聚对苯二甲酸乙二醇酯纳米塑料通过抑制TNF-α/JAK1/STAT1信号通路并营造免疫抑制性微环境，促进胃癌的发展

《Environment International》：Polyethylene terephthalate nanoplastics promote gastric cancer progression by inhibiting the TNF-α/JAK1/STAT1 signaling pathway and shaping an immunosuppressive microenvironment

　　吕雨丽|张红宇|金鑫|徐倩|丁焕新|刘楚轩|史鹏|刘志泽|胡耀瑞|李林川|朱建国|张云|张光勇
山东中医药大学第一临床医学院，中国山东省济南市250355

**摘要**
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是食品包装中最广泛使用的塑料之一，已成为人类接触微塑料的主要来源之一，最近的证据证实其存在于人体胃部。然而，PET纳米塑料（PET-NPs）对胃癌发生的生物学影响仍很大程度上未被探索。在本研究中，我们系统地研究了PET-NPs对胃癌进展的影响及其潜在的分子和免疫机制。PET-NPs可被胃癌细胞轻易摄取，导致细胞增殖、迁移能力增强以及对奥沙利铂的耐药性增加，同时抑制细胞凋亡和免疫性细胞死亡。通过小鼠皮下肿瘤模型进行的体内验证进一步表明，PET-NPs显著促进了肿瘤生长。结合转录组学、网络毒理学和Western blotting的综合性机制分析显示，PET-NPs与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）具有强烈的结合亲和力，从而抑制了下游的JAK1/STAT1信号通路。此外，PET-NPs通过促进M2型巨噬细胞的极化、减少CD8+ T细胞的浸润、上调免疫检查点分子TIGIT和PD-1以及抑制关键的抗肿瘤细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α）深刻重塑了肿瘤的免疫微环境。这些发现共同表明，PET-NPs作为一种先前未被认识的环境风险因素，通过直接干扰分子机制和免疫抑制加速了胃癌的进展，突显了长期接触微塑料对公共卫生的潜在影响。

**1. 引言**
近年来，随着塑料产品的大规模生产和广泛使用，由塑料废物引起的环境污染日益严重。作为塑料的降解产物，微塑料和纳米塑料由于其潜在的生物学效应和健康风险，已成为环境医学领域的新焦点（Goyal等人，2023年）。微塑料通常定义为直径小于5毫米的塑料颗粒，它们广泛分布于各种生态系统中，并已在包括肺、肝、脾、肾、胎盘和胃肠道在内的多种人体组织中被检测到（Leslie等人，2022年；Wu等人，2022年；Zhao等人，2024年）。人类主要通过摄入、吸入和皮肤接触接触微塑料（Winiarska等人，2024年），长期接触与多种病理状况有关，包括炎症、代谢紊乱和神经系统疾病（Gouin等人，2022年）。在各种类型的微塑料中，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）具有优异的物理和化学性质，广泛应用于瓶装水、外卖容器和食品包装（Joo等人，2018年）。随着外卖食品和瓶装水的普及，普通人群对PET微塑料的饮食暴露量持续上升（Du等人，2020年）。值得注意的是，最近的研究在人体胃组织中检测到了PET颗粒，占胃中微塑料总量的11.1%，这表明胃可能是PET积累的主要靶器官（?zsoy等人，2024年）。此外，研究表明PET会在贻贝等水生生物体内积累，并通过食物链进入人体（Choi等人，2021年；Fang等人，2024年）。这些发现突显了长期接触PET可能带来的健康风险，特别是对胃肠道系统的风险。胃癌（GC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，仍然是癌症相关死亡的主要原因之一（Smyth等人，2020年）。在中国，胃癌的疾病负担远超全球平均水平，约占全球胃癌死亡人数的一半（Yang等人，2023年）。虽然传统的风险因素如幽门螺杆菌感染、饮食习惯和遗传易感性已被充分证实（Thrift等人，2023年），但新兴证据表明微塑料可能是影响胃癌发病和进展的新环境因素。已在包括肺、胃、结直肠和宫颈癌在内的多种癌症组织中检测到微塑料（Zhao等人，2024a；Zhao等人，2024b），并且发现它们能促进肿瘤进展（Goswami等人，2024年）。现有研究表明，聚对苯二甲酸乙二醇酯微塑料（PET-MPs）会破坏小鼠肠道微生物群的分布并造成肠道损伤（Sun等人，2025年），同时具有显著的致癌和免疫抑制作用（Gutiérrez-García等人，2025年；Yang等人，2025年）。这使我们推测PET-MPs可能会促进胃癌的进展。胃癌进展指的是一系列恶性生物学行为，包括肿瘤细胞增殖增强、迁移能力增加、化疗耐药性提高、细胞凋亡抑制以及抗肿瘤免疫反应减弱（Lordick等人，2022年）。在这项研究中，我们使用聚对苯二甲酸乙二醇酯纳米颗粒（PET-NPs）对胃癌细胞系和小鼠进行了干预实验，以评估细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤大小和免疫浸润情况，从而阐明PET对胃癌进展的影响。此外，我们还通过转录组测序、网络毒理学和细胞实验分析了PET诱导胃癌进展的具体机制。

