关于高原湖泊蓝藻水华中抗生素抗性基因的宏基因组学研究：空间分布模式、环境关联及风险影响

《Emerging Contaminants》：Metagenomic insights into antibiotic resistance genes in cyanobacterial blooms of plateau lakes: spatial patterns, environmental associations, and risk implications

　　重庆 黄|陈 王|詹 沈|春梅 天|华吉 刘|银诺 刘|吉孟 冯|新泽 王
上海交通大学环境科学与工程学院，中国上海200240

摘要
有害蓝藻水华（cyanoHABs）对高原淡水湖泊构成严重威胁，影响饮用水安全，并与抗生素抗性基因（ARGs）相互作用。然而，这种相互作用背后的机制仍不清楚。在本研究中，我们使用宏基因组技术和抗生素暴露实验来调查Erhai湖在蓝藻水华期间ARGs的分布及其驱动因素。我们鉴定出28种ARG亚型（共65种），其中elfamycin和四环素类ARG在沉积物和上层水中富集程度较高。优势微生物门类，如放线菌门（Actinobacteria）和假单胞菌门（Pseudomonadota），通过共现网络促进水平基因转移（HGT），而转座酶是驱动ARGs扩散的关键基因。营养盐梯度通过促进假单胞菌门增殖、增加移动遗传元件（MGEs）和提升藻类生物量来增强ARGs的传播，这些因素共同富集了毒力因子（VFs）和ARGs。ARG的环境风险评分（ERS）存在空间差异：南部上层水体的高ERS与废水排放和较长水停留时间有关，而北部沉积物的高ERS则与畜牧业和农业活动相关。四环素暴露具有浓度依赖性效应：低浓度（10 ng/L）可竞争性抑制ARG携带者（蓝藻），而高浓度（100 ng/L）则导致藻类死亡，释放有机物和MGEs，从而促进异养细菌生长和ARGs的水平基因转移。本研究为管理高原湖泊中的抗生素抗性提供了宝贵见解，并强调了针对蓝藻水华期间营养盐-ARG相互作用的策略必要性。

1. 引言
抗生素对于治疗人类和动物的病原微生物感染以及在农业和水产养殖中作为生长促进剂至关重要[1]，[2]。然而，吸收不完全和有限的废水处理能力导致大量抗生素残余物进入环境[3]。这些残余物诱导细菌抗性，推动抗生素抗性基因（ARGs）的形成和传播，对人类和生态健康构成严重威胁[2]，[4]，[5]。根据世界卫生组织（WHO）的统计，抗生素抗性是全球十大健康威胁之一，它通过水平基因转移在临床和自然环境中传播，增加了疾病治疗的复杂性[2]，[5]，[6]。此外，重金属和多环芳烃等污染物也会富集ARGs[7]，[8]，[9]，而营养盐间接促进了ARGs的扩散，进一步加剧了生态和健康风险[10]，[11]，[12]。因此，阐明ARGs的环境行为、形成机制和传播途径是一个紧迫的问题。

近年来，由富营养化引起有害蓝藻水华（cyanoHABs）已成为高原淡水湖泊的主要生态威胁，危及饮用水安全和渔业及人类健康[13]。这些水华还与ARGs形成了复杂的相互作用网络[14]。在水华期间，ARGs的数量和传播风险显著增加：蓝藻水华提高了总ARGs和病原体的数量[15]，[16]，而像微囊藻（Microcystis）这样的蓝藻创造了有利于ARGs宿主细菌（例如假单胞菌门）生长的微环境，并通过其代谢产生的醋酸等有机物质刺激耐药细菌的增殖[17]。这种“水华-耐抗生素细菌”循环直接促进了ARGs的跨物种传播，蓝藻作为ARG的储存库[18]，使得水华期成为ARGs环境传播的关键时期。值得注意的是，虽然蓝藻门（Cyanobacteriota）与放线菌门和假单胞菌门之间的营养竞争减少了ARGs的绝对数量[19]，[20]，但微生物群落的失衡激活了移动遗传元件（MGEs）和毒力因子（VFs）的传播，形成了“低丰度-高流动性”的潜在风险[21]，[22]。此外，毒素积累和低溶解氧通过微生物群落压力间接影响ARGs的动态[22]，进一步加剧了高原淡水湖泊的生态风险。

