基于结构导向的表面工程方法用于提高产乙烯酶的催化活性

《Engineering Microbiology》：Structure-guided surface engineering to improve the catalytic activity of ethylene-forming enzyme

　　王梦媛|沈壮林|吴连|黄维学|周家海|顾阳
中国科学院深圳先进技术研究院，中国深圳518055

**摘要**
乙烯生成酶（EFE）属于单核非血红素Fe(II)和2-氧戊二酸依赖性氧化酶超家族，该酶可以通过精氨酸依赖性反应将2-氧戊二酸氧化生成乙烯。尽管已经在EFE的活性位点和表面进行了大量的酶工程改造，但迄今为止尚未报道出活性显著提高的变体。为了增强EFE的催化活性并拓宽其应用潜力，本研究基于结构分析和潜在的新L-精氨酸结合信息开发了一种表面工程策略。所得到的E213T变体其催化活性提高了1.5倍，L-精氨酸的kcat值提高了2.4倍。分子动力学模拟进一步表明，这种氨基酸替换降低了表面L-精氨酸结合位点的亲和力，并改变了配体进入催化中心的难易程度。本研究为EFE的蛋白质工程中的远端位点及其功能关系提供了新的见解。

**引言**
乙烯是自然界中一种重要的植物激素，不仅调节多种生长和发育过程（如种子萌发和传播、细胞伸长、受精和果实成熟），还参与植物的防御机制和应激反应[[1], [2], [3], [4], [5]]。这种激素由植物和某些微生物生物合成。在植物中，乙烯的生物合成过程从l-甲硫氨酸开始，通过S-腺苷-l-甲硫氨酸合酶、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合酶和ACC氧化酶的作用逐步进行[[6], [7], [8], [9]]。微生物产乙烯的主要途径有两种：大肠杆菌和白色隐球菌利用NADH:Fe(III)-EDTA氧化还原酶将2-氧代-4-甲基硫丁酸转化为乙烯，但该途径产生的乙烯量较低[[10], [11], [12], [13]]。而与植物相关的细菌（例如假单胞菌和茄科植物致病的Ralstonia solanacearum）和真菌（例如Penicillium digitatum）则依赖于一种称为乙烯生成酶（EFE）的单一Fe(II)/2-氧戊二酸（2OG）依赖性酶[[14], [15], [16], [17], [18], [19]]。值得注意的是，仅通过异源表达efe基因就可以在多种宿主（如细菌、酵母）中产生乙烯[[20], [21], [22]]，这使得EFE成为工业上生产乙烯的理想“单基因”生物催化剂。

**生物化学特性**
P. syringae pv. phaseolicola PK2中的EFE催化一个分支反应[[23,24]：在一个分支中（“乙烯生成”），两个2OG分子被分解为乙烯和三个二氧化碳（l-精氨酸作为结合辅因子）；在另一个分支中（“精氨酸羟基化”），2OG被转化为琥珀酸和二氧化碳，同时将l-精氨酸的C5位羟基化生成5-羟基-l-精氨酸（后者进一步分解为胍和Δ1-吡咯啉-5-羧酸）（图1）。

**报告的结构**
PsEFE的已报道结构一致显示具有双链β-螺旋结构（也称为 jellyroll 或 cupin 折叠），这是Fe(II)/2OG依赖性氧化酶的特征[[25], [26], [27], [28]]。在EFE:2OG:l-Arg复合物中，2OG和l-精氨酸都结合在活性中心内，2OG的C1羧基和C2酮基与金属离子形成双齿配位，而l-精氨酸的胍基与R171相互作用[[25,26]]。在没有l-精氨酸的情况下，2OG有两种不同的配位模式：单齿配位（EFE:Mn:2OG，PDB代码：5V2X）[25]和双齿配位（EFE:Mn:2OG，PDB代码：5MOF）[26]。由于活性位点的精确几何结构，许多研究在2OG、l-精氨酸及其相邻疏水口袋的结合残基处引入了氨基酸替换。然而，这些改变通常会导致乙烯生成活性大幅降低或完全丧失[[25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]]。在针对远离活性位点的EFE表面区域进行的突变实验中，一些变体的活性有所下降，而另一些变体的活性则略有提高（与野生型WT相比）[[25,29,30]]。但迄今为止尚未有报道指出能够显著提高乙烯产量的变体。

