都调整了混杂因素/协变量，包括年龄、性别、BMI、饮酒量、教育水平、饮食、吸烟状态、收入、批次效应（仅当miR-128–1参与模型时）、体力活动、糖尿病家族史（仅当T2D参与模型时）和城市，根据发表物回顾和统计/生物学考虑（VanderWeele，2019）。所有分析均使用R（版本4.2.3）和GraphPad Prism（版本8.4.2）进行。双侧P<0.05表示统计学显著性。

3. 结果
3.1. 人群特征
表1显示了482名受试者的特征，其中大多数为女性，平均年龄为57.43岁。AAMA、GAMA、ΣUAAM和GAMA/AAMA的中位水平分别为4.42 μg/mmol Cr、0.53 μg/mmol Cr、5.03 μg/mmol Cr和0.12。与没有T2D的受试者相比，患有T2D的受试者的年龄、BMI、miR-128–1、AAMA和ΣUAAM的水平更高，男性比例和吸烟者比例也更高。

表1. 受试者的基本特征
所有受试者（N=482）
没有T2D的受试者（n=408）
患有T2D的受试者（n=74）
年龄，岁 57.43±6.59 57.05±6.57 59.53±6.35
BMI，kg/m2 24.49±3.25 24.36±3.20 25.22±3.44
0.003
性别 0.013
男性 132（27.39） 103（25.25） 29（39.19）
女性 350（72.61） 305（74.75） 45（60.81）
吸烟状态 0.048
吸烟者 58（12.03） 44（10.78） 14（18.92）
非吸烟者 424（87.97） 364（89.22） 60（81.08）
饮酒量 0.065
饮酒者 76（15.77） 59（14.46） 17（22.97）
不饮酒者 406（84.23） 349（85.54） 57（77.03）
体力活动 0.799
活跃 293（60.79） 249（61.03） 44（59.46）
不活跃 189（39.21） 159（38.97） 30（40.54）
教育水平 小学及以下 104（21.58） 90（22.06） 14（18.92）
中学 334（69.29） 283（69.36） 51（68.92）
大学及以上 44（9.13） 35（8.58） 9（12.16）
收入，元/年 <4000 232（48.13） 202（49.51） 30（40.54）
≥4000 250（51.87） 206（50.49） 44（59.46）
log2 (miR-128–1) -5.81±2.66 -6.00±2.56 -4.77±2.97 <0.001
AAMA，μg/mmol Cr 4.42（2.51, 7.33） 4.19（2.34, 6.87） 5.51（3.29, 8.02）
0.014
GAMA，μg/mmol Cr 0.53（0.27, 0.95） 0.52（0.27, 0.89） 0.59（0.30, 1.19）
0.153
ΣUAAM，μg/mmol Cr 5.03（2.92, 8.11） 4.77（2.83, 7.75） 6.26（3.62, 9.02）
0.012
GAMA/AAMA 0.12（0.07, 0.21） 0.13（0.07, 0.21） 0.12（0.07, 0.20）
0.580

数据表示为平均值±标准误差、数量（百分比）或P50（P25, P75）。血浆miR-128–1水平在对数2转换前用cel-miR-39–3p（miR-128–1/cel-miR-39–3p）进行归一化。
缩写：T2D，2型糖尿病；BMI，体质指数；SD，标准差；Cr，尿肌酐；AAMA，N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酸；GAMA，N-乙酰-S-(2-氨基甲酰-2-羟乙基)-L-半胱氨酸；ΣUAAM，AAMA和GAMA的总和；GAMA/AAMA，GAMA与AAMA的比率。

3.2. ACR暴露生物标志物与T2D的关联
在调整潜在混杂因素后，ACR暴露生物标志物与T2D显示出线性（P非线性>0.1）的正相关（图1A-H）。每增加1单位的ln转换后的AAMA、GAMA、ΣUAAM或GAMA/AAMA，T2D的患病率比值比（OR，95% CI）分别为1.58（1.11, 2.25）、1.42（1.04, 1.95）、1.63（1.14, 2.35）或4.60（1.17, 19.30）。这些关联不受人群特征的影响（P修改>0.05）（图S1）。通过敏感性分析进一步确认了结果的稳健性，该分析还调整了Cr作为协变量，而不是使用Cr校正后的暴露水平，得到的结果与我们的主要发现一致（表S2）。