四环素（TC）是一种广泛应用于畜牧业和医学领域的广谱抗生素，已知可通过多种途径渗入水生生态系统，包括牲畜废水的排放、地表径流和农业中动物粪便的应用[23]。在中国高产和消费抗生素的情况下，环境中TC的残留成为水生环境生态风险的重要因素[3]。实证研究表明，环境相关的TC浓度（60至300 ng/L）可显著促进蓝藻的生长，从而可能加剧藻类水华的发生[24]，[25]。此外，TC还被证明能诱导蓝藻释放有毒代谢物，机制涉及细胞膜损伤、活性氧物种的积累和抗氧化酶系统的破坏。这种释放直接威胁水生生物的健康和饮用水的安全[26]，[27]。此外，TC还可能抑制某些敏感细菌菌株的生长和繁殖，从而扰乱微生物群落的结构和功能，可能促进ARGs的传播[28]，[29]。因此，全面研究TC对Erhai湖中蓝藻生长和代谢以及ARGs的影响至关重要。此类研究将为污染控制、藻类水华预防和阻断高原湖泊中ARGs传播提供必要的科学支持。

Erhai湖作为典型的高原湖泊，其生态系统对外部干扰极为敏感[30]。过去几十年，湖泊经历了加速的富营养化过程，频繁的蓝藻水华成为水质恶化和生态功能受损的主要问题[31]。同时，人类活动和农业污染使Erhai湖特别容易受到ARGs的增殖影响（Chen等人，2025年）。基于此背景，本研究结合了野外调查和模拟实验，旨在：（1）阐明沉积物-水系统中ARGs的分布特征及其与微生物群落的生态共现网络；（2）确定影响ARGs传播的因素；（3）明确TC暴露对蓝藻生长和代谢的影响以及相关的ARGs传播风险。

2. 材料与方法
2.1. Erhai湖流域和采样点概述
Erhai湖（100.08°–100.28°E, 25.58°–25.97°N）是云贵高原第二大淡水湖，面积252平方公里，平均海拔1970–2049米，平均深度10米。该湖具有亚热带季风气候，年均温度15°C。北部地区由于集约化农业和畜牧业成为抗生素污染的主要来源，三条主要河流（芦狮河、米焦河和永安河）贡献了湖泊年径流的54%（2.1×10^8立方米）。中部地区由于水文和森林虫害控制措施，径流有限，导致局部污染。南部人口密度较高，向湖泊排放大量生活污水。湖泊唯一的出口是西河，年流出量为9.8×10^7立方米。较弱的水动力导致污染物滞留时间较长。最近，Erhai湖从中性营养状态转变为早期富营养状态，夏季和秋季发生蓝藻水华的风险增加[8]，[32]，[33]。

2024年9月，从覆盖整个Erhai湖的10个地点采集了表层沉积物（0–10厘米）和上层水（0–0.5米）样本（图1）。北部选取了3个地点（E1、E2和E3），中部4个地点（E4、E5、E6和E7），南部3个地点（E8、E9和E10）。收集的样本在24小时内用干冰运输至实验室，并在-80°C下保存以待分析。总氮（TN）采用碱性过硫酸盐消化UV分光光度法测定，总磷（TP）采用钼酸铵分光光度法测定，总有机碳（TOC）采用TOC分析仪（multi N/C 3100，Jena，德国）测定。叶绿素a（Chl-a）采用丙酮提取法测定。其余样本用于宏基因组分析。