**研究方法**
为了提高催化活性并拓宽应用潜力，本研究采用了一种蛋白质表面工程策略，通过半理性设计来调节底物的结合及其远端相互作用网络。基于结构分析和已有数据，确定了负责增强催化活性的关键区域。在该区域进行定点饱和突变后，筛选出了具有高催化活性的远端单点突变体。分子动力学（MD）模拟显示，这种远端氨基酸替换降低了表面L-精氨酸结合位点的亲和力，并改变了配体进入催化中心的难易程度，从而提高了催化活性。本研究为EFE的远端位点及其在蛋白质工程中的功能关系提供了新的见解。

**材料与方法**
**蛋白质生产和纯化**
PsEFE的DNA序列来自Pseudomonas syringae pv. phaseolicola（UNIPROT ID：P32021），随后进行了密码子优化以实现异源表达。在PsEFE的N端添加了6×His标签，并克隆到pSJ2载体中。通过DNA测序验证后，将该构建体引入BL21（DE3）感受态细胞中以生产蛋白质。
**蛋白质生产**：将单个菌落接种到含有50 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中，于37°C下过夜培养。次日，将过夜培养物转移到含有50 μg/mL氨苄青霉素的1 L TB培养基中，并在37°C、220 rpm的摇床中继续培养。当OD600值达到0.8–1.0时，通过降低温度至16°C并添加0.2 mM异丙基-β-D-硫糖吡喃苷来诱导蛋白质表达。再培养16–18小时后，通过离心（8,000×g，10 min）收集细胞沉淀，并在–80°C下保存以备进一步分析。
**蛋白质纯化**：解冻细胞沉淀，将其重新悬浮在冷却的裂解缓冲液（25 mM HEPES [pH 7.5]、300 mM NaCl和5%甘油）中，使用高压均质器进行破碎。裂解液经离心（14,000 rpm，30 min，4°C）去除细胞碎片，然后通过Ni-NTA琼脂糖柱层析（Qiagen）分离蛋白质。洗脱液使用缓冲液B（25 mM HEPES [pH 7.5]、300 mM NaCl、300 mM咪唑和5%甘油）。蛋白质表达和纯化通过SDS-PAGE进行（图S1和图S2）。6×His标签随后用TEV蛋白酶切除，并在Ni-NTA琼脂糖柱层析过程中去除。未标记的蛋白质通过流式检测并被浓缩，储存在–80°C下以备后续分析。

**定点突变**
使用表S2中列出的引物，对位于pSJ2质粒中的efe基因进行突变以产生EFE变体。通过DNA测序确认每个突变质粒的正确序列后，将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，并按照2.1节所述的步骤进行蛋白质表达和纯化。

**酶活性测定**
**气体色谱（GC）分析**：标准实验使用22 mm × 52 mm的玻璃瓶，在25±1°C的温度下进行。WT和EFE突变体（1 μM）在1 mL 25 mM HEPES缓冲液中孵育，该缓冲液含有0.5 mM 2-氧戊二酸（2OG）、0.5 mM l-精氨酸、2.0 mM l-抗坏血酸和0.2 mM (NH4)2Fe(SO4)2。40分钟后加入0.5 mL 6 M HCl终止反应。
**P5Cl-Δ-1-吡咯啉-5-羧酸（P5C）的检测**：通过2-氨基苯醛衍生化法进行定量[[32,18]]。将150 μL反应混合物与50 μL 50 mM 2-氨基苯醛（溶于40% [v/v]乙醇）混合后加入96孔板（Corning 3599，Corning Inc.，USA）中。反应混合物在37°C下孵育20分钟生成黄色衍生物，然后在SpectraMAX iD5?读数仪（Sunnyvale，CA，USA）上记录440 nm处的吸光度（消光系数ε = 2.58 mM?1·cm?1）。P5C浓度（mM）通过公式cP5C = [A × 稀释因子]/[ε × l]计算，其中A = 测得的吸光度值，稀释因子 = 4/3，ε = 2.58 mM?1·cm?1，l = 0.625 cm。