**2. 材料与方法**
2.1 **材料**
50纳米大小的PET-NPs（编号NO.20250226）购自中科黎明（北京，中国）。红色荧光PET-NPs（编号NO.C504086）购自朗飞生物（石家庄，中国），其激发/发射波长分别为620纳米/680纳米。PET-NPs的电子显微照片由中科黎明提供。水分散液中的粒径分布、Zeta电位和多分散指数（PDI）由马尔文帕纳利蒂克质量控制中心（上海，中国）测定。较小的颗粒已被证明具有更强的细胞摄取能力（Fan等人，2024年），但对胃组织的毒性更大（Sun等人，2024年），因此本研究选择了50纳米的PET-NPs。
2.2 **细胞培养**
人类胃癌细胞系AGS、HGC-27、MKN-1和小鼠胃癌细胞系MFC购自ATCC。这些细胞系在含有10%胎牛血清（FBS，LONSERA，中国）和100 U/mL青霉素及链霉素（Sigma，美国）的Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI1640，Gibco，美国）中培养，培养条件为37°C、含5% CO2的潮湿环境。当细胞密度达到70–80%时，用含有不同浓度PET-NPs的RPMI1640培养基进行处理。
2.3 **动物护理与处理**
从南京Wukong Biotechnology Co., Ltd.购买了15只6周大的雄性615小鼠（体重18–20克）。所有小鼠饲养在SPF级别的动物设施中，遵循12小时光照/12小时黑暗的周期，食物和水可自由获取。该动物研究的伦理批准获得了山东第一医科大学第一附属医院的动物护理与使用委员会的批准。615小鼠是MFC细胞系的同基因宿主，能够有效建立肿瘤，并具有完整的免疫系统，有利于研究PET-NPs的免疫调节作用（Zhu等人，2026年）。经过7天的适应期后，所有小鼠随机分为三组（每组n=5），每日饮用含有不同浓度PET-NPs的自来水（0、5、20 mg/L）。暴露浓度是根据先前的研究设定的，以模拟环境相关的摄入水平。根据小鼠的平均每日饮水量（约5–6毫升），20 mg/L组的每日摄入量估计约为0.10–0.12毫克/小鼠（约4–5毫克/千克/天），这与人类高暴露情况下的摄入量相当（Senathirajah等人，2021年）。此外，含有PET-NPs的自来水经过20分钟超声处理以分散颗粒，每天更换，并记录饮水量。第14天通过皮下注射5 × 10^5个MFC细胞建立皮下肿瘤模型。在整个暴露期间监测小鼠的整体状况，并每3天测量一次肿瘤大小。第28天对小鼠实施安乐死。
2.4 **细胞活力测定**
根据制造商的说明书，使用细胞计数试剂盒（CCK-8，Dojindo，日本）进行检测。细胞在0、1、2、4和8 μg/mL的PET-NPs浓度下暴露12、24或48小时。这些浓度是根据先前的体外研究选定的，通常使用低剂量暴露范围来评估早期生物学效应（Domenech等人，2024年）。随后，细胞用奥沙利铂（0、0.1、1、5、10、50、100 μM）处理24小时。处理后，向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，再培养2小时。使用微孔板读数仪（SpectraMax i3x，SPECTROstar Nano，德国）在450纳米处测量吸光度。
2.5 **细胞凋亡测定**
使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（Beyotime，编号C1062L，上海）检测AGS和MFC细胞的凋亡率。细胞短暂悬浮在结合缓冲液中，然后在室温下与5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶混合染色。使用SONY ID7000流式细胞仪（Sony，日本）进行分析。
2.6 **细胞周期分析**
细胞以6 × 10^5个细胞/孔的密度接种在6孔板中培养48小时。随后用75%乙醇在4°C下固定24小时，再用PBS洗涤两次。按照Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit（Beyotime，编号C1052，上海，中国）的说明，用碘化丙啶和RNase A在室温下染色30分钟。最后使用SONY ID7000流式细胞仪分析细胞周期分布。
2.7 **克隆形成测定**
细胞以1 × 10^3个细胞/孔的密度接种在6厘米培养皿中培养7天。然后用PBS洗涤两次，用预冷的戊二醛固定20分钟，再用结晶紫染色20分钟。最后计算克隆数量。
2.8 **EdU染色**
使用商业EdU染色试剂盒（Beyotime，编号C0075S，上海，中国）根据制造商的说明评估细胞增殖。每组细胞（1 × 10^4个）在37°C下与EdU缓冲液（10 μM）共孵育2小时。移除上清液，用PBS洗涤两次，然后用戊二醛固定20分钟。随后分别进行新鲜的Click反应溶液和DAPI核染色。通过荧光染色细胞的数量除以DAPI染色细胞的数量来计算EdU阳性细胞的比例。
2.9 **Transwell实验**
进行Transwell实验以评估AGS和MFC细胞的迁移能力。在上层腔室加入5 × 10^4个细胞（悬浮在无血清培养基中，100 μL）。下层腔室加入含有10% FBS（750 μL）的培养基以诱导细胞迁移。迁移的细胞用PBS洗涤三次，用4%戊二醛固定30分钟，然后用1%结晶紫染色。在100倍放大下观察图像。
2.10 **伤口愈合测定**
细胞以6 × 10^5个细胞/孔的密度接种在6孔板中培养至适当密度。然后使用无菌移液器尖端创建线性伤口。用PBS洗涤去除脱落的细胞。在0小时和24小时观察伤口闭合情况，并使用ImageJ 1.x量化伤口面积。
2.11 **Western blotting**
使用市售试剂盒从AGS和MFC细胞以及动物组织中提取总蛋白。通过BCA方法测定蛋白浓度。样品进行SDS-PAGE处理，并转移到PVDF膜（ThermoFisher Scientific，MA，美国）上，置于5% BSA溶液中。一抗在4°C下过夜孵育。实验中使用的一抗包括抗BCL-2（HUABIO，ET1702-53，1:5,000）、抗BAX（Proteintech，60267–1-Ig，1:5,000）、抗Caspase-3（HUABIO，ET1608-64，1:1,000）、抗TNF-α（HUABIO，HA722022，1:1,000）、抗JAK1（HUABIO，ET1705-84，1:1,000）、抗p-JAK1（Cell Signaling，#3331，1:1,000）、抗p-STAT1（Abways，CY5227，1:1,000）、抗CRT（HUABIO，ET1608-60，1:50,000）、抗HSP70（Abcam，AB5439，1:1,000）和抗β-Actin（Proteintech，66009-1-Ig，1:10,000）。二抗在室温下孵育1小时。最后使用ImageJ软件观察条带，以β-Actin作为内参。
2.12 **免疫荧光和组织化学分析**
细胞（1 × 10^5个）在24孔板中培养，并用PET-NPs或奥沙利铂处理。随后在室温下用30%山羊血清封闭1小时，然后在4°C下过夜孵育一抗。洗涤两次后，加入二抗进行孵育。在体内PET-NP暴露研究后，收集肿瘤样本，用4%甲醛固定，并包埋在石蜡中用于组织学分析。肿瘤切片分别染色Ki67、BCL-2、BAX、Cleaved Caspase-3、CD68（HUABIO，HA722285，1:200）和CD8（HUABIO，0108-7，1:100）。
2.13 **ELISA测定**
