一种结合靶向与非靶向分析的统一液相色谱-质谱方法，用于废水中的群体暴露谱分析

《Environment International》：A unified liquid chromatography-mass spectrometric approach combining targeted and untargeted analyses for community exposure profiling in wastewater

　　帕维尔·洛尔基耶维奇（Pawel Lorkiewicz）| 陈锦（Jin Chen）| 大卫·霍特克（David Hoetker）| 戴蒙德·塔利（Daymond Talley）| 劳伦·B·安德森（Lauren B. Anderson）| 安娜·杜斯特霍夫（Anna Dusterhoff）| 罗谢尔·H·霍尔姆（Rochelle H. Holm）| 特德·史密斯（Ted Smith）| 桑杰伊·斯里瓦斯塔瓦（Sanjay Srivastava）| 克里斯蒂娜·李·布朗（Christina Lee Brown）
环境研究所，路易斯维尔大学医学院，302 E. 穆罕默德·阿里大道（Muhammad Ali Blvd.），路易斯维尔，肯塔基州40202，美国

**摘要**
基于废水的流行病学（Wastewater-based Epidemiology, WBE）在社区层面的环境暴露监测方面具有巨大潜力，但当前的应用在化学范围上仍然有限，并且很少将生物标志物的发现与有针对性的定量分析相结合。在这项研究中，我们开发了一个综合的废水暴露组学框架，该框架结合了非靶向的第二阶段代谢物分析（Untargeted Phase II Metabolite Profiling）和对已建立的挥发性有机化合物（Volatile Organic Compounds, VOCs）生物标志物的针对性测量，以表征社区层面的化学暴露情况。在肯塔基州杰斐逊县（Jefferson County）的路易斯维尔都会区（Louisville Metro）的十六个污水流域（包括十一个社区集水区和五个集中处理设施）中，我们检测到了194种第二阶段代谢物，这些代谢物来自145种外来物质（xenobiotics），其中包括与醛类、芳香烃类、环氧物及相关环境化学物质相关的巯基酸（mercapturic acids）、葡萄糖醛酸苷（glucuronides）和硫酸盐（sulfates）。一些代谢物在不同地点被一致检测到，而许多代谢物在空间上表现出显著异质性，尤其是在社区尺度上。针对VOC生物标志物的液相色谱-质谱（Targeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS/MS）分析也显示出在社区集水区中的变异性大于在处理中心进水口处的变异性。这些发现共同表明，整合非靶向和靶向方法可以扩展WBE的应用范围，使其能够覆盖更多的生物标志物，并提高社区层面化学暴露的空间分辨率。进一步改进标准化策略、代谢物库和数据整合将增强其用于人群暴露评估的实用性。

**1. 引言**
人类经常接触到来自交通排放、工业活动、烟草烟雾、消费品和饮食的各种复杂化学物质混合物。这些暴露物包括挥发性有机化合物（VOCs）、多环芳烃（PAHs）、杀虫剂、药物、酚类化合物和邻苯二甲酸盐（phthalates）。接触这些化学物质与神经系统疾病、心肺疾病、肝脏功能障碍、代谢紊乱、免疫失调和癌症有关（Abplanalp等人，2017；Liao等人，2022；McGraw等人，2021；Riggs等人，2022；Wahlang等人，2019；Wan等人，2024；Wang等人，2024；Wang等人，2023）。最近的基于废水的流行病学研究表明，可以通过测量废水中的尿生物标志物来评估人群对杀虫剂、邻苯二甲酸盐、PAHs及相关环境污染物的暴露情况，这支持了WBE作为一种大规模环境暴露评估的新兴方法（Aghaei等人，2024；Bowes，2024；Fattore等人，2016；Gonzalez-Marino等人，2021；Rousis等人，2017a；Rousis等人，2017b；Styszko等人，2025）。要了解与化学暴露相关的公共卫生负担，需要能够捕捉现实世界化学混合物多样性和动态性的生物监测方法（Bowes，2024）。然而，现有的监测系统所提供的暴露情况信息并不完整。大多数项目仅关注预定义的有限目标分析物，导致许多与暴露相关的化学类别未被充分研究或在常规监测中完全缺失，从而限制了全面了解人群暴露情况的能力（Gasparetto等人，2025）。尽管使用血液或尿液进行个体水平的生物监测可以提供详细的暴露评估，但这种方法成本较高、具有侵入性，并且通常仅限于相对较小的样本群体。像全国健康和营养检查调查（National Health and Nutrition Examination Survey, NHANES）这样的国家监测项目虽然提供了宝贵的人群趋势数据，但缺乏评估特定社区暴露或短期变化所需的时空分辨率（National Center for Health，2025）。因此，这些方法不足以检测城市环境中社区层面的暴露异质性。

在社区层面，公开的可获取的有毒物质释放清单（Toxic Release Inventory, TRI）数据报告了包括1,3-丁二烯（1,3-butadiene）、丙烯腈（acrylonitrile）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）和苯（benzene）在内的某些有机化学物质的排放情况。然而，这些数据并非实时提供，无法反映内部暴露负担，且可能遗漏扩散或未报告的污染源。这些局限性凸显了需要具有更高时空分辨率的可扩展方法来进行人群水平暴露评估的必要性。

环境化学物质在吸入、摄入或皮肤吸收后，会通过第一阶段（Phase I）和第二阶段（Phase II）的代谢途径发生生物转化（Chen等人，2025；Croom，2012；Testa，2007；Xie等人，2023）。第一阶段反应通过氧化、还原或水解改变母体化合物。第二阶段结合反应生成水溶性代谢物，主要是葡萄糖醛酸苷、硫酸盐和巯基酸，这些代谢物可通过尿液轻易排出体外。这些结合代谢物是内部暴露的具体和综合生物标志物（Alwis等人，2012；Chen等人，2025；Srivastava等人，2025）。由于社区废水包含了大量人群的代谢特征，它为通过污水分析评估人群水平暴露提供了独特的机会（Scherer等人，2025）。然而，大多数基于废水的流行病学研究主要关注母体化合物或少数已知的生物标志物，而不是广泛描述第二阶段的生物转化产物。因此，在社区尺度上测量多样化的结合代谢物的可行性尚未得到充分证实。