3.3. ACR暴露生物标志物与miR-128–1的关联
在调整潜在混杂因素后，我们发现ACR暴露生物标志物与miR-128–1显示出线性（P非线性>0.1）的正相关（图1I-P）。每增加1单位的ln转换后的AAMA、GAMA、ΣUAAM或GAMA/AAMA，miR-128–1的增加与β（95% CI）分别为0.77（0.51, 1.04）、0.63（0.38, 0.88）、0.82（0.55, 1.09）或1.45（0.36, 2.55）相关。这些关联不受人群特征的影响（P修改>0.05）（图S2）。通过敏感性分析进一步确认了结果的稳健性，该分析还调整了Cr作为协变量，而不是使用Cr校正后的暴露水平，得到的结果与我们的主要发现一致（表S2）。

3.4. miR-128–1与T2D的关联
图1Q-R显示，在调整潜在混杂因素后，miR-128–1与T2D之间存在线性（P非线性=0.363）的正相关。这种关联不受人群特征的影响（P修改>0.05）（图S3）。

3.5. miR-128–1的作用
miR-128–1在ACR暴露生物标志物与T2D的关联中起到了中介作用。如图2所示，miR-128–1对AAMA（OR=1.010；95% CI：1.002, 1.020）、GAMA（OR=1.001；95% CI：1.0003, 1.002）、ΣUAAM（OR=1.010；95% CI：1.001, 1.020）和GAMA/AAMA（OR=1.046；95% CI：1.012, 1.097）与T2D的关联具有显著的中介效应，中介比例分别为24.54%、22.82%、24.05%和18.39%。ACR暴露生物标志物和miR-128–1水平较高的受试者显示出更高的T2D患病风险（P趋势<0.001），尽管未发现乘法或加法交互作用（图S4）。

3.6. ACR在INS-1细胞中的GSIS损伤作用
ACR暴露在0.5、1、2和4 mM浓度下孵育24小时后显著降低了INS-1细胞的活力（图S5）。ACR暴露时间较短（6小时或12小时）仅在高浓度下降低了细胞活力，而较长时间（48小时）不适合后续实验（图S5）。24小时暴露后，ACR剂量依赖性地损害了GSIS能力，提高了ROS和MDA水平，并上调了miR-128–1的表达水平，同时激活了NRF2抗氧化途径，表现为INS-1细胞中NRF2、NQO1和HO-1 mRNA/protein水平的增加（图3）。基于这些明确的剂量-反应关系，选择2 mM ACR进行后续干预研究。

3.7. miR-128–1的上调减弱了NRF2途径的激活并损害了GSIS能力
图S6显示了miR-128–1与NRF2 mRNA 3′-UTR之间的结合关系。在转染WT-NRF2的293T和INS-1细胞中，miR-128–1模拟物显著降低了萤光素酶活性，而与MT-NRF2共转染时未发现显著变化，证实NRF2是miR-128–1的目标基因（图S6）。此外，我们探讨了miR-128–1在ACR暴露相关GSIS能力降低中的作用。通过qRT-PCR确认了miR-128–1模拟物（图4A）和抑制剂（图5A）在INS-1细胞中的转染效率。与NC+ACR组相比，模拟物+ACR组显示出显著降低的GSIS能力、增加的ROS和MDA水平（图4C-E），以及NRF2、NQO1和HO-1的mRNA和蛋白质水平降低（图4F-L）。相反，抑制剂+ACR组显示出显著增强的GSIS能力、降低的ROS和MDA水平（图5C-E），以及NRF2、NQO1和HO-1的mRNA和蛋白质水平升高（图5F-L）（与NC+ACR组相比）。miR-128–1过表达对INS-1细胞NRF2信号通路、氧化应激和ACR暴露下的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）能力的影响