(1) 细胞：在6孔板中培养的细胞用PET-NPs或奥沙利铂处理，并收集细胞培养上清液。将HMGB1分泌到上清液中的量使用人和小鼠的HMGB1 ELISA试剂盒（人：Reed Biotech，武汉，中国；小鼠：Elabscience，武汉，中国）按照制造商的说明进行定量。 (2) 动物组织：从皮下异种移植块中采集新鲜组织，用PBS清洗，以1:9的比例在预冷的蛋白裂解缓冲液中匀浆30分钟，然后于4°C离心并收集上清液。使用小鼠的TNF-α和IFN-γ ELISA试剂盒（Reed Biotech，武汉，中国）按照制造商的说明定量上清液中的TNF-α和IFN-γ。2.14. ATP测定细胞在6孔板中培养，并用PET-NPs或奥沙利铂处理。收集细胞培养上清液。使用ATP测定试剂盒（Beyotime，NO. S0026，上海，中国）按照制造商的说明定量分泌到上清液中的ATP。2.15. 转录组测序在PET-NPs处理后3周采集肿瘤组织。使用Tritizol（Thermofisher，15596018）提取总RNA。使用Bioanalyzer 2100（Agilent，CA，美国）评估RNA的完整性和潜在污染，使用NanoDrop ND-1000（NanoDrop，DE，美国）确定纯度和浓度。随后，由LC Bio Technology CO, Ltd（杭州，中国）在Illumina NovaSeq? 6000平台上进行RNA文库测序。2.16. 动物组织的流式细胞术分析为了分析浸润肿瘤的免疫细胞，将肿瘤从皮下分离并转移到RPMI 1640培养基中。使用剪刀进行机械破坏，然后在37°C下以200 rpm的速度用小鼠肿瘤解离试剂盒消化1小时。将混合物通过100 μm细胞过滤器过滤以去除残留组织（BD Biosciences，美国）。在室温下用抗体洗涤单细胞并染色30分钟。用Zombie N Fix & Viability Kit染色30分钟以排除死细胞（BioLegend，美国）。在SONY ID7000（Sony，日本）上获取荧光数据，并使用FlowJo软件进行分析。使用针对CD45、CD11b、F4/80、CD3、CD4、CD8、PD-1、TIGIT、CD80、MHC II、Arg1和CD206的抗体分析浸润肿瘤的免疫细胞的表面标记物。流式细胞术用抗体购自BioLegend。这些抗体按照制造商的说明进行稀释。2.17. 统计分析数据以平均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism进行统计分析。使用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性，使用Levene’s检验评估方差的齐性。对于正态分布和方差相等的数据，使用非配对双尾Student’s t检验进行两组间的比较，而对于多组间的比较，则根据情况使用单因素或双因素ANOVA，随后进行Bonferroni事后检验。不符合这些假设的数据使用适当的非参数检验进行分析。P < 0.05被认为具有统计学意义。3. 结果3.1. PET-NPs的特性和细胞摄取使用透射电子显微镜（TEM）对50 nm的PET-NPs进行形态学表征，拍摄50k、100k和200k放大倍的图像。TEM图像显示所有PET-NPs都具有均匀的球形和优异的分散性（图1A）。在分散介质（纯水）中，PET-NPs的平均粒径为55.29 nm（图1B），其ζ电位超过-25 mV，多分散指数（PDI）低于0.1（图1C）。这些数据表明PET-NPs具有优异的稳定性和单分散性。我们将水溶性PET-NPs溶解在培养基中，最终浓度分别为1、2、4和8 μg/mL，并对四种GC细胞系（AGS、MFC、HGC-27和MKN-1）进行CCK-8实验。结果显示，在24小时后，AGS和MFC细胞在2和8 μg/mL浓度下显著增殖（图1D，p < 0.05）。因此，选择AGS和MFC细胞进行后续实验。由于PET-NPs的内化直接影响其生物学和毒理学反应，因此使用共聚焦显微镜可视化细胞内分布并验证内化情况。结果显示，在24小时暴露后，AGS细胞成功内化了红色荧光标记的PET-NPs。随着PET-NPs剂量的增加，AGS细胞内的内化程度也增加（图1E）。因此，PET-NPs可以被GC细胞内化。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载完整尺寸图像图1. PET-NPs的特性、其细胞内化以及对GC细胞增殖和迁移的影响。(A) 50k、100k和200k放大倍的PET-NPs的TEM图像，(B) 纯水中PET-NPs的粒径分布，(C) 纯水中PET-NPs的ζ电位，(D) AGS、MFC、HGC-27和MKN-1 GC细胞系的CCK-8实验结果（n = 3），(E) 显示AGS细胞内化红色荧光PET-NPs的共聚焦显微镜图像及PET-NPs/DAPI的平均荧光强度统计（n = 3），(F) EdU实验的荧光显微镜图像及EdU阳性细胞统计（n = 3），(G) 殖落形成的照片及殖民数统计（n = 3），(H) Transwell实验的显微镜图像及细胞迁移数统计（n = 3），(I) 划痕愈合实验的显微镜图像及划痕区域统计（n = 3）。数据以平均值±标准差表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）3.2. PET-NPs影响GC细胞的增殖和迁移我们使用EdU实验和殖民形成实验来验证PET-NPs对GC细胞增殖的影响。EdU实验显示，低剂量和高剂量的PET组显著增加了AGS和MFC细胞的DNA合成率（图1F，p < 0.05）。殖民形成实验显示，低剂量和高剂量的PET组显著增强了AGS和MFC细胞的增殖能力（图1G，p < 0.05）。最后，我们使用Transwell实验和伤口愈合实验评估PET-NPs对GC细胞迁移的影响。Transwell实验显示，与对照组相比，PET-NPs显著增强了AGS和MFC细胞的迁移能力（图1H，p < 0.05）。伤口愈合实验显示，与对照组相比，PET-NPs干预后AGS和MFC细胞的伤口愈合时间显著缩短（图1I，p < 0.05）。这些结果共同表明PET-NPs促进了GC细胞的增殖和迁移潜力。3.3. 转录组分析显示凋亡抑制和免疫浸润受损根据动物实验的结果，我们对对照组和高剂量PET-NPs组的皮下异种移植块进行了转录组测序。样本的PCA分布显示在补充图S1中。与对照组相比，在暴露于PET-NPs的皮下异种移植块中鉴定出2,532个差异表达基因，包括749个上调基因和1,783个下调基因（图2A,B，p < 0.05）。随后，对这些2,532个基因进行了基因本体学（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径富集分析，如图2C和D所示。GO富集分析包括免疫系统过程和信号转导、涉及膜和细胞质的细胞成分以及蛋白质结合和金属离子结合等分子功能。KEGG途径分析显示了包括凋亡、细胞因子-细胞因子受体相互作用和癌症途径在内的信号途径。在p值排名前20的KEGG途径中，有七个与免疫效应功能相关（图2E）。这表明PET-NPs通过凋亡途径和免疫效应机制促进GC细胞的进展。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载完整尺寸图像图2. PET-NPs的转录组分析显示凋亡抑制和免疫浸润受损。(A) 显示Ctrl和PET(H)之间上调和下调差异表达基因数量的条形图，(B) Ctrl和PET(H)之间差异表达基因的火山图（Log2(FC) > 1，p < 0.05），(C) Ctrl和PET(H)之间差异表达基因的GO富集分析，(D) Ctrl和PET(H)之间差异表达基因的KEGG富集分析，(E) KEGG富集分析中的前20个途径，(F) 与凋亡信号途径相关的基因表达热图，(G) 与凋亡信号途径相关的GSEA分析结果，(H) 使用ImmuCellAI工具进行的免疫细胞浸润分析结果，(I) 免疫细胞浸润分析中不同类型免疫细胞的表达热图。