基于废水的流行病学（WBE）提供了一个分析框架，将这些混合代谢物视为社区暴露的匿名指标。WBE最初是为监测药物消费和传染病动态而开发的，现已证明其在多种应用中具有可扩展性和公共卫生价值（Bowes，2024；Fattore等人，2016；Holm等人，2022；Kilaru等人，2023；Kumar等人，2022；Meyer等人，2024；Robins等人，2022；Scherer等人，2025；Singer等人，2023；Ting等人，2024）。最近的概念验证研究将WBE扩展到了环境污染物，检测到了如丙烯醛（acrolein）、苯（benzene）、苯乙烯（styrene）和1,3-丁二烯（1,3-butadiene）等VOCs的尿代谢物，以及与燃烧源一致的季节性模式（Kumar等人，2022）。这些发现强调了WBE在识别和评估社区环境健康风险方面的潜在用途。

尽管这些研究表明将WBE应用于环境污染物是可行的，但它们在规模、化学范围和整合非靶向与靶向分析方法方面仍有局限性。此外，这些研究尚未确定废水是否可用于区分不同社区集水区的暴露差异或捕捉社区的总体暴露负担。特别是，WBE在VOCs和酚类化合物衍生代谢物方面的应用仍然有限，导致许多重要的环境相关暴露生物标志物在废水中未被充分研究。非靶向外来物质代谢物分析较为少见，且很少与有针对性的定量测定相结合。因此，关于空间异质性、暴露混合物和社区层面差异的关键信息仍然不充分。这些局限性表明需要可扩展的废水化学监测框架，并为人群水平暴露评估提供坚实的基础。为了解决这些问题，我们建立了一个结合非靶向和靶向分析方法的综合废水暴露组学框架。我们在肯塔基州路易斯维尔都会区-杰斐逊县的十六个人口多样化的社区规模污水流域中，检测到了来自145种外来物质的194种第二阶段代谢物，包括巯基酸、葡萄糖醛酸苷和硫酸盐。检测频率分析区分了在大多数地点一致存在的代谢物（≥75%）和偶见存在的代谢物（≤25%）。同时，靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定法量化了29种已建立的VOC生物标志物，包括非靶向分析未检测到的第一阶段代谢物。这些互补方法显著扩展了废水化学监测的范围，并为人群水平暴露评估提供了坚实的基础。

**2. 材料与方法**

**研究区域和污水流域描述**：本研究在美国肯塔基州的路易斯维尔都会区-杰斐逊县（Ky）进行，该地区有空气污染问题的历史（图1；表S1）。所采样的地点在收入、种族、族裔和人口规模方面具有多样性，每个研究地点的详细人口特征见表S1。站点选择还强调了少数族裔和低社会经济地位社区的代表性（Yeager等人，2021）。上游的社区级集水区包括11个站点，位于该县两个最大的水质处理中心（WQTCs）内（Holm等人，2022），其余五个站点反映了WQTC的进水情况。在研究期间及样本采集前的4周内，杰斐逊县没有观察到任何偶发的有害物质暴露事件。

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**图1. 美国肯塔基州路易斯维尔都会区-杰斐逊县的废水采样点位置**。研究包括5个废水处理中心和11个社区集水区。地图区域还包括可能造成空气污染的超基金场地（Superfund sites）、棕地场地（Brownfield sites）、有毒物质释放清单设施（Toxic Release Inventory facilities）和金属回收设施。

**废水样本收集程序**：废水样本（N = 64；16个站点×4周）在2022年2月21日至3月14日期间每周收集一次，每个站点提供24小时的时间加权混合样本。在采样时，从混合采样器中取出125 mL样品转移到聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate）瓶中，在采样和运输过程中冷藏，并按照先前的描述送至路易斯维尔大学（Holm等人，2022；Yeager等人，2021）。样品在-80°C下储存直至分析。

**化学物质和试剂**：分析物标准品及其稳定的同位素标记类似物（内部标准品，IS；表S2）从LGC Standards（曼彻斯特，NH）和Sigma-Aldrich, Inc.（圣路易斯，MO）购买。醋酸铵（ammonium acetate）和氢氧化铵（ammonium hydroxide）从Sigma-Aldrich, Inc.（圣路易斯，MO）获得。UHPLC-MS级乙腈（acetonitrile）、水和甲醇从Thermo Fisher Scientific Inc.（沃尔瑟姆，MA）购买。

**LC-MS分析平台和工作流程**：

**样品制备和固相萃取（Solid-Phase Extraction, SPE）**：废水样本在固相萃取后进行进一步处理。首先，将每份废水样本与2 mL醋酸铵（120 mM）混合，加入0.02 mL内部标准品溶液（IS），然后通过0.22 μm醋酸纤维素滤膜（2000 g，15 min；Amicon，Millipore-Sigma，圣路易斯，MO）过滤。对于SPE，使用Oasis MAX 20 ccVac RC滤柱（每柱60 mg吸附剂，30 μm粒径；Waters，米尔福德，MA），先用1 mL甲醇进行预处理，然后用1 mL 18.2 MΩ·cm水冲洗。过滤后的样品通过聚合物混合模式吸附剂进行真空处理。用1 mL 5%氢氧化铵水溶液洗涤弱结合的化合物，再用1 mL甲醇冲洗。然后使用1 mL 5%甲酸甲醇溶液将分析物洗脱到LC-MS样品管中。为防止溶剂完全蒸发和潜在的分析物损失，在氮气（N2）歧管下蒸发洗脱液之前加入0.05 mL水。样品随后用0.2 mL 0.1%甲酸溶液复溶，并在-80°C下储存直至分析。

**非靶向第二阶段代谢物分析（Untargeted Phase II Metabolite Profiling by LC-QTOF-MS）**：使用Waters Acquity I-Class UPLC与Waters Synapt XS HDMS结合，在电喷雾负离子模式下进行第二阶段代谢物的非靶向分析（Chen等人，2025）。样品注入Waters Acquity Premier HSS T3 VanGuard FIT柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm），柱温保持在45°C，流速为0.55 mL/min。流动相由溶剂A（0.1%甲酸水溶液）和溶剂B（0.1%甲酸乙腈溶液）组成。梯度程式从0% B开始，在7.30 min内上升到23% B，在2.40 min内升至95% B，在95% B下保持1.60 min，然后在0.05 min内返回0% B，并重新平衡1.95 min，总运行时间为13.30 min。毛细管电压设为1.0 kV，源温度设为112°C，脱溶剂气流速为1100 L/h（650°C），锥形气流速为125 L/h。每次运行前使用甲酸钠进行外部校准，在采集过程中注入亮氨酸脑啡肽（leucine enkephalin，m/z 554.2620）作为锁质。数据在MSE模式下采集，m/z范围为50–700 Da，连续扫描时间为0.15 sec。交替采集低能量和高能量扫描，低能量通道关闭碰撞能量，高能量通道的碰撞能量从10 V逐渐增加到40 V。原始数据在Waters UNIFI 1.9软件中处理，应用集成库引导分析（ILGA）工作流程，与包含818种第二阶段代谢物（239种巯基酸、431种葡萄糖醛酸苷、148种硫酸盐）的精心策划的光谱库进行光谱匹配，从而检测已知和假定的生物转化产物（Chen等人，2025）。由于这种方法不需要方法修改，因此可以方便地应用于废水（和其他生物基质）分析。