2.2. 暴露实验设计
微囊藻属（Microcystis sp.）和假单胞藻属（Pseudanabaena sp.）是Erhai湖中的主要蓝藻物种[34]。本研究中使用的实验菌株来自中国科学院水生生物学研究所的淡水藻类文化收集库。这些藻类在室温（25 ± 0.5°C）下、光照强度为2000勒克斯、光照-黑暗周期为16小时：8小时的室内条件下培养于BG-11培养基中。每天搅拌2–3次以模拟自然条件。为了模拟蓝藻水华期间的指数生长阶段，在TC暴露前将两种藻类的细胞密度调整至10^6个细胞/升。这一密度对应于自然水华中蓝藻生物量积累的关键对数生长阶段[30]。随后在预平衡的藻类培养瓶中加入TC，浓度分别为0、10和100 ng/L。这些浓度是根据全球代表性案例中测量到的TC水平选定的（范围：ND–87.90 ng/L，表S1），以确保实验剂量的环境相关性。由于TC半衰期较短，根据Tang等人（2022年）的方法，每12小时补充TC一次以维持稳定的浓度（在标称值的80–120%范围内）。每个处理重复三次。暴露96小时后收集样本进行分析[35]。

2.3. 藻类生长和代谢指标的测定
使用UV-Vis分光光度计（L6S，Cold Light，中国）测量藻细胞在680纳米处的光密度（OD680），并使用公式（1）计算生长率（GR）。最大光化学效率（Fv/Fm）使用植物浮游生物脉冲振幅调制荧光计（PHYTO-PAM-II，Walz，德国；检测限=0.2 μg/L Chl-a）测定。为了提取细胞外代谢有机物（EOM），将50毫升藻类培养物在4°C下以10,000 g离心10分钟。上清液通过0.45 μm膜过滤器过滤得到EOM提取物。为了提取细胞内代谢有机物（IOM），将剩余的藻类颗粒用超纯水洗涤三次，重新悬浮后进行三次-20°C冻融循环。然后在4°C下以10,000 g离心10分钟，上清液过滤得到IOM提取物。使用南京健成生物工程研究所的酶试剂盒按照制造商说明测量EOM和IOM的含量。

2.4. DNA提取和宏基因组测序
1升水样通过连接真空泵的垂直过滤装置通过0.22 μm硝酸纤维素膜过滤器过滤以收集微生物细胞。过滤器在-80°C下保存直至DNA提取。对于沉积物样本，使用无菌铲子收集0.5克表层沉积物并转移到无菌试管中以进行后续处理。使用Qubit? dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国）从沉积物和水样过滤器中提取DNA。提取的DNA经过CTAB裂解、蛋白酶K消化、氯仿/异丙醇纯化和PEG8000沉淀处理以确保足够浓度。使用Qubit 4.0荧光计评估DNA质量，通过Nanodrop测量A260/A280比值（> 1.8），并通过Agilent 2200 TapeStation验证片段完整性（23S/16S rRNA比值> 1.5）以满足宏基因组测序要求。合格的DNA样本使用Covaris ME220系统片段化至约400 bp，然后进行末端修复、A尾处理和Illumina TruSeq接头的连接。在DNA片段化前向每个样本添加内部标准序列，以便将测序读数转换为每体积水或每单位沉积物的绝对基因拷贝数。

测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，采用2×150 bp的双端测序方法，覆盖度大于50%。每个批次包含三个阴性对照以监测潜在污染。使用FastQC评估测序数据的质量，并使用Trimmomatic修剪低质量序列，仅保留质量得分高于Q20的数据。所得数据随后存入CNGB序列档案（CNSA），访问号为CNP0007304。为了识别抗菌素耐药基因（ARGs），将测序数据与一个针对特定样本的数据库进行了比对，该数据库整合了CARD耐药基因数据库和MetaPhlAn3微生物参考基因组。随后使用ResFinder 4.1软件进行ARG识别，设定标准为e值<1×10^-5、相似度>90%以及覆盖度>60%。此外，还利用blastn程序与移动遗传元件数据库[36]进行比对，以实现MGEs的预测和注释[37]。同时，基于毒力因子数据库[38]，使用Diamond软件检测毒力因子（VF）。最后，利用MetaPhlAn3对微生物群落进行注释。为了直观展示ARGs和微生物群落的空间分布模式，使用R.2.5中的ggplot2包生成了热图。