*p < 0.05，**p < 0.01，n = 3。凋亡相关基因的热图分析显示促凋亡基因如Casp7、Casp2和Tnf显著下调，而抗凋亡基因Bcl2l1显著上调。PET-NPs干预后，整体凋亡基因表达呈现抗凋亡趋势（图2F）。基因集富集分析（GSEA）显示两个样本组之间凋亡信号途径存在显著差异（图2G，p < 0.05）。这些结果表明PET-NPs通过抑制GC细胞中的凋亡途径促进GC细胞的进展。同时，使用LianChuan BioCloud Platform的ImmuCellAI工具（https://www.omicstudio.cn/home）对转录组测序数据进行免疫浸润分析。如图2H所示，暴露于PET-NPs的肿瘤组织中树突状细胞、T细胞和CD4+辅助T细胞的数量显著减少（p < 0.05），相应的热图中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和DC细胞的表达也减少（图2I）。结合KEGG富集分析结果，这表明PET-NPs通过免疫相关途径导致肿瘤微环境中的免疫浸润不足，进一步加剧了GC的恶性进展。3.4. PET-NPs降低GC细胞对奥沙利铂的敏感性奥沙利铂是治疗晚期GC的核心药物之一。它通过与DNA形成交叉链接来干扰肿瘤细胞的复制和修复，从而诱导细胞死亡（Kang等人，2024）。然而，奥沙利铂耐药性是晚期GC放疗和化疗效果不佳的主要原因（Fan等人，2025）。在本研究中，我们假设PET-NPs可以降低GC细胞对奥沙利铂的敏感性。GC细胞以0、2和8 μg/mL的浓度用PET-NPs处理。收集后，将细胞等量接种到96孔板中培养24小时。随后，细胞暴露于不同剂度的奥沙利铂24小时。最后，使用Microplate读取器通过CCK-8实验测量450 nm处的吸光度值（图3A）。结果显示，与对照组相比，经PET-NPs处理的AGS和MFC细胞表现出更高的吸光度值和更多的存活细胞数，表明细胞活力显著增强。奥沙利铂的细胞毒性作用在PET-NPs处理的细胞中显著减弱，观察到的IC50值显著增加（图3B，p < 0.05）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载完整尺寸图像图3. PET-NPs降低GC细胞对奥沙利铂（OXA）的敏感性并抑制OXA诱导的凋亡和ICD。(A) 使用CCK-8实验评估PET-NPs处理细胞中奥沙利铂敏感性的实验流程，(B) 奥沙利铂敏感性实验的吸光度和细胞活力统计（n = 3），(C) 使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒对不同处理下的GC细胞进行流式细胞术分析和凋亡率统计（n = 3），(D) 不同处理下GC细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3表达的Western blot分析（n = 3），(E) 不同处理下GC细胞中CRT表达的免疫荧光检测（n = 3），(F) 不同处理下GC细胞培养上清液中HMGB1水平的ELISA检测（n = 3），(G) 不同处理下GC细胞培养上清液中ATP水平的ATP测定试剂盒（n = 3），(H) 不同处理下GC细胞中CRT和HSP70表达的Western blot分析（n = 3）。数据以平均值±标准差表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。3.5. PET-NPs抑制奥沙利铂诱导的凋亡和免疫原性细胞死亡奥沙利铂以诱导凋亡而闻名（Wu等人，2015）。最近的研究表明，奥沙利铂也是免疫原性细胞死亡（ICD）的有效诱导剂（Zhao等人，2025）。在ICD过程中，肿瘤细胞通过一系列危险信号（损伤相关分子模式，DAMPs）有效激活抗原呈递细胞（如树突状细胞（DCs），促使T细胞对肿瘤抗原产生特异性免疫反应。DAMPs通常包括CRT膜暴露、HMGB1和ATP的细胞外释放等信号（Fucikova等人，2020）。在本研究中，GC细胞用30 μM奥沙利铂处理以诱导凋亡，随后用0、2和8 μg/mL的浓度与PET-NPs共处理。收集细胞和上清液进行流式细胞术、Western blot（WB）、免疫荧光和ELISA分析。Annexin V-FITC/PI染色显示奥沙利铂有效诱导了AGS和MFC细胞的凋亡。与PET-NPs共处理显著降低了奥沙利铂诱导的凋亡率（图3C，p < 0.05）。Western blot分析显示奥沙利铂抑制了AGS和MFC细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时增强了促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表达。同时，奥沙利铂增加了DAMP相关蛋白CRT和HSP70的表达。在PET-NPs处理后，奥沙利铂诱导的凋亡和ICD相关蛋白表达的趋势显著恢复（图3D,H，p < 0.05）。免疫荧光实验显示，奥沙利铂有效增强了AGS和MFC细胞中CRT蛋白的荧光强度；加入PET纳米颗粒后，奥沙利铂诱导的CRT荧光强度显著降低（图3E，p < 0.05）。ELISA实验表明，奥沙利铂提高了AGS和MFC细胞培养基中的HMGB1和ATP水平。加入PET纳米颗粒后，奥沙利铂诱导的HMGB1和ATP水平下降（图3F,G，p < 0.05）。这些结果共同表明，PET纳米颗粒抑制了奥沙利铂诱导的细胞凋亡和ICD。3.6。结合网络毒理学、分子对接和动力学模拟预测PET纳米颗粒对TNF-α/JAK1/STAT1信号通路的调节作用，以确定PET纳米颗粒通过何种特定通路抑制胃癌细胞中的凋亡。我们进一步整合了上述转录组学和网络毒理学分析（Cheng等人，2025年；Han等人，2025年）。从PubChem获取了PET的化学结构和SMILES代码：CC(O)C1CCC(CC1)C(O)OCCOC。通过TargetNet、Super-PRED和SwissTargetPrediction数据库的筛选，确定了317个与PET纳米颗粒相关的潜在靶点。同时，从GeneCards、OMIM和TTD数据库中筛选出5,130个与胃腺癌相关的潜在靶点。将转录组测序中的差异表达基因与PET纳米颗粒及胃腺癌相关靶点进行交叉分析，得到27个重叠基因（图4B）。基于这些基因，我们构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图4C）。该网络包含20个节点和53条边。在此网络中，TNF、NFKB1、STAT1和GRB2节点分别具有18条、11条、10条和9条边（图4D），表明它们在PPI网络中起关键作用。为了进一步确定网络中的关键靶点，我们在Cytoscape中使用CytoNCA和cytoHubba插件进行了拓扑分析。根据CytoNCA分析结果，我们展示了前20个基因的度数、介数和接近度得分（补充表S1）。利用cytoHubba分析结果，我们保留了前10个基因以构建网络图（补充图S2）。结果表明，TNF、NFKB1、STAT1和GRB2是PPI网络中的核心基因。我们使用MicroBioinformatics平台（https://www.bioinformatics.com.cn/login/）进行了GO和KEGG富集分析，如图4E和F所示。GO富集分析包括髓系白细胞活化和炎症反应调节等生物过程，细胞组分如早期吞噬体以及磷脂酰肌醇3-激酶复合体，分子功能包括eprin受体结合和细胞因子受体结合。KEGG富集分析确定了C型凝集素受体信号通路、JAK-STAT信号通路和TNF信号通路。