**靶向VOC代谢物定量（Targeted VOC Metabolite Quantification by LC-MS/MS）**：VOC代谢物使用综合的VOC和烟草生物碱（CVT）LC-MS/MS测定法进行测定（Srivastava等人，2025）。每个样本注入5微升样品到柱子中，然后用二元溶剂系统洗脱，其中溶剂A由15 mM醋酸铵水溶液（pH 6.8）组成，溶剂B为100%乙腈。梯度洗脱程式从97%溶剂A和3%溶剂B开始，流速为0.45 mL/min，随后在1.3 min内逐渐增加到5%溶剂B，然后在1.3 min内增加到10%溶剂B，接着在1.35 min内增加到30%溶剂B，最后在1.01 min内增加到40%溶剂B。然后将梯度降低到0.34分钟内15%的B浓度，接着在0.3分钟内降至10%的B浓度，然后再在0.36分钟内降至3%的B浓度，并保持该浓度2.64分钟。分析物从柱子中洗脱到质谱仪中，并在以下条件下以负离子模式进行离子化：毛细管电压设定为0.3 kV，源温度维持在150°C，脱溶剂温度为500°C，锥形气体流量为150 L/h，脱溶剂气体流量为1000 L/h。使用自动优化程序（IntelliStart，Waters，Milford，MA）来确定离子化电压、碰撞能量和产物离子。多个反应监测（MRM）转换被编程到MassLynx 4.2中并使用优化后的设置。使用TargetLynx软件（Waters Inc.，MA）进行峰积分、校准和定量。根据水中制备的10点标准曲线，基于峰面积比对废水样本中的分析物进行定量。在每批废水样本之前和之后都运行标准曲线以确保准确的定量。根据美国食品药品监督管理局的生物分析方法验证指南（FDA，2018年），检测限（LOD）被定义为分析物信号与背景噪声可区分的最低浓度（信噪比≥3），而定量限（LOQ）被定义为能够以可接受的准确性和精确度量化的最低分析物浓度，在这里被指定为与标称值偏差在±20%以内的最低校准标准（见表S3）。为了评估精度，在一批样本运行中多次注射合并的废水质量控制（QC）样本，并计算每个分析物的变异系数（%CV）（数值列在表S4中）。

数据处理和统计分析：原始LC-QTOF-MS数据使用UNIFI和ILGA工作流程进行加工（Chen等人，2025年）。在特征检测和峰选择后，根据m/z和保留时间定义的色谱信号在内部的第二相代谢物库中进行查询。分别对巯基酸、葡萄糖醛酸和硫酸盐进行注释，以便检测已知和假定的结合物。代谢物丰度经过对数转换以稳定方差并近似正态分布。检测频率计算为在每个位置观察到代谢物的采样周数（0-4周）。在所有位置至少检测到一次的代谢物（≥4个时间点中的1个；≥25%的频率）被归为一组，而在大多数时间点在所有位置一致检测到的代谢物（≥4个时间点中的3个；≥75%的频率）被归为第二组。通过从所有位置的平均信号中减去每个代谢物的平均值并除以标准差来计算Z分数。

对于靶向分析，在TargetLynx中积分峰面积，然后根据内标进行归一化，并使用外部校准曲线进行定量。浓度数据使用中位数、四分位数范围（IQR，第25-75百分位数）和全范围（最小值-最大值）进行总结。使用GraphPad Prism（版本10.4.1）中的非参数测试评估相邻流域和废水处理中心（WQTC）之间的IQR统计差异。

跨平台比较未靶向和靶向数据仅限于两种工作流程都能检测到的代谢物。未靶向响应在所有位置之间进行最小-最大归一化，以便与靶向浓度进行视觉比较。使用GraphPad Prism生成图表。通过每批样本中多次注射的合并废水质量控制（QC）样本来评估分析重复性；计算所有分析物的%CV值以确保精度保持在可接受的范围内。对于分子网络可视化，代谢物-位置关联表示为二分图。节点对应于采样位置或个别代谢物，边表示检测事件。边权重反映了检测频率（0-4），网络按结合物类别（巯基酸、葡萄糖醛酸、硫酸盐）进行颜色编码。图表在Cytoscape（版本3.10.2）中生成，分子网络数据提供在补充材料中。

为了调整每个社区样本中贡献个体的数量，我们评估了四种归一化因子：可替宁、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）、辣椒花叶病毒（PMMoV）和来自普查区域数据的下水道估计人口。这些因子代表了人类贡献和下水道负荷的互补指标。可替宁、5-HIAA和PMMoV在研究地点的浓度在补充材料中提供（表S10）。可替宁是尼古丁的稳定尿液代谢物，是已知的人类输入标志物（Choi等人，2018年；Rico等人，2017年）。5-HIAA是血清素代谢物，是总尿液排泄的内源性指标（Rico等人，2017年）。PMMoV是一种植物来源的RNA病毒，通过人类粪便排出，是广泛接受的粪便强度和人口连通性的标志物（Ahmed等人，2020年）。包括人口规模在内，以解释不同下水道区域之间的人口差异（Choi等人，2018年；Ting等人，2024年；Yeager等人，2021年）。可替宁、5-HIAA和PMMoH在研究地点的分布提供在补充材料中。归一化应用于未靶向（ILGA）和靶向（LC-MS/MS）数据集。对于靶向VOC代谢物分析，在WQTC地点评估PMMoV和人口规模作为候选归一化因子，以解释合并的雨水系统和卫生下水道系统中的废水稀释以及贡献人口规模的差异。由于这些位置的流量没有监测，因此无法对邻近样本进行基于流量的归一化。