**稳态动力学**
使用上述GC方法进行稳态动力学测定，条件如下：100 nM PsEFE、25 mM HEPES (pH 7.5)、0.2 mM (NH4)2Fe(SO4)2和2.0 mM l-抗坏血酸。两种底物的浓度分别变化：l-精氨酸从0到500 μM，2OG浓度保持为0.5 mM；2OG从0到500 μM，l-精氨酸浓度保持为0.5 mM。反应结束后，使用Agilent GC-8890气相色谱仪测得顶空气体的浓度（nM/min），并根据Michaelis–Menten公式计算初始速率（v = [Vheadspace × ppm × 10??]/[Vm × t × Vsolution]，其中Vsolution = 0.001 L，Vm = 22.4 × 10?? mL/nmol）。

**蛋白质结晶和结构测定**
在厌氧条件下（4°C）进行EFE的纯化和结晶。晶体通过 Sit-Drop 气相扩散法在16°C下生成，使用含有等体积蛋白质和结晶液的2-μL液滴。在共结晶实验中，将浓缩蛋白质与底物和辅因子在冰上孵育半小时。结晶条件为：0.1 M钠草酸酯（pH 6.5）、25% (w/v) 聚乙二醇（PEG）-4000。晶体通过浸入含有20% (v/v) 甘油的保护缓冲液的液氮中进行冷冻冷却。

**数据收集和处理**
PSD数据的收集和处理使用Shanghai Synchrotron Radiation Facility的Beamline 19U1（λ = 0.9779 ?）进行。数据处理包括索引、积分和缩放，使用HKL3000程序和XDS软件包[34]。使用PHASER程序和AlphaFold预测的模型进行分子替换，随后使用COOT软件（[35]）进行迭代手动重建，并使用PHENIX套件（[36]）进行优化。使用PyMOL软件（http://www.pymol.org/）进行最终的结构可视化和图形制作（表S3）。

**分子动力学模拟**
MD分析的结构数据来自X-ray衍射数据。缺失的残基和侧链使用AMBERTools LEaP模块[39]重新构建。使用AMBER ff14SB力场为蛋白质和l-精氨酸底物设置参数[40]。复合物在立方TIP3P水盒中溶解（[41]），并通过引入对抗离子（Na+/Cl–）保持中性。GROMACS 2025.3套件（[42]）运行所有MD轨迹，系统在三维空间中受到全周期性边界条件的约束。MD模拟流程包括能量最小化阶段（结合最速下降法和共轭梯度法消除初始原子重叠），随后在NVT系综下进行1 ns的热化以达到目标温度（300 K），然后在NPT条件下进行1 ns的平衡阶段。为了确保结果的可重复性和统计显著性，每个系统进行了三次独立的生产运行，每次轨迹总长度为200 ns。

**结论**
本研究通过蛋白质表面工程策略改良了EFE，优化了底物结合和远端相互作用网络，从而提高了其催化活性。通过对关键区域的定点突变和分子动力学分析，揭示了EFE远端位点及其在蛋白质工程中的功能关系。通过引入一个集体变量，该变量与Fe与2OG中的C5原子之间的距离以及Fe与l-Arg中的C4原子之间的距离通过谐波弹簧相连，eABF通过从负弹簧力中衍生出的自适应偏置力增强了采样能力。这种拖拽机制允许有效地探索4°–20°的距离范围。模拟是使用NAMD2.14 [47]和Colvar [48]进行的。对得到的集合体的分析包括了基于VMD的可视化和MM-GB/SA计算 [49]，以量化l-Arg结合的热力学特性。