为了进一步验证PET纳米颗粒与目标蛋白的结合能力，我们使用Autodock4对PET纳米颗粒与TNF-α、NFKB1、STAT1和GRB2相关核心靶点进行了分子对接。如补充表S2和图4G所示，PET纳米颗粒与TNF-α的结合亲和力最强，其结合能低于-5 kcal/mol。分子对接结果（图4H）表明，PET纳米颗粒通过氢键和非共有价相互作用在原子水平上与TNF-α相互作用。在分子动力学模拟中，均方根偏差（RMSD）是评估蛋白质-配体复合物构象稳定性的可靠指标。如图4I所示，PET纳米颗粒-TNF-α复合物系统在50纳秒后达到平衡，最终波动稳定在0.25纳米左右，表明该复合物具有极好的稳定性。回转半径（Rg）可用于表征整体结构的变化。如图4J所示，PET纳米颗粒-TNF-α复合体在运动过程中表现出相对稳定的波动，表明整个模拟过程中复合物保持稳定。溶剂可及表面积（SASA）用于评估蛋白质表面积。如图4K所示，配体结合后复合物的SASA没有显著变化，表明配体结合对结构影响小。氢键在配体-蛋白质相互作用中起着关键作用。模拟过程中复合物中的氢键数量如图4L所示，表明大多数情况下复合体通常维持大约一个氢键，这表明配体与目标蛋白之间存在稳健的氢键相互作用。均方根波动（RMSF）量化了蛋白质残基的灵活性。如图4M所示，RMSF曲线波动在0.1纳米左右，表明从RMSF角度来看复合物具有极高的稳定性。