3. 废水中的第二相代谢物分析：我们分析了肯塔基州杰斐逊县16个地点的64个废水样本，包括11个社区流域和5个废水处理中心。使用先前开发的集成库引导分析（ILGA）LC-MS工作流程（Chen等人，2025年）。在所有样本中测定了第二相代谢物。总共在废水中检测到194种第二相代谢物（图2A-B），包括80种MA（46个母体，12个组）、87种GA（79个母体，15个组）和27种SA（20个母体，2个组）（表S5）。这个总数反映了重复注释的计数（总共248个注释），这些注释仅因作为单一第二相代谢物的保留时间不同，而不是作为独立检测（表S6）。

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图2. 按结合物类别（A）检测到的代谢物总数，包括巯基酸（MA）、葡萄糖醛酸（GA）和硫酸盐（SA）。B面板显示按未结合母体化合物分组的相同代谢物，每个结合物类别的计数分别显示。分析包括从肯塔基州杰斐逊县16个地点收集的64个废水样本，包括11个社区流域和5个废水处理中心。

第二相代谢物在地点之间出现的一致性和变异性：检测频率在地点之间和随时间点变化（图3A-C）。在三种代谢物类别中，GA的共检频率最高，其次是MA，而SA的检测一致性最低。地点S1、S2、S3、S4和S11（见表S1中的地点信息）在四个采样窗口中都有超过75%（3-4次）的代谢物数量。在这些位置，高频检测主要由葡萄糖醛酸和巯基酸组成，而硫酸盐的贡献较小（例如，S1：34个GA，50个MA，5个SA；S3：30个GA，52个MA，4个SA）。在S9、S12、S13、S14和S15记录到较低的频率计数（例如，S9：21个GA，23个MA，3个SA）。鉴于检测到的代谢物的偶发性，我们接下来确定了空间和时间上更具一致性的子集。具体来说，有41种代谢物在所有地点至少被检测到一次（广泛检测的代谢物），而在十六个地点中的每一个都至少在三个采样窗口中被检测到一组更严格的15种代谢物。尽管广泛存在，但核心组中的几个代谢物显示出高度局部富集，在只有一个地点的检测频率达到4次；MA67（甲基丙烯酸）和MA18（4-羟基-2-庚烯醛）在S2；MA76（2-甲基丙基氨基甲酸）在S9；GA89（4-羟基-2-庚烯醛）、SA21（酪胺）和SA51（多巴胺）在S16；以及S3中的多种化合物属于多种化学类别（例如，MA31（萘），MA37（丙烯腈），GA61（3-氯-1,2-丙二醇）。

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图3. 肯塔基州杰斐逊县十六个废水地点的第二相代谢物分布。热图显示了64个废水样本中（A）巯基酸（MA）、（B）葡萄糖醛酸（GA）和（C）硫酸盐（SA）的站点级检测频率（0-4次），包括11个社区流域和五个废水处理中心。

跨地点识别出的独特代谢物特征：我们首先检查了在每个地点至少检测到一次的41种代谢物（≥1个时间点；≥25%的频率）（见表1）。这些代谢物来自14个母体组的35个母体化合物，包括19种MA、16种GA和6种SA。Z分数分析显示了广泛的空间变异性，地点S1、S3和S4显示了高于平均水平的化合物数量最多，而地点S11在GA95（4-氧代-2-庚烯酸）和GA28（甘油）等GA方面表现出较高的水平，S6在包括GA100（二氢咖啡酸）和GA36（2-乙基己基3-羟基丙酸）等化合物方面显示出更强的信号。这一更广泛组中的独特母体组，包括多环芳烃（PAHs）、单萜类、环氧体和卤代脂环族化合物，是空间变异最大的。 juga出现了低丰度簇，地点S9、S14和S15一致显示出负Z分数。这组中的几种代谢物表现出高度局部富集，在只有一个地点的检测频率达到4次，包括S1中的MA48（卤代丁烯）；S2中的MA67（甲基丙烯酸）和MA18（4-羟基-2-庚烯醛）；S9中的MA76（2-甲基丙基氨基甲酸）；S16中的GA89（4-羟基-2-庚烯醛）、SA21（酪胺）和SA51（多巴胺）；以及S3中的多种化合物属于多种化学类别（例如，MA31（萘），MA37（丙烯腈），GA61（3-氯-1,2-丙二醇）。

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图3. 肯塔基州杰斐逊县十六个废水地点的第二相代谢物分布。热图显示了（A）巯基酸（MA）、（B）葡萄糖醛酸（GA）和（C）硫酸盐（SA）在64个废水样本中的站点级检测频率（0-4次），包括11个社区流域和五个废水处理中心。

我们首先检查了在每个地点至少检测到一次的41种代谢物（≥1个时间点；≥25%的频率）（见表1）。这些代谢物来自14个母体组的35个母体化合物，包括19种MA、16种GA和6种SA。Z分数分析显示了广泛的空间变异，地点S1、S3和S4显示出高于平均水平的化合物数量最多，而地点S11在GA95（4-氧代-2-庚烯酸）和GA28（甘油）等GA方面表现出较高水平，S6在包括GA100（二氢咖啡酸）和GA36（2-乙基己基3-羟基丙酸）等化合物方面显示出更强信号。 cette更广泛组中的独特母体组，包括多环芳烃（PAHs）、单萜类、环氧体和卤代脂肪族化合物，是空间变异最大的。也出现了低丰度簇，地点S9、S14和S15一致显示出负Z分数。这组中的几种代谢物表现出高度局部富集，在只有一个地点的检测频率达到4次，包括S1中的MA48（卤代丁烯）；S2中的MA67（甲基丙烯酸）和MA18（4-羟基-2-庚烯醛）；S9中的MA76（2-甲基丙基氨基甲酸）；S16中的GA89（4-羟基-2-庚烯醛）、SA21（酪胺）和SA51（多巴胺）；以及S3中的多种化合物属于多种化学类别（例如，MA31（萘），MA37（丙烯腈），GA61（3-氯-1,2-丙二醇）。