**结果与讨论**

**EFE的整体结构和l-Arg结合模式**

我们识别出PsEFE的两种晶体结构：一种为EFE:Fe:2OG，分辨率为1.87 ?；另一种为EFE:Fe:2OG:l-Arg*，分辨率为1.66 ?。PsEFE的整体结构由九个α螺旋和八个β链组成，此外还有六个主要和两个次要的β折叠片，它们组装成一个双链β螺旋（这是Fe(II)/2OG依赖性氧化酶超家族的结构特征）。在获得的结构中，活性中心仅包含2OG，Fe(II)占据六配位位点，涉及His189、Asp191、His268、2OG和两个水分子（图S5）。两种获得的结构之间的结构比较显示出很高的整体相似性（RMSD = 0.165 ?）。然而，在2OG分子的位置上观察到了显著差异。在EFE:Fe:2OG中，2OG的C2酮基和C1羧基通过氢键与R277的胍基相互作用。相比之下，在EFE:Fe:2OG:l-Arg*中，只有2OG的C1羧基与R277形成了氢键（图S6）。

在之前报道的结构中，没有一种EFE结构仅包含活性位点的铁和2OG；因此，我们将EFE:Fe:2OG与EFE:Mn:2OG（PDB代码：5V2X）[25]和EFE:Mn:2OG（PDB代码：5MOF）[26]进行了比较。我们发现EFE:Fe:2OG的整体结构与EFE:Mn:2OG（PDB代码：5MOF；RMSD = 0.190 ?）的相似度更高，而与EFE:Mn:2OG（PDB代码：5V2X；RMSD = 0.263 ?）的相似度较低，在EFE:Mn:2OG中，C末端α螺旋的方向不同（图S7a）。关于EFE:Mn:2OG（PDB代码：5MOF）的活性位点，金属与2OG形成了双齿配位。相比之下，在EFE:Fe:2OG和EFE:Mn:2OG（PDB代码：5V2X）中，2OG采用了单齿结合模式。值得注意的是，EFE:Fe:2OG中2OG的构象与其他两种结构不同。在EFE:Fe:2OG中，C2酮基和C1羧基与R277相互作用。而在其他两种结构中，只有C1羧基与R277形成了氢键（图S7b-S7e）。

比较EFE:Fe:2OG:l-Arg*和EFE:Fe:2OG:l-Arg（PDB代码：6VP4）[28]，它们的整体结构有显著差异（RMSD = 0.505 ?），尤其是在C端端的几个α螺旋上（图S8a）。在活性位点，EFE:Fe:2OG:l-Arg*中2OG采用单齿结合模式，而在EFE:Fe:2OG:l-Arg（PDB代码：6VP4）中采用双齿结合模式。铁、H189、D191、H268和R171都表现出轻微的位移。此外，E84和R316之间也观察到了显著的差异（图S8b-S8d）。进一步比较这两种结构发现，在存在l-Arg的情况下（EFE:Fe:2OG:l-Arg*），蛋白质表面靠近残基E213的位置有一个额外的电子密度，而在没有l-Arg的情况下（EFE:Fe:2OG）这个电子密度不存在（图2a和图S9）。为了进一步验证该位置是否能容纳l-Arg，我们对l-Arg进行了计算对接，并将分子动力学模拟限制在这个区域。由于l-Arg的电子密度不明确，因此使用分子对接来生成一个合理的初始位置。这个姿态经过调整和优化，以与电子密度图一致。计算出的结合亲和力为-10.6 kcal/mol，表明l-Arg的结合是稳定的，且预测的结合姿态与电子密度分布高度一致（图2b）。这些计算结果强烈表明，额外的电子密度区域代表了一个与这个表面位点结合的l-Arg分子。

**EFE的表面工程**

鉴于l-Arg在酶表面的结合模式可能会影响EFE的催化活性，我们将这一区域作为蛋白质工程的目标。随后，我们系统地分析了这一区域以解码结构-活性关系。我们汇编了之前报道的EFE变体的活性（表S4）[[25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]]，重点关注那些位于额外电子密度观察区域内的变异体。在这些变异体中，E213A变异体的活性比野生型（WT）有所提高。这表明对所识别区域的工程修饰可以调节催化活性。此外，对EFE的电静力势的映射显示，在所识别区域周围主要存在一个负电静力区域（图S11）。这种负电静力环境吸引了带正电的l-Arg胍基，可能会影响EFE的催化活性。该区域环的高灵活性（图3a和图3b）以及氨基酸序列的高保守性（图S12）进一步支持了这一远端区域的功能重要性，并激发了将其作为酶工程修改的热点。