总之，由PET纳米颗粒和TNF-α形成的复合体系统表现出稳定的结合和强烈的氢键相互作用。为了从多个维度研究蛋白质-复合体系统的动态构象稳定性和内在相互作用机制，本研究通过构建三维（3D）自由能景观（FEL）系统地分析了该系统在构象空间中的能量分布特征。该图使用回转半径（Rg）和均方根偏差（RMSD）作为反应坐标，定量表征构象演变过程中的自由能变化。如图4N所示，深蓝色点代表稳定构象，而红色/黄色点表示不稳定构象。PET纳米颗粒-TNF-α通过强相互作用形成了一个单一的、稳定的能量簇，这一结果得到了RMSD曲线的支持。

3.7. PET纳米颗粒通过抑制TNF-α/JAK1/STAT1信号通路促进肿瘤细胞增殖并抑制凋亡。JAK-STAT1信号通路包括三种主要蛋白质：细胞表面受体JAKs和STATs。该通路参与癌症、炎症和免疫反应，在癌细胞增殖和存活中起关键作用，同时可能促进药物耐药性（Agashe等人，2022年）。大多数证据表明，STAT1激活在癌细胞中具有肿瘤抑制作用，尤其是在胃癌中（Huo等人，2023年）。最近的研究表明，TNF-α介导JAK-STAT1通路的激活（Qin等人，2022年），而跨膜TNF-α（tmTNF-α）通过JAK-STAT1诱导肿瘤细胞凋亡（Jiang等人，2017年）。此外，IFN-γ是JAK/STAT1信号通路的有效激活剂，能够有效诱导肿瘤细胞凋亡（Su等人，2020年）。首先，Western blot分析显示，在低剂量和高剂量PET纳米颗粒处理24小时后，AGS和MFC细胞中的TNF-α、p-JAK1和p-STAT1表达水平均受到抑制，高剂量PET纳米颗粒的抑制效果更明显。这些发现表明，PET纳米颗粒以剂量依赖的方式抑制TNF-α/JAK1/STAT1信号通路（图5A,B）。