表1. 第二相代谢物在废水采样地点和时间点上的检测一致性。
名称 组别 提出的母体化合物 代谢物名称 重复次数
MA1 脂肪族醛 4-羟基-2-庚烯醛 N-Acetyl-S-[1-(2-氧代乙基)-2-羟基丁基]-L-半胱氨酸 1
MA2 4-羟基-2-辛烯醛 N-Acetyl-S-[1-(羧甲基)-2-羟基己基]-L-半胱氨酸 1
MA3 丙烯醛 N-Acetyl-S-(2-羧基乙基)-L-半胱氨酸 1
MA5 2-戊烯醛 N-Acetyl-S-(1-乙基-3-羟基丙基)-L-半胱氨酸 1
MA8 12-己烯醛 N-Acetyl-S-[(1S)-1-(2-氧代乙基)丁基]-L-半胱氨酸 1
MA6 肉桂醛 N-Acetyl-S-(3-羟基-1-苯基丙基)-L-半胱氨酸 3
MA58 苯/单环芳烃 浅醌 N-Acetyl-S-(2,5-二羟基苯基)-L-半胱氨酸 1
MA56 环氧化物 甘油二醇 N-Acetyl-S-(2,3-二羟基丙基)-L-半胱氨酸 1
MA47 卤代脂肪族 卤代丁烯 N-Acetyl-S-(1,2-二羟基丁基)-L-半胱氨酸 1
MA49 卤代丁烯 N-Acetyl-S-(1,2-二羟基丁基)-L-半胱氨酸 3
MA2 单萜类及其衍生物 苦橙烯 N-Acetyl-S-(limonene-8,9-二醇)-L-半胱氨酸 1
MA4 苦橙烯 N-Acetyl-S-(limonene-1,2-二醇)-L-半胱氨酸 1
MA32 其他脂肪族 N,N-二甲基甲酰胺 N-Acetyl-S-(N-甲基氨基甲酰)-L-半胱氨酸 3
MA46 1,3-丁二烯 N-Acetyl-S-(2-羟基-3-丁烯-1-yl)-L-半胱氨酸 3
MA54 1,3-丁二烯 N-Acetyl-S-(2,3,4-三羟基丁基)-L-半胱氨酸 3
MA64 丁基丙烯酸 N-Acetyl-S-(3-丁氧基-3-氧代丙基)-L-半胱氨酸 1
MA76 2-甲基丙基氨基甲酸 N-Acetyl-(2-甲基丙基氨基甲酸)-L-半胱氨酸 1
MA73 苯氧甲基 苯氧甲基 N-Acetyl-S-(butylcarbamate)-L-半胱氨酸 1
MA30 芳香族 对乙酰氨基酚 N-Acetyl-S-[5-(乙酰氨基)-2-羟基苯基]-L-半胱氨酸 3
MA71 多环芳烃 苯[a]芘 N-Acetyl-S-(7,8,9,10-四氢-8,9,10-三羟基苯[a]芘-7-yl)-L-半胱氨酸 1
GA39 脂肪族醛 4-羟基-2-庚烯醛 2-庚烯醛-4-葡萄糖醛酸 1
GA9 4-羟基-2-辛烯醛 4-羟基辛烯羧酸葡萄糖醛酸 3
GA10 苯/单环芳烃 (4-甲基苯基)乙醇 1-(4-甲基苯基)乙基 β-D-葡萄糖醛酸 3
GA16 苯丙酸 1-苯丙酸 β-D-葡萄糖醛酸 3
GA19 4-苯基-3-丁烯-2-醇 1-甲基-3-苯基-2-丙烯-1-yl β-D-葡萄糖醛酸 1
GA35 丙基戊醇 2-乙氧基-5-(1-丙烯-1-yl)苯 β-D-葡萄糖醛酸 3
GA54 2-甲基-5-苯基戊醇 2-甲基-5-苯基戊基 β-D-葡萄糖醛酸 3
GA3 胆汁酸 吲哚乙酸 吲哚乙酸 3-葡萄糖醛酸 1
GA100 饮食酚类和黄酮 SA39是该集合中唯一的硫酸盐，主要与S4站点相关。目标是量化废水中的VOC代谢物：我们检测到了15种在多个站点普遍存在的尿液VOC代谢物。为了更精确地量化这些及相关化合物，我们应用了一种靶向的LC-MS/MS检测方法（Srivastava等人，2025年）。该方法旨在测量29种尿液挥发性有机化合物代谢物（VOCm）（详见表S2，其中列出了该方法分析的所有VOCm的完整列表，以及表S7中列出的在废水样本中检测到的所有VOCm的列表），包括无法通过非靶向分析检测到的I期代谢物，如MUCA（苯）和MADA（苯乙烯）。非靶向数据集与靶向检测方法之间的重叠情况总结在表2中，而靶向测量的浓度范围显示在表S8中。大多数代谢物在四个时间点上的四个站点中都被一致地检测到，反映了其在废水中的广泛存在。少数代谢物的检测频率略低（≥75%），而只有少数化合物在不同站点或时间点间出现零星分布。例如，N-乙酰-S-(2-氰乙基)-L-半胱氨酸（2CyEMA；丙烯腈）仅在S12站点被检测到一次，而2-甲基马尿酸（2MHA；二甲苯）在S12和S13站点都被检测到。较为丰富的化合物包括马尿酸（MUCA；苯）、扁桃酸（MADA；苯乙烯）和由巴豆醛衍生的3-羟基-1-甲基丙基巯基酸（3HMPMA），其次是丙烯醛代谢物3-羟基丙基巯基酸（3HPMA）和羧基乙基巯基酸（2CoEMA）。检测到的代谢物的完整浓度范围显示在图5中。部分代谢物（2CoEMA、2CyEMA、2HEMA和2HPMA）通过非靶向和靶向方法都得到了一致性的检测，并在图6中进行了直接比较。尿液VOCm的站点级变异性在邻近集水区比在处理厂进水口中更大，这通过更宽的四分位距范围和更多的异常值表现出来（图5，表S9）。在几种代谢物中观察到了统计学上的显著差异，包括丙烯醛（3HPMA，p=0.006）、丙烯酰胺（2CaEMA，p=0.005）、丙烯腈（2CyEMA，p=0.043）、巴豆醛（3HMPMA，p=0.036）、环氧丙烷（2HPMA，p=0.005）和甲苯/苯甲醇（BzMA，p=0.020）。相比之下，其他VOC的代谢物在各个集水区和WQTC中的分布相对均匀。