**ARGs的生态风险评估**
通过MetaCompare 2.0工具包对ARGs的生态风险进行了评估，这是一个基于生态暴露-反应原理的定量、多层次评分框架[39]。首先通过宏基因组测序从样本中检索ARG序列并对其进行注释以识别其类型。该工具包根据检测到的所有ARG亚型、MGEs和致病性分类群的存在和丰度计算生态风险评分（ERS）。将得到的ERS值进行log10变换，并参照参考环境梯度进行校准，以确定可解释的阈值：ERS<0表示生态风险可以忽略；0≤ERS<1表示低至中等风险；ERS≥1表示高风险。该方法在针对ZymoBIOMICS? Mock Microbial Community (v2)和全球环境宏基因组样本的验证中，检测WHO重点优先级ARGs的灵敏度达到92.3%，且在相同的比对和丰度量化工作流程下，与ResFinder 4.1相比，预测一致性κ为0.76（P<0.001）[40]。ERS的计算公式如下：

在这里，wARG_i、wMGE_j和wPath_k分别代表检测到的ARG亚型、MGEs和致病性分类群的权重系数，反映了它们的功能风险潜力。AbundARG_i、AbundMGE_j、AbundPath_k表示相应组分的标准化相对丰度。所有权重都标准化为单位中位数并进行对数变换，以确保可乘解释性。

**2.6 统计分析**
采用多工具集成分析策略来阐明ARGs的分布和驱动机制。使用TBtools可视化湖内沉积物-水体介质及不同空间位置中ARGs的丰度差异，并量化α/β多样性。通过Spearman相关性分析构建ARG亚型与细菌群落之间的共现网络，并使用Gephi 0.9.1软件进行可视化。通过Pearson相关性和Mantel检验分析环境因素、微生物群落、MGEs、VF和ARGs丰度之间的相互关系。冗余分析（RDA）用于揭示ARGs与MGEs及VF之间的关联，而Mantel检验用于评估环境因素、微生物群落、MGEs和VF与ARGs之间的共变关系。在R中使用“plspm”包进行偏最小二乘结构方程建模（PLS-SEM），以确定驱动ARGs变化的关键变量。使用ArcGIS 10.2中的逆距离加权法绘制洱海湖泊中ERS的空间分布图。采用单因素方差分析（ANOVA）评估不同TC（有毒物质）浓度对藻类生长和代谢指标的影响，显著性阈值为5%。使用SPSS 20.0检验ANOVA的正态性和方差齐性假设。

**3.1 ARGs的分布特征**
在洱海沉积物及其上层水中共检测到28个ARGs和65个ARG亚型（图2a），涵盖21个抗生素耐药类别（表S2）。在上层水中，Mtub_rpsL_STR、Ecol_EFTu_KIR和Scin_EFTu_ELF是主要ARG亚型（表S3）；而在沉积物中，Bado_rpoB_RIF的相对丰度最高（表S4）。Elfamycin和四环素类ARG在两种介质中都相对丰富，但氨基糖苷类ARG在上层水中的丰度显著高于沉积物（P<0.05），而沉积物中氟喹诺酮类、肽类和其他四类ARG的丰度更高（P<0.05；图S1）。从空间上看，上层水中ARGs的β多样性沿PCoA1轴有显著分离（解释了83.60%的变异；图2b, c），沉积物中的ARGs Shannon指数显著高于上层水（2.46 vs 2.03），表明沉积物中的ARGs多样性更高（图2d, e）。抗性机制分析显示，两种介质中的主要耐药策略都是改变抗生素靶点，但上层水的耐药机制多样性更高（图2f, g）。