3.8. 动物实验验证了PET纳米颗粒对TNF-α/JAK1/STAT1信号通路、凋亡和增殖的影响。在动物实验中，我们首先将15只615小鼠随机分为三组：Ctrl、PET(L)和PET(H)。一周正常喂养后，PET(L)和PET(H)组改用含有5 mg/L浓度超声分散的PET纳米颗粒的饮用水，PET(H)组使用20 mg/L浓度。每天更换水，并记录饮水量。第14天，通过腹股沟区域皮下注射5×10^5个MFC细胞/200 μL。每3天测量肿瘤体积和体重。第28天对小鼠实施安乐死，收集皮下肿瘤组织，称重，并进行转录组测序、Western blot、免疫组化（IHC）等相关实验。动物实验的工作流程如图6A所示。图6B显示了实验结束时采集的皮下MFC异种移植组织。整个实验期间，所有组的饮水量保持稳定（见补充表S3）。PET(H)组肿瘤体积和最终肿瘤质量显著增加（图6C,D），而各组之间的体重没有显著差异（图6E）。

3.9. PET纳米颗粒暴露可诱导肿瘤微环境中的免疫抑制作用。为了研究PET纳米颗粒对肿瘤免疫微环境的影响，我们对小鼠肿瘤组织进行了免疫组化和流式细胞术分析。肿瘤组织中的巨噬细胞（主要免疫细胞群体）显示CD68阳性巨噬细胞数量显著减少（图7A）。同时，流式细胞术分析显示PET纳米颗粒处理后CD11b阳性巨噬细胞中的CD80表达降低，CD206表达增加（图7B）。此外，巨噬细胞中的MHC II表达水平降低，而Arg1表达增加（图7C,D）。这些发现共同表明，PET纳米颗粒减少了肿瘤部位的巨噬细胞数量，并促进了它们向M2表型的极化。CD8+ T细胞是负责杀死肿瘤的主要效应细胞。我们观察到肿瘤组织中CD8+ T细胞的数量显著减少（图7E）。同时，流式细胞术分析显示CD45+免疫细胞群体和CD3+成熟T细胞群体中的CD8+ T细胞比例也显著下降（图7F，G）。这些发现与通过转录组测序进行的免疫浸润分析结果基本一致。我们检测了肿瘤组织中CD8+ T细胞上膜结合的免疫抑制分子TIGIT和PD-1以及杀伤肿瘤的细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达情况。研究发现，PET纳米颗粒（PET-NPs）能够增加CD8+ T细胞上的TIGIT和PD-1水平，同时抑制IFN-γ和TNF-α的表达（图7H）。进一步的ELISA分析显示，暴露于PET-NPs后肿瘤组织中的IFN-γ和TNF-α分泌水平显著降低（图7I）。这表明PET-NPs通过多种途径形成了一个免疫抑制的微环境，包括促进M2型巨噬细胞的极化、减少CD8+ T细胞数量以及抑制杀伤肿瘤的细胞因子IFN-γ和TNF-α，从而加剧肿瘤的进展。