**EFE变体的催化活性表征**

基于我们的结构和计算分析，在位置E213及其邻近残基Q31、K32和Q262进行了饱和突变（图4和表S5）。在位置Q31，用精氨酸（R）替代后，酶活性增加了116.6%；而用甲硫氨酸（M）替代后，活性增加了129.8%。相反，用其他氨基酸（包括A、T、Y、W、L和F）替代后，活性显著降低。对于K32，用色氨酸（W）替代后，活性增加了142.6%，而用缬氨酸（V）替代后，活性增加了127.1%。大多数在K32的替代并没有导致乙烯生成的显著减少。关于Q262，没有任何替代显著增强了乙烯生成活性。最后，在主要位点E213，用苏氨酸（T）替代后，催化活性增加了149.7%，用半胱氨酸（C）替代后，活性增加了146.7%。

**EFE变体的动力学参数分析**

通过测量2OG和l-Arg浓度范围内的乙烯生成情况，确定了高活性E213T和E213C变体的动力学参数（表1和图5）。对于E213T变体，其对l-Arg的Km值为41.59±2.92 μM，kcat值为15.82±0.35 min?1，表示比WT高2.4倍。对于2OG，E213T的Km值为21.57±2.02 μM，kcat值为12.78±0.31 min?1，相当于kcat提高了1.9倍。因此，E213T变体的kcat/Km增加了1.6倍，表明其对l-Arg的催化效率提高。同样，E213C变体对l-Arg的Km值为56.99±4.33 μM，kcat值为11.90±0.31 min?1，表示kcat提高了1.8倍。对于2OG，Km值为23.20±3.02 μM，kcat值为8.67±0.31 min?1，相当于比WT提高了1.3倍。

**结论**

这些计算结果强烈表明，额外的电子密度区域代表了一个与这个表面位点结合的l-Arg分子。然而，这些变异改变了配体到达催化中心的难易程度，降低了将配体（l-Arg和2OG）引入活性位点的自由能障碍，从而可能增强催化活性。结论在这项研究中，我们解析了P. syringae pv. phaseolicola PK2的EFE的两种复杂结构。在EFE:Fe:2OG:l-Arg*复合体的结构中，我们观察到蛋白质表面E213残基附近存在额外的电子密度，而在没有l-Arg的结构（EFE:Fe:2OG）中则没有这种密度。随后进行了多次计算分析，以确认该额外密度与结合在表面位点的l-Arg分子一致。为了分析l-Arg的结合模式以及所识别区域与催化活性之间的关系，我们进行了蛋白质表面工程，并选定了关键位置。通过定点突变和饱和突变构建了文库，其中一个变体（E213T）表现出比野生型更高的催化活性。进一步的分子动力学模拟为这些催化改进提供了机制上的见解，揭示了远端氨基酸的替换降低了表面l-Arg结合位点的亲和力，并改变了配体到达催化中心的难易程度。这些发现加深了我们对EFE蛋白工程中远端位点与催化活性之间关系的理解。数据可用性声明EFE:Fe:2OG和EFE:Fe:2OG:l-Arg*的原子坐标和结构因子已提交至蛋白质数据库，相应的登录代码分别为22NW和22PE。本研究中生成或分析的任何数据均已在本文及其支持信息中呈现，或可根据请求从相应作者处获取。信用声明作者贡献声明Mengyuan Wang：撰写——原始草稿、方法学、形式分析、数据整理、概念构建。Zhuanglin Shen：撰写——原始草稿、数据整理。Lian Wu：形式分析、数据整理。Weixue Huang：撰写——审稿与编辑、资金获取。Jiahai Zhou：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。Yang Gu：撰写——审稿与编辑、研究、资金获取、概念构建。