**3.2 微生物群落特征和共现网络**
在洱海中检测到17个细菌门：沉积物中15个，上层水中9个（图3a）。沉积物微生物群落的物种丰富度显著高于上层水（沉积物7764种，上层水4574种；图3b, c）。沉积物中的主要门类为假单胞菌门（21.07–35.12%）、热硫化细菌门和疣微菌门。上层水中的主要门类为假单胞菌门（31.01–43.20%）、放线菌门和蓝细菌门。热硫化细菌门和绿弯菌门在沉积物中更为丰富，而蓝细菌门和拟杆菌门在上层水中更占优势。在11个最丰富的物种中（平均相对丰度>1%），假单胞菌门在沉积物中最多，放线菌门在上层水中最多。PCoA分析显示，上层水样本沿PCoA1轴（解释了55.36%的变异）和沉积物样本沿PCoA2轴（解释了21.55%的变异）有显著分离（图3d, e）。从空间上看，假单胞菌门和放线菌门在洱海南部区域更为丰富（图3f, g）。

**3.3 环境因素、MGEs和VF的分布**
洱海中环境因素、MGEs和VF的分布表现出显著的空间变异性和中等特异性。上层水中的TN、TP、TOC、Chl-a的平均浓度分别为0.63、0.56、5.92和0.05 mg/L，而在沉积物中这些值分别为6.89、705.50、45.05和32.06 mg/kg（图S2）。洱海南部的营养物质和Chl-a浓度高于其他区域。MGEs的组成分析显示，转座酶、插入元件IS91和qacEdelta在两种介质中都很常见。然而，转座酶在上层水中占主导地位，而转座酶和插入元件IS91在沉积物中的丰度显著高于qacEdelta（P<0.05；图S3）。共检测到11种VF的功能模式，其中黏附和免疫调节模式最为普遍，分别占总数的46.29%和19.79%。不同介质中的功能分布存在显著差异，上层水中调节类的相对丰度较高，而在沉积物中效应传递系统的丰度显著更高（图S4）。

**3.4 影响ARGs分布的因素**
经过方差膨胀因子（VIF<10）筛选后，RDA显示MGEs和VF是塑造ARGs分布模式的关键驱动因素，其对上层水中ARGs的解释能力（85.52%）远高于沉积物（48.90%）。具体来说，在上层水中，氨基糖苷类耐药基因与运动相关VF有强关联；而赋予elfamycin、四环素、氟喹诺酮和苯酚耐药的基因与免疫调节VF以及qacEdelta和IS91插入元件MGEs有强关联。在沉积物中，四环素、氟喹诺酮和苯酚耐药基因与黏附VF有强关联；elfamycin和氨基糖苷类耐药基因与应激生存VF和转座酶MGEs有相关；氨基香豆素耐药基因与qacEdelta MGEs有强关联（图S5）。相关性分析显示，前10个ARG与假单胞菌门和放线菌门等微生物门类以及VF（如调节和运动相关）有显著关联（P<0.05；图5a, b）。具体而言，在上层水中，假单胞菌门与TN、TP、TOC和Chl-a呈正相关，并与插入元件IS91有强正相关（r>0.8，P<0.05）。在沉积物中，拟杆菌门、蓝细菌门和效应传递系统与Chl-a呈正相关，而疣微菌门和放线菌门与转座酶呈负相关（P<0.01），但与插入元件IS91呈正相关（P<0.05）。值得注意的是，假单胞菌门在上层水和沉积物中都与蓝细菌门呈负相关（P<0.05）。