表2. 通过非靶向分析检测到的挥发性有机化合物（VOC）衍生物代谢物及其与综合VOC和TA（CVT）检测方法的覆盖范围。
名称 代谢物名称 缩写 建议的母体化合物
MA38 N-乙酰-S-(3,4-二羟基丁基)-L-半胱氨酸 34HBMA
MA15 N-乙酰-S-(3-羟基丙基)-L-半胱氨酸 3HPMA
MA36 N-乙酰-S-(2-羧基乙基)-L-半胱氨酸 2CoEMA
MA29 N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酸 2CaEMA
MA40 N-乙酰-S-(2-氨基甲酰-2-羟基乙基)-L-半胱氨酸 2CaHEMA
MA37 N-乙酰-S-(2-氰乙基)-L-半胱氨酸 2CyEMA
MA42 N-乙酰-S-(3-羟基-1-甲基丙基)-L-半胱氨酸 3HMPMA
MA41 N-乙酰-S-(2-羟基乙基)-L-半胱氨酸 2HEMA
MA56 N-乙酰-S-(2,3-二羟基丙基)-L-半胱氨酸 23HPMA
MA44 N-乙酰-S-(2-羟基-3-甲基-3-丁烯-1-基)-L-半胱氨酸 2HMBeMA
MA70 N-乙酰-S-(4-羟基-2-甲基-2-丁烯-1-基)-L-半胱氨酸 4HMBeMA
MA32 N-乙酰-S-(N-甲基氨基甲酰)-L-半胱氨酸 MCaM
MA11 N-乙酰-S-(2-羟基丙基)-L-半胱氨酸 2HPMA
MA34 N-乙酰-S-苯基-L-半胱氨酸 BzMA
MA56 N-乙酰-S-苯 Toluene

该表列出了使用我们的非靶向高分辨率液相色谱-质谱工作流程识别的14种已知挥发性有机化合物（VOCs）的代谢物。标有“是”的代谢物也可以使用综合VOC和TA（CVT）检测方法进行测量，这是一种经过验证的靶向方法，可以量化35种尿液生物标志物，包括VOC代谢物和烟草生物碱（Srivastava等人，2025年）。

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图5. 通过靶向分析测量的废水样本中挥发性有机化合物代谢物（VOCm）的浓度分布。箱线图表示十六个采样点（包括五个废水处理中心和11个邻近井）选定VOCm的对数转换浓度。数据是使用综合VOC和烟草生物碱（CVT）液相色谱-串联质谱检测方法获得的。

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图6. 16个废水站点中选定挥发性有机化合物衍生物代谢物的靶向与非靶向检测比较。每个代谢物由一对面板显示，左侧为最小-最大归一化响应（条形图），右侧为对数转换的原始响应（点图），分别对应靶向（蓝色）和非靶向（红色）数据。代谢物包括N-乙酰-S-(2-羧基乙基)-L-半胱氨酸（2CoEMA；丙烯醛）、N-乙酰-S-(2-氰乙基)-L-半胱氨酸（2CyEMA；丙烯腈）、N-乙酰-S-(2-羟基乙基)-L-半胱氨酸（2HEMA；环氧丙烷）和N-乙酰-S-(2-羟基丙基)-L-半胱氨酸（2HPMA；环氧丙烷）。A、C、E和G面板显示归一化响应，B、D、F和H面板显示对数转换的信号强度。（关于此图例中颜色的解释，请参考本文的网络版本。）

非靶向分析与靶向定量：对于四种具有足够强且一致的废水信号的代谢物（2CoEMA（丙烯醛）、2CyEMA（丙烯腈）、2HEMA（环氧丙烷）和2HPMA（环氧丙烷），可以直接进行非靶向分析与靶向定量之间的比较（图6）。对于其余代谢物，要么浓度太低，要么变异性太大，无法进行可靠比较。图6显示了2CoEMA、2CyEMA、2HEMA和2HPMA每种化合物的最小-最大归一化响应的条形图以及对数转换强度的点图。这两种方法捕捉到了类似的站点级模式，S1–S3站点的响应较高，而S9和S15站点的值较低。对于2CoEMA（丙烯醛）和2CyEMA（丙烯腈），靶向和非靶向响应在大多数站点上紧密跟踪，支持了两种方法之间的一致性。2HEMA（环氧丙烷）和2HPMA（环氧丙烷）显示出更大的差异，非靶向数据在某些站点的相对响应较高，而靶向分析则在中等范围内提供了更紧密的聚类。尽管存在这些差异，两种分析方法在四种代谢物上产生的空间趋势大体相似。

比较分析的标准化策略评估：将非靶向数据集标准化到四个因素中的任何一个都没有减少总体变异（见图S2和S3）。使用可替宁或5-HIAA进行调整仅导致%CVs的微小变化，少数个别站点显示出局部下降。基于人群的校正使变异平均增加了约28%，而PMMoV标准化进一步放大了变异，使%CVs比未标准化数据增加了80%以上。这些结果表明，没有一种测试的标准化因素能够改善站点间的数据一致性。在WQTC站点的VOC代谢物分析中，也评估了PMMoV和人口规模的标准化（见图S4–S18）。两种标准化方法都没有明显改善目标VOC代谢物谱的可解释性。可替宁、5-HIAA和PMMoV的测量浓度或丰度在补充材料中提供。

讨论：通过将非靶向ILGA分析与靶向LC–MS/MS相结合，本研究支持了对结合有机化合物代谢物的社区规模废水监测。ILGA定义了II期代谢物在各站点的存在和检测频率，这些结果指导了选择进行靶向测量和量化的化合物。我们的框架量化了VOC衍生物代谢物本身，而不是母体VOCs，以捕捉人体内部暴露的特征，同时减少了直接工业VOC排放对污水系统的潜在干扰。这些分析共同定义了可在废水中检测到的结合有机化合物代谢物的范围和相对稳定性。先前的定量和可疑筛查WBE研究通常只识别了一组有限的化合物（Foppe等人，2021年；Kumar等人，2022年；Ting等人，2024年），或者关注如药物等更狭窄的化学物质范围（Meyer等人，2024年），而本研究实现了更广泛的覆盖范围，从145种母体化学结构中鉴定出了194种标记的MA、GA和SA。检测到的代谢物代表了多种化学类别，包括芳香族化合物、脂肪族醛类、酚类、卤代烃类、多环芳烃类和单萜类。来自苯相关芳香族化合物、醛类和酚类的化合物在各站点中最常见。除了广泛的分析覆盖外，废水中的检测模式还揭示了关于结合代谢物环境稳定性的额外信息。先前的研究表明，葡萄糖醛苷可以通过β-葡萄糖醛酸酶在废水中发生酶促水解，其降解半衰期根据化合物类别和基质条件从几小时到几天不等（Gao等人，2018年；Scherer等人，2025年；Senta等人，2014年；Shimko等人，2022年）。在本研究中，回收到了超过一百种不同的GA，表明许多葡萄糖醛苷结合物在所使用的采样、处理和储存条件下仍然可检测到。这与先前的报告一致，其中从废水中回收到了乙基葡萄糖醛苷、吗啡葡萄糖醛苷和某些甾体葡萄糖醛苷，尽管一些葡萄糖醛苷在某些条件下也会降解（Gao等人，2018年；Scherer等人，2025年；Senta等人，2014年；Shimko等人，2022年）。这些观察结果表明，废水中葡萄糖醛苷的回收取决于化合物的具体行为和研究条件，不应普遍适用于所有葡萄糖醛苷。硫酸盐在结合类别中最少。这可能是由于这些代谢物在污水系统中的降解或水解，这与生物活性废水环境中的脱硫酸作用报告一致（Al-Horani和Desai，2010年；Gao等人，2018年；Scherer等人，2025年）。或者，硫酸化在异生物质类别中的发生可能不如葡萄糖醛苷化或巯基化普遍，导致总体上可检测到的硫酸盐结合物较少（Jancova等人，2010年）。