转染了50 nM miR-128–1模拟物或NC（转染效率见A）的INS-1细胞被2 mM ACR处理24小时。对miR-128–1（B）、GSIS（C）、ROS（D）和MDA（E）的水平进行定量分析，并在mRNA和蛋白质水平上分析NRF2信号通路组分（F-L）。数据以三次独立实验的平均值±标准误差表示（n=3）。

*P<0.05，**P<0.01与NC组相比。▲P<0.05，▲▲P<0.01与模拟物组相比。#P<0.05，##P<0.01与NC+ACR组相比。

缩写：ACR，丙烯酰胺；GSIS，葡萄糖刺激的胰岛素分泌；ROS，活性氧；MDA，丙二醛；NRF2，核因子红细胞相关因子2；NQO1，NAD(P)H脱氢酶醌1；HO-1，血红素加氧酶1；NC，阴性对照。

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图5. miR-128–1抑制对INS-1细胞NRF2信号通路、氧化应激和ACR暴露下的GSIS能力的影响

转染了100 nM miR-128–1抑制剂或NC（转染效率见A）的INS-1细胞被2 mM ACR处理24小时。对miR-128–1（B）、GSIS（C）、ROS（D）和MDA（E）的水平进行定量分析，并在mRNA和蛋白质水平上分析NRF2信号通路组分（F-L）。数据以三次独立实验的平均值±标准误差表示（n=3）。

*P<0.05，**P<0.01与NC组相比。▲P<0.05，▲▲P<0.01与模拟物组相比。#P<0.05，##P<0.01与NC+ACR组相比。

缩写：ACR，丙烯酰胺；ROS，活性氧；GSIS，葡萄糖刺激的胰岛素分泌；MDA，丙二醛；NRF2，核因子红细胞相关因子2；NQO1，NAD(P)H脱氢酶醌1；HO-1，血红素加氧酶1；NC，阴性对照。

4. 讨论

从流行病学的角度来看，ACR暴露生物标志物与2型糖尿病（T2D）呈正相关，miR-128–1也与T2D呈正相关，并进一步介导了ACR暴露生物标志物与一般成人T2D之间的关系；从毒理学的角度来看，ACR暴露上调了miR-128–1，通过miR-128–1的上调导致INS-1细胞中NRF2抗氧化信号通路的目标抑制，从而损害了胰腺β细胞功能。这些发现为ACR暴露与T2D之间的关联提供了新的见解，并揭示了miR-128–1调节NRF2抗氧化信号通路在ACR与T2D关联中的潜在机制作用。

先前的大鼠毒理学实验表明，ACR可能具有致糖尿病作用，包括血糖升高、葡萄糖耐受性受损和胰岛β细胞损伤（例如，β细胞的数量和质量减少）（Yue等人，2020年；Sto?i?等人，2018年；Quan等人，2022年；Markovi? Filipovi?等人，2022年）。目前的INS-1细胞体外实验也发现，ACR暴露与β细胞的氧化损伤和β细胞功能受损呈剂量依赖性关系。然而，关于ACR暴露与T2D之间联系的基于人群的流行病学证据仍然很少且有争议。两项早期的横断面研究利用了来自美国的1409名和8468名成人的尿液ACR加合物（ACAMA）数据，但两项研究都未能揭示ACAMA与T2D之间的关系（Wang等人，2023年；Duan等人，2024年）。Yin等人利用ACR血红蛋白加合物作为ACR的暴露生物标志物，发现在美国3577名成人中，丙烯酰胺血红蛋白加合物（HbAA）与T2D之间存在反向的横断面关联，而甘氨酰胺血红蛋白加合物（HbGA）或HbAA+HbGA之间没有发现横断面关联（Yin等人，2021年）。此外，Hosseini-Esfahani等人对来自伊朗的6022名成人进行了队列研究，仅发现女性中饮食ACR摄入与T2D之间存在正相关（Hosseini-Esfahani等人，2023年），这在一定程度上支持了我们的发现。在我们目前的对中国成年人的横断面研究中，所有ACR暴露生物标志物（包括ACAMA、GAMA、ΣUAAM和尿液中的GAMA/AAMA）均显示出与T2D之间的正相关，且未发现性别差异。这些流行病学研究的不同发现可能很大程度上是由于样本大小、种族、研究人群的遗传背景、用于评估ACR暴露的方法和介质（尿液/血液/食物；内部/外部）、研究设计等因素的差异造成的。