**3.4 ARGs风险和TC对藻类的影响**
在洱海的上层水和沉积物中均检测到ARGs污染，ERS值范围分别为1.27至1.32和1.30至1.35。ERS的空间分布存在显著差异，上层水中的值高于沉积物（图6a, b）。TC暴露显著影响微囊藻（Microcystis sp.）和假纳巴菌（Pseudanabaena sp.）的生长和代谢特性（图6c, d）。与对照组（CK）相比，浓度为10 ng/L（低浓度，L）和100 ng/L（高浓度，H）的TC显著增加了这两种藻类的GR、Fv/Fm、EOM和IOM（P<0.05），特别是在100 ng/L时效果更为明显。TC暴露对假纳巴菌的代谢活性影响更为显著，其EOM和IOM产量分别达到对照组的1.34倍和1.29倍。氧化应激分析显示，10 ng/L的TC对SOD和MDA含量无显著影响，而100 ng/L的TC显著诱导了两种藻类的氧化应激（P<0.05）。进一步分析代谢酶活性发现，TC暴露显著激活了两种藻类的MDH和PCKA（图6e），其中假纳巴菌的激活更为明显。然而，TC暴露对PK活性无显著影响。洱海中ARGs的生态风险及其对藻类的影响。 (a, b) 水体和沉积物中的ERS。 (c, d) TC对微囊藻属和假纳巴菌属生长的影响。 (e) 关键酶活性的变化。4. 讨论 4.1. 埃海湖中ARGs的分布及其与微生物的相互作用 埃海湖复杂的生态系统为研究ARGs的分布模式及其与微生物群落的生态相互作用提供了独特的模型[30]。在本研究中，我们在沉积物和水柱样本中鉴定出了28种ARGs，包含65个亚型，涵盖21种抗生素抗性类别，包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类和四环素类。这种多样性远远超过了南中国海（16种ARGs）和维多利亚湖姆万扎湾（13种ARGs）的记录[41],[42]。值得注意的是，ARGs在不同环境区间内表现出显著的空间异质性：沉积物作为储库，其分类多样性和丰度始终高于上层水体[43]，这一模式与沉积物基质中的长期抗生素输入和增强的微生物代谢活动有关[44]。具体而言，四环素抗性基因的积累与环境中的四环素浓度呈显著正相关，这促进了抗性决定因子的水平传播和持久性[45]。相反，水柱中的ARGs，尤其是elfamycin抗性基因，主要受到人为输入的影响，包括农业径流和药物废水排放[46],[47]，而集约化的畜牧业和市政废水处理排放是主要的引入途径[48]。抗性机制分析进一步表明，在埃海湖中，抗生素靶标的改变是主导策略，这与之前的研究结果一致，即沉积物中持续的四环素输入增强了这一机制，而水柱中的水文流动和环境交换则促进了更丰富的机制多样性[49]。微生物群落的结构与ARGs的分布密切相关[49],[50],[51]。埃海湖中共鉴定出17个门类，其中假单胞菌门最为丰富，这一结果与其他自然水体（如巢湖[52]、东太湖）的研究结果一致，假单胞菌门已被确认为湖泊中ARGs的主要携带者[53]。在埃海湖沉积物中，优势微生物群体与某些ARG亚型强烈共存，可能充当宿主。相比之下，上层水体中ARGs的共现网络以放线菌门和蓝细菌门为主，具有更高的聚类系数，表明微生物可能通过水平基因转移促进ARGs的传播[49],[54]。先前的研究表明，沉积物中的假单胞菌门与多重耐药外排泵相关基因显著共存[46]，而淡水系统中的放线菌门常携带氨基糖苷类抗性基因[55]，这与该研究中上层水体中观察到的高氨基糖苷类ARGs丰度相符。此外，微生物群落的多样性影响ARGs的分布，复杂的结构为ARGs的传播和富集提供了有利条件[54]。微生物相互作用网络的复杂性可能会加剧埃海湖作为ARGs传播中心的生态风险。4.2. 环境因素与功能基因的相互作用 埃海湖中环境因素和功能基因的分布表现出显著的空间变异性和中等特异性，其协同驱动机制可以通过营养梯度对微生物群落、MGEs和VF的级联效应来解释[11],[12]。