代谢物在不同研究区域之间的分布有所不同。非靶向分析识别出41种在所有站点都被检测到的代谢物，以及一组在每个站点都被检测到的15种核心代谢物。在这组代谢物中，几种来自挥发性有机化合物的MA，包括2CoEMA、3HPMA、34HBMA、2CaEMA、2CyEMA、3HMPMA、2HEMA、2HPMA和BzMA，在非靶向和靶向分析中都得到了检测，并且在站点间显示出相似的空间分布。两个数据集都在较小的上游集水区（站点S1–S4）显示出更高的响应，在处理厂进水口（S9、S15）显示出较低的水平。邻近站点的3HPMA、2CaEMA、2CyEMA、3HMPMA和2HPMA的四分位距范围更广，变异性更高（p<0.05），这可能反映了与交通和工业源相关的局部变异。相比之下，处理中心整合了来自更大、人口混合的废水，产生了更稳定的浓度谱。ILGA和LC-MS/MS结果的一致空间模式表明，非靶向II期代谢物分析可以可靠地指示社区层面的暴露梯度，而靶向分析在同一化学领域提供了定量确认。

除了站点特定的变化外，不同结合类别的空间趋势也有所不同。GA在各站点中占主导地位，其次是MA和SA，这与结合途径和代谢物在废水中的持久性存在差异一致。葡萄糖醛苷化是人体中的一个主要II期途径，发生在广泛的异生物质和内源性底物中（Chen等人，2025年；Croom，2012年）。因此，GA包括来自更大化学领域的代谢物，包括药物、环境污染物和饮食成分，这解释了它们在废水中的更高丰度（Chen等人，2025年；Jancova等人，2010年）。相比之下，巯基酸主要来自如VOCs和其他与谷胱甘肽结合的活性亲电试剂，形成了一组较小的环境代谢物（Hanna和Anders，2019年；Xie等人，2023年）。最后，SA的丰度最低，这与它们的极性和在污水环境中易受微生物脱硫的影响一致（Al-Horani和Desai，2010年；Gao等人，2018年；Scherer等人，2025年）。这些模式表明，GA、MA和SA在废水中的分布遵循人体中的代谢趋势，葡萄糖醛苷化发生在更广泛的底物上，而硫酸化仅限于少数化合物。每个集水区对应于人口结构和工业环境不同的邻近地区（Holm等人，2022年；Yeager等人，2021年）。虽然采样框架旨在包括人口规模和社会经济特征不同的邻近地区，但本研究并未直接评估这些指标与代谢物水平之间的关联。此处观察到的空间异质性可能反映了当地排放源和社区特征的差异。未来的研究需要结合人口和差异性数据集，以确定VOCm负荷的增加是否与社交经济或健康脆弱性的差异相符。

在评估了几种未能得出明确结果的标准化方法后，比较是基于未归一化的响应进行的。严格的采样协议、相同的样本量和分析重复性支持了站点间的可靠相对解释；尽管如此，未来的工作将专注于开发和验证适当的数据校正方法。

来源归属：工业和环境暴露：数据集中的空间和化学模式提供了关于贡献于检测到的代谢物的环境和工业来源的见解，特别是对于研究较少的II期结合物。几种II期母体化合物对应于有毒物质清单（TRI）中列出的化学物质（美国环境保护署2025b），包括1HMPeMA和4HBeMA（1,3-丁二烯）、2CyEMA（丙烯腈）、MCaMA（N,N-二甲甲酰胺）和MUCA（苯）。这些代谢物在大多数站点中都一致地被检测到，包括研究区域内没有报告工业排放的地点，表明它们来自扩散的或未报告的来源。这些代谢物在主要为住宅区的一些集水区以及一些住宅和工业混合的集水区都被检测到，表明废水结合了多种暴露途径的特征，提供了与监管排放清单互补的独立证据层。在非靶向数据集中，194种检测到的VOCm中有112种在三个或更多站点中出现三次或更多次，代表79种独特的母体化合物，其中19种列在TRI数据库中。这九种物质（1,3-丁二烯、丙烯腈、丁基丙烯酸酯、甲醛、甲基丙烯酸酯、萘、苯乙烯、甲苯和苯）最近在杰斐逊县都有被记录的释放事件。其中1,3-丁二烯来自石油加工，特别值得注意，因为它通常不与家庭来源相关联，但在所有废水样本中都以MA54和MA46（1,3-丁二烯）的形式被检测到，这与路易斯维尔之前的空气监测数据一致（Mukerjee等人，2020年）。虽然也有报告称甲基丙烯酸酯在本地有释放，但其出现频率较低（64个样本中有25个），表明其检测不仅取决于排放量，还取决于化合物的挥发性、反应性和持久性。另外还有12种被列入TRI清单的母体化合物，包括丙烯醛、丙二醇、环氧丙烷、丙烯酰胺和N,N-二甲酰胺，尽管在杰斐逊县没有报道过这些物质的释放。在这些化合物中，MCaMA（N,N-二甲酰胺）在所有样本中都被检测到（64/64），这表明要么是未报告的排放，要么是在工业和实验室环境中存在广泛的背景使用。MCaMA的持续检测也可能反映了其在废水中的化学稳定性优于其他更活跃的VOC衍生物代谢物。废水中的测量信号与报告的排放量之间的差异表明，废水分析能够识别当前报告系统未能捕捉到的活跃和残留污染。