miR-128–1已被报道能有效调节葡萄糖代谢，miR-128–1的抑制可显著改善葡萄糖耐受性和稳态，表明miR-128–1有可能成为治疗T2D的有效靶点（Wang等人，2020b）。Wang等人发现，患有T2D的大鼠表现出β细胞功能障碍，并且在胰岛中miR-128–1的表达水平显著升高，而miR-128–1的上调可促进胰岛β细胞凋亡（Wang等人，2019年），这在一定程度上支持了我们的发现，即ACR暴露后miR-128–1上调/抑制会加重/缓解β细胞的氧化损伤和功能障碍。Prabu等人对80名T2D患者和80名葡萄糖耐受正常的成人进行了病例对照研究，发现T2D患者的miR-128–1血清水平显著高于健康对照组（Prabu等人，2020年）。此外，Prabu等人还发现，即使在早期糖尿病前期，miR-128–1的血清水平也有所升高（Prabu等人，2015年）。Prabu等人的发现与我们研究的发现一致，即T2D患者的血浆miR-128–1水平显著高于非T2D患者，而且miR-128–1水平的升高与T2D发病风险的增加相关，强调了miR-128–1在T2D发病机制中的关键作用。此外，我们的研究首次从流行病学和毒理学角度揭示了ACR暴露与miR-128–1水平增加之间的剂量依赖性关联，为研究ACR暴露相关的健康风险（特别是T2D风险）的潜在机制提供了新的视角。随后发现的miR-128–1在ACR暴露与T2D之间关系的中介作用进一步表明，miR-128–1可能在ACR暴露与T2D的关联中起潜在机制作用。miR-128–1将ACR暴露与T2D风险联系起来的可能机制值得深入研究。

抗氧化NRF2的激活是miR-128–1的靶基因，这一点通过双萤光素酶测定得到证实，它可以保护胰腺β细胞免受氧化损伤，并长期以来被视为治疗和预防T2D的重要策略（Baumel-Alterzon等人，2021年；Robertson，2024年）。NRF2可以在受到包括ACR在内的污染物的刺激下被激活（Pan等人，2017年），并在对抗氧化应激中发挥关键作用（Schultheis等人，2019年）。在本研究中，暴露于ACR的INS-1细胞表现出miR-128–1表达升高和抗氧化NRF2通路的激活，这与已建立的miR-128–1对NRF2的负调控作用似乎矛盾。然而，这代表了一种正常的适应性应激反应（Baumel-Alterzon等人，2021年）。重要的是，随着ACR暴露剂量的增加，GSIS损伤和氧化应激逐渐恶化。这表明即使NRF2被激活，其保护能力也不足以抵消ACR对β细胞的氧化损伤。miR-128–1的持续升高进一步强调了在ACR暴露背景下研究其与NRF2之间具体关系的必要性。我们的研究还揭示，miR-128–1的表达升高抑制了NRF2及其下游效应器NQO1和HO-1的表达，增强了氧化应激，并进一步加剧了与ACR暴露相关的β细胞GSIS损伤。相反，抑制miR-128–1导致NRF2、NQO1和HO-1的表达增加，这在很大程度上减轻了与ACR相关的氧化损伤和β细胞GSIS损伤。

尽管我们的横断面流行病学发现提示了一种潜在的中介途径，但无法确定ACR暴露、miR-128–1和T2D之间的时间关系。虽然体外数据提供了支持这种时间顺序的证据（ACR暴露导致miR-128–1升高，随后导致β细胞功能障碍），但仍需要大规模的前瞻性队列研究来进行验证。此外，尽管调整了包括饮食因素在内的一系列潜在混杂因素，我们仍不能排除其他未测量的饮食污染物和/或共暴露（例如微塑料）的残余混杂可能性。总体而言，这些发现表明，靶向抑制抗氧化NRF2通路及其导致的β细胞氧化损伤和功能障碍可能是miR-128–1将ACR暴露与T2D风险增加联系起来的潜在机制。当然，在研究ACR与T2D发病机制的背景下，仅关注NRF2通路的相关研究可能不够全面。需要更广泛和深入的研究来阐明额外的机制。虽然我们的研究集中在miR-128–1的下游靶点NRF2通路，但miR-128–1也可能调节其他信号级联（例如凋亡通路（Rzemieniec等人，2025年），这些通路可能对观察到的β细胞功能影响有所贡献。未来探索这些额外通路的研究将进一步阐明miR-128–1与T2D之间的复杂调控网络。鉴于miR-128–1作为多种生物过程调节剂的新兴作用，其在T2D之外的其他污染物相关疾病或毒理学过程中的作用也值得进一步研究。我们的发现可能为探索miR-128–1在环境健康中的更广泛影响提供基础。