MGEs的组成分析表明，转座酶、插入元件IS91和qacEdelta在两种介质中都很常见，但在上层水体中转座酶占主导地位，而沉积物中转座酶和插入元件IS91的丰度显著高于qacEdelta[46]。这与先前的研究一致，表明转座酶介导的DNA序列在基因组内和基因组间的移动是ARGs传播的主要机制之一[56]。不同介质中VF的功能分布存在显著差异，上层水体中调控基因的相对丰度较高，而沉积物中效应子传递系统的丰度显著更高，反映了病原体毒力策略在不同环境条件下的适应性分化[29],[57]。值得注意的是，除了ARGs外，一些病原体还携带VF，受ARG影响的VF通过代谢和外排增加了宿主入侵的风险[42]。虽然地表水中的TN、TP和TOC可以促进优势微生物类群（如假单胞菌门）的增殖，并通过插入序列IS91增强MGE活性，从而间接推动ARGs的传播[58]。富营养化可能引发特定藻类的爆发，改变水柱中的光照可用性、DO和pH值，进而对其他敏感微生物类群产生竞争性抑制或代谢压力[59]。这一过程简化了微生物群落组成，降低了与ARG传播无关的微生物的丰度[59]。同样，对MGEs的负面影响可能源于营养物质对所有MGEs的刺激不足或营养物质对携带MGEs的某些宿主微生物生长的选择性抑制[58]。在一些研究中，MGE活性与抗生素和重金属等压力因素表现出更强的正相关，而单纯的营养富集可能不足以提供所有MGEs传播所需的选择压力[60]。此外，沉积物中较高的Chl-a含量（32.06 mg/kg）刺激了藻类生物量的增加，从而间接增加了VF的丰度，进而富集了ARGs，这与太湖的研究结果一致[61]。值得注意的是，在PLS-SEM框架中，MGEs直接且积极地驱动ARGs的传播，而微生物群落表现出抑制作用。这进一步强调了移动遗传元件（如质粒和插入序列IS91）可能携带多重耐药基因，克服环境压力，并作为ARG传播的核心媒介[62]。先前的研究还发现，沉积物中转座酶的高丰度可能由于非随机共存（例如与蓝细菌的负相关）而限制ARG的传播[63]，而表层水中插入序列IS91与假单胞菌门的强相互作用可能加速HGT[52]。此外，微生物群落与VF之间的协同效应可能放大环境因素的驱动作用。例如，表层水中假单胞菌门与调节相关VF的高共现可能通过群体感应协调抗生素抗性和毒力表达[57]。沉积物中放线菌门与效应子传递系统的关联反映了病原体在低营养条件下的适应性变化[55]。总之，埃海湖中ARGs的分布是环境因素、微生物相互作用和功能基因共同进化的结果：营养梯度重塑了微生物群落结构和MGEs活性，间接或直接调节ARGs的丰度和多样性；VF的功能分化可能通过增强病原体的适应性加剧抗性传播的生态风险。这为高原湖泊中ARGs污染的源控制提供了理论基础，强调了控制营养物质输入和由MGEs介导的水平基因转移途径的必要性。4.3. ARGs的生态风险及抗生素暴露的潜在影响 4.3.1. 埃海湖中ARGs的生态风险 尽管许多研究关注了ARGs和MGEs的分布模式以及微生物群落与环境因素之间的相互作用[52]，但准确评估ARGs的潜在风险仍然是一个关键挑战。基于Martínez等人提出的抗性组风险框架以及Chen等人对太湖沉积物中ARGs的风险评估[64],[65]，本研究使用了MetaCompare工具包全面评估了埃海湖中ARGs的生态风险。该工具可以通过考虑病原体获取ARGs的潜力以及ARGs在微生物组内的移动性，直观地反映湖泊中ARGs的潜在生态风险[39]。结果表明，埃海湖的上层水体和沉积物都受到ARGs的影响，ERS表现出明显的空间变异。具体而言，南部上层水体中较高的ERS值可能与湖泊出口位于南部有关，那里的闸门调节延长了水体滞留时间[40]。此外，南部地区人口密集，污水排放量大，病原体与ARGs之间的关联增强[66],[67]。