这九种物质（1,3-丁二烯、丙烯腈、丁基丙烯酸酯、甲醛、甲基丙烯酸酯、萘、苯乙烯、甲苯和苯）最近在杰斐逊县都有被记录的释放事件。其中1,3-丁二烯来自石油加工，特别值得注意，因为它通常不与家庭来源相关联，但在所有废水样本中都以MA54和MA46（1,3-丁二烯）的形式被检测到，这与路易斯维尔之前的空气监测数据一致（Mukerjee等人，2020年）。虽然也有报告称甲基丙烯酸酯在本地有释放，但其出现频率较低（64个样本中有25个），表明其检测不仅取决于排放量，还取决于化合物的挥发性、反应性和持久性。另外还有12种被列入TRI清单的母体化合物，包括丙烯醛、丙二醇、环氧丙烷、丙烯酰胺和N,N-二甲酰胺，尽管在杰斐逊县没有报道过这些物质的释放。在这些化合物中，MCaMA（N,N-二甲酰胺）在所有样本中都被检测到（64/64），这表明要么是未报告的排放，要么是在工业和实验室环境中存在广泛的背景使用。MCaMA的持续检测也可能反映了其在废水中的化学稳定性优于其他更活跃的VOC衍生物代谢物。废水中的测量信号与报告的排放量之间的差异表明，废水分析能够识别当前报告系统未能捕捉到的活跃和残留污染。

这九种物质（1,3-丁二烯、丙烯腈、丁基丙烯酸酯、甲醛、甲基丙烯酸酯、萘、苯乙烯、甲苯和苯）最近在杰斐逊县都有被记录的释放事件。其中1,3-丁二烯来自石油加工，特别值得注意，因为它通常不与家庭来源相关联，但在所有废水样本中都以MA54和MA46（1,3-丁二烯）的形式被检测到，这与路易斯维尔之前的空气监测数据一致（Mukerjee等人，2020年）。虽然也有报告称甲基丙烯酸酯在本地有释放，但其出现频率较低（64个样本中有25个），表明其检测不仅取决于排放量，还取决于化合物的挥发性、反应性和持久性。另外还有12种被列入TRI清单的母体化合物，包括丙烯醛、丙二醇、环氧丙烷、丙烯酰胺和N,N-二甲酰胺，尽管在杰斐逊县没有报道过这些物质的释放。在这些化合物中，MCaMA（N,N-二甲酰胺）在所有样本中都被检测到（64/64），这表明要么是未报告的排放，要么是在工业和实验室环境中存在广泛的背景使用。MCaMA的持续检测也可能反映了其在废水中的化学稳定性优于其他更活跃的VOC衍生物代谢物。废水中的测量信号与报告的排放量之间的差异表明，废水分析能够识别当前报告系统未能捕捉到的活跃和残留污染。

这些发现说明了基于废水的暴露组学如何通过增加空间分辨率和社区背景，扩展了传统生物监测的范围。如MUCA（苯）、3HPMA（丙烯醛）、1HMPeMA和4HBeMA（1,3-丁二烯）等代谢物的持续检测表明，人群普遍暴露于与心血管疾病、神经系统疾病、癌症和免疫功能障碍相关的化合物（Abplanalp等人，2017年；Liao等人，2022年；Riggs等人，2022年；Wan等人，2024年；Wang等人，2024年）。这些检测到的代谢物与大规模人类研究（如NHANES，国家卫生中心，2025年）中测量的结果相似，证实了废水中观察到的化学负担反映了真实的、生物学上相关的暴露。废水检测结果与同一地区的大气VOC测量结果之间的重叠进一步证明了吸入的污染物会在废水中以可追踪的形式被代谢和排出，从而将环境中的存在与人体摄入联系起来。这种联系加强了这样的解释：社区规模的废水信号提供了环境和行为暴露的综合指标，包括吸入和产品使用。由于社区级别的集水区代表了不同的人口群体（Holm等人，2022年；Yeager等人，2021年），将化学谱型与 socioeconomic 和健康指标联系起来可以揭示较高VOC负荷是否与经历更大环境和/或公共卫生脆弱性的社区相关。将WBE的输出与EPA的环境正义筛查和映射工具（EJSCREEN，美国环境保护署，2025a）或当地健康指标结合使用，可以实现对化学暴露强度和人口风险的空间比较。

总体而言，这些发现展示了基于废水的暴露组学如何通过增加空间分辨率和社区背景来扩展传统的生物监测。通过将高频环境采样与已建立的生物标志物解释框架相结合，WBE提供了一种早期预警和优先级工具，用于识别化学负担过重的社区。然而，这些结果的解释受到废水分析固有因素的限制。时间覆盖范围仅限于四个采样时期，可能无法完全捕捉季节性或短期变化。某些代谢物（特别是硫酸盐和其他不稳定的结合物）在运输或储存过程中可能会降解，导致其真实丰度被低估。此外，许多II期结合物（包括葡萄糖醛酸酯和硫酸盐）可能来自非人类来源，如宠物废物、城市野生动物或农业径流，而不仅仅是人类排泄。除了降解外，污水生物膜中的微生物活动也可能转化或合成结合代谢物，从而可能导致某些人体生物标志物的信号改变或误归因。尽管ILGA库非常全面，但它并不包含所有潜在的结合代谢物，且注释的准确性受到标准可用性的限制。当前的色谱梯度并未针对较大、更疏水的多环芳烃代谢物进行优化，这些代谢物可能滞留在柱子上而无法完全洗脱，从而限制了它们在非目标工作流程中的检测。需要专门的方法来改善这些代谢物的回收。此外，由于此处使用的靶向测定方法是针对巯基酸酯及相关VOCm生物标志物的现有验证方法，直接跨平台确认仅限于一小部分共享代谢物，不包括葡萄糖醛酸酯或硫酸盐。解决这一限制需要为这些结合物类别开发新的靶向方法。未来的研究应改进标准化方法以改善定量解释。更广泛的时间采样将有助于区分持续暴露模式和短暂事件。扩大ILGA库以包括更多的II期结合物，并在不同废水系统中进行验证，将扩展该框架的分析范围。结合人口统计、排放和其他环境监测及健康数据集，可以将社区规模的暴露与潜在的生物结果联系起来。继续将对非目标代谢物的发现与靶向定量方法对齐，将使得人口水平的化学暴露评估更加全面和可解释。

这项工作得到了UofL NIH Superfund Grant P42 ES023716、R01 ES033531、R21 ES038074、S10 OD032361、S10 OD026840以及Owsley Brown II家族基金的支持。