本研究具有以下优势。首先，本研究首次提供了ACR暴露与miR-128–1以及miR-128–1与T2D发病风险之间关联的证据，以及miR-128–1在介导ACR暴露与T2D关联和ACR相关β细胞功能氧化损伤中的潜在机制作用。其次，进行了流行病学研究和毒理学实验，系统地揭示了miR-128–1在连接ACR暴露与T2D风险中的潜在机制作用，使研究结果更有说服力。第三，测量了可靠的ACR暴露内部生物标志物（包括ACAMA和GAMA），以更准确地评估研究人群的ACR暴露情况。尽管如此，本研究仍存在一些局限性。首先，所进行的流行病学研究是横断面设计，限制了因果推断。然而，毒理学实验确认了ACR暴露与miR-128–1上调和β细胞功能障碍的时间顺序，一定程度上支持了ACR暴露与T2D风险之间的因果关系，以及miR-128–1表达升高的参与。其次，流行病学研究的人群样本量相对较小，尽管足够，但仍需要在更大规模的人群研究中进行进一步验证。第三，流行病学研究对象除了使用24小时尿液样本外，还使用了其他样本来确定ACR暴露生物标志物，这可能导致由于尿液ACR暴露生物标志物的时间变化而引入测量误差。然而，这种污染物暴露评估方法已在流行病学研究中得到普遍认可和广泛应用，而且考虑到我们研究人群相对稳定的生活方式，他们测得的ACR暴露水平被认为是可靠的。第四，我们的体外研究中使用的ACR剂量可能高于实际人类暴露剂量。这些剂量用于在高暴露条件下探索机制，而不是量化直接的人类风险。鼓励进行更低ACR剂量的未来研究。最后，毒理学实验仅基于INS-1细胞进行，未来结合更多类型的β细胞甚至动物模型的研究将提供更可靠和有力的证据。

5. 结论

本研究结合了基于一般成人的流行病学研究和基于INS-1细胞的毒理学实验，首次提供了miR-128–1可能在连接ACR暴露与T2D风险中起潜在机制作用的证据，可能涉及靶向抑制抗氧化NRF2信号通路和β细胞功能的氧化损伤。这些发现突显了ACR暴露与T2D风险之间的潜在风险，并提供了有关潜在机制的新见解，表明管理ACR污染/暴露和调节miR-128–1和NRF2通路可能有助于预防和控制全球T2D大流行。需要进一步的大规模前瞻性队列研究和基于动物的体内研究来验证这些发现。

资金支持

本研究得到了中国国家自然科学基金（82203996；82574050；82241088）、湖北省自然科学基金（2025AFB591）和中国博士后科学基金（2022T150230；2021M691131）的支持。

出版同意

所有作者均批准了手稿的版本。

作者贡献声明

霍志英：撰写——原始草稿、可视化、方法学、概念化。宋家豪：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学。范立阳：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学。万淑辉：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学。游晓杰：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学。张永芳：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学。刘青：撰写、审稿与编辑、数据可视化、方法论研究。
洪乐：撰写、审稿与编辑、数据可视化、方法论研究。
熊亚妮：撰写、审稿与编辑、数据可视化、方法论研究。
陈鹏飞：撰写、审稿与编辑、数据可视化、方法论研究。
王菲菲：撰写、审稿与编辑、数据可视化、方法论研究。
陈伟宏：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法论研究、概念构思。
王斌：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法论研究、资金筹措、概念构思。