相比之下，北部沉积物中观察到的ARGs高ERS主要归因于该地区是主要的畜牧业和农业活动区，这些活动共同贡献了湖泊60%以上的污染物负荷[66]，导致该区域污染物积累严重。4.3.2. 抗生素暴露的潜在影响 TC暴露对藻类生长和代谢的浓度依赖性效应揭示了抗生素污染对淡水生态系统中的微生物群落和ARGs传播的复杂调控机制[68]。本研究发现，环境相关的TC浓度（10 ng/L和100 ng/L）显著促进了微囊藻属和假纳巴菌属的GR、Fv/Fm、EOM和IOM，这与抗生素通过扰乱营养物质循环或激活藻类代谢补偿机制来促进繁殖的报道一致[69],[70]。蓝细菌的扩张可能通过资源竞争抑制AGs携带者（如放线菌门和假单胞菌门），从而减少ARGs的丰度[14]。然而，更高的TC浓度（100 ng/L）进一步增强了代谢活性，但也引发了氧化应激和藻类衍生有机物（AOM）的释放，这可能为异养细菌提供碳源，间接促进了携带ARGs的放线菌门和假单胞菌门的生长和繁殖，增加了ARGs的传播风险[20],[71]。值得注意的是，ARGs的丰度与放线菌门的丰度呈正相关[14]，放线菌门在氮循环中的功能优势可能在富营养化条件下加剧ARGs的环境风险[72]。蓝细菌的代谢适应性可能进一步调节它们与ARGs携带者的相互作用。代谢酶分析表明，100 ng/L的TC显著激活了微囊藻属和假纳巴菌属的MDH和PCKA酶，表明C4碳固定途径得到增强以适应环境压力。这与微囊藻在氮限制条件下优先激活C4途径的策略相似[73]，表明TC压力可能模拟营养限制条件，促使蓝细菌通过代谢重组维持竞争优势，从而持续抑制ARGs携带者[74]。然而，高TC浓度对PK酶活性没有显著影响，表明环境相关的TC浓度并未完全阻断糖酵解，可能主要影响高能量消耗过程（如三羧酸循环或氧化磷酸化），导致异养细菌的代谢适应性差异[75]。此外，假纳巴菌属对TC的耐受性更强，其上调的代谢活性可能通过资源竞争进一步抑制ARGs携带者，但其死亡和AOM及MGEs的释放可能通过改变微生物相互作用网络重塑ARGs的生态分布[14],[72]。5. 结论 本研究系统阐明了埃海湖中ARGs的分布和驱动机制，揭示了由于当地畜牧业产生的抗生素残留物，沉积物和上层水体中elfamycin和四环素ARGs的显著富集。ARGs的空间分布受人类活动输入和抗生素残留物与微生物代谢之间相互作用的影响。优势微生物群体（如放线菌门和假单胞菌门）通过共现网络介导水平基因转移，转座酶作为关键功能基因推动ARGs在介质间的扩散。营养梯度通过促进假单胞菌门的增殖和MGEs的丰度以及增加藻类生物量来增强ARGs的传播，并促进VF和ARGs的共富集。埃海湖中ARGs的ERS表现出空间异质性。南部上层水体中的高ERS值与废水排放和水体滞留时间延长有关，而北部沉积物中的高峰ERS值与畜牧业和农业活动的污染有关。抗生素暴露表现出浓度依赖的生态风险：低浓度通过竞争抑制ARG携带者，而高浓度则导致藻类死亡，释放AOM和MGEs，刺激异养细菌的增殖和ARGs的水平转移。研究证实，ARGs的分布是环境因素、微生物相互作用和功能基因共同进化的结果，并提出了一种基于营养物质控制、MGEs抑制和抗生素浓度梯度效应的综合性风险管理系统，以减轻与抗生素抗性相关的生态风险。作者贡献声明 Tian Chunmei：撰写——原始草稿、方法学。 Liu Huaji：可视化、方法学。 Liu Yinuo：可视化、方法学、概念化。 Feng Jimeng：可视化、方法学、概念化。 Wang Xinze：撰写——审稿与编辑、可视化、资金获取、概念化。 Huang Zhongqing：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、方法学、数据管理、概念化。 Wang Chen：撰写——审稿与编辑、方法学、概念化。 Shen Jian：撰写——审稿与编辑、可视化、概念化。数据可用性 数据可应要求提供。