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图7. 免疫组化和流式细胞术分析显示，PET纳米颗粒暴露会诱导肿瘤微环境中的免疫抑制状态。（A）对照组和PET(H)组肿瘤组织中CD68表达的免疫组化检测结果；（B）对照组和PET(H)组肿瘤组织中巨噬细胞中CD80和CD206荧光强度的流式细胞术直方图；（C）对照组和PET(H)组肿瘤组织中巨噬细胞中CD80、MHC II、Arg1和CD206荧光强度的直方图；（D）对照组和PET(H)组肿瘤巨噬细胞中CD80、MHC II、Arg1和CD206的平均荧光强度（n=3）；（E）对照组和PET(H)组肿瘤组织中CD8表达的免疫组化检测结果；（F）对照组和PET(H)组肿瘤组织中CD45+免疫细胞和CD3+ T细胞中CD8+ T细胞比例的变化；（G）对照组和PET(H)组肿瘤组织中成熟T细胞中CD8+ T细胞比例的变化；（H）对照组和PET(H)组肿瘤组织中TIGIT、PD-1、IFN-γ和TNF-α阳性CD8+ T细胞比例的变化及平均荧光强度（n=3）；（I）对照组和PET(H)组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-α水平的ELISA检测结果（n=3）。数据以平均值±标准差表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

4. 讨论
尽管在人类和多种淡水鱼的胃肠道中检测到了PET纳米颗粒（Wagner等，2019年），但它们在胃肠道肿瘤进展中的潜在作用仍很大程度上未被探索。值得注意的是，PET纳米颗粒可能会加速肿瘤的进展。最近的研究报告称，PET纳米颗粒通过诱导乳腺癌的免疫逃逸来加剧恶性进展（Yin等，2025年）。因此，我们重点研究了PET纳米颗粒对胃癌（GC）进展的影响。通过体外实验和动物模型，我们证实PET纳米颗粒显著促进了GC细胞的增殖和迁移，同时抑制了它们的凋亡。这些效应与细胞周期调控的变化（例如，PET纳米颗粒使GC细胞停滞在S期）和凋亡相关基因（例如抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax）的变化有关，表明PET纳米颗粒通过调节细胞周期和破坏细胞死亡程序来驱动肿瘤生长。其他研究报道，聚苯乙烯等微塑料可以抑制肿瘤细胞中的铁死亡和焦亡（Hu等，2025年；Lu等，2025年）并增强细胞迁移（Brynzak-Schreiber等，2024年），表明微塑料对肿瘤细胞行为有多种影响，并可能直接促进肿瘤进展。

我们的转录组测序结果显示，PET纳米颗粒与凋亡和免疫抑制显著相关。奥沙利铂是一种主要用于临床晚期GC患者的化疗药物（Janjigian等，2025年），其抗肿瘤作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡和免疫细胞死亡（ICD）实现的。我们的研究发现，PET纳米颗粒降低了奥沙利铂对GC细胞的细胞毒性效应，同时抑制了奥沙利铂-induced的凋亡和ICD。类似的研究报告称，聚苯乙烯能促进GC细胞增殖并对多种药物（包括顺铂、紫杉醇和吉非替尼）产生抗性（Kim等，2022年）。这些发现共同表明，像PET纳米颗粒这样的微塑料通过降低化疗效果来促进治疗耐药性，从而对临床GC治疗产生不利影响。基于转录组免疫浸润分析和PET纳米颗粒对奥沙利铂-induced的ICD的抑制作用，我们进一步研究了暴露于PET纳米颗粒的小鼠肿瘤组织中的肿瘤免疫微环境。流式细胞术分析显示，PET纳米颗粒暴露导致CD8+ T细胞比例下降，M2型巨噬细胞比例增加，以及杀伤肿瘤的细胞因子IFN-γ和TNF-α水平降低。这种免疫细胞群的失衡可能促进免疫抑制和肿瘤免疫逃逸，从而进一步加速GC的进展。

在分子机制方面，我们结合转录组学、网络药理学、分子对接和分子动力学模拟来预测PET纳米颗粒调控GC进展的主要途径和靶点。结果显示，PET纳米颗粒与TNF-α有强烈的结合能力，并剂量依赖性地抑制p-JAK1和p-STAT1的表达。当加入JAK1/STAT1通路的激活因子IFN-γ时，PET纳米颗粒对p-JAK1和p-STAT1的抑制作用得到有效恢复，PET纳米颗粒诱导的肿瘤细胞增殖和凋亡抑制作用也减弱。这表明PET纳米颗粒可能通过抑制TNF-α/JAK1/STAT1信号通路来影响GC细胞的增殖、凋亡和免疫反应。TNF-α激活后，JAK1/STAT1信号通路通过JAK1和STAT1的磷酸化被激活，从而促进细胞死亡（Karki等，2021年）。同时，IFN-γ可以通过JAK1/STAT1增加卵巢癌细胞的迁移能力（Padmanabhan等，2021年）和PD-L1的表达水平（Padmanabhan等，2022年），表明该通路在肿瘤和免疫反应中起关键作用。我们的发现为环境污染物与癌症之间的关联提供了分子层面的证据，但局限性在于它并未进一步揭示PET纳米颗粒对肿瘤免疫的调控机制是否依赖于TNF-α/JAK1/STAT1信号通路，这将在未来的研究中进一步探讨。

除了GC之外，本研究的结果也可能为其他胃肠道肿瘤提供见解。由于消化道是接触微塑料的主要途径（Schwabl等，2019年），结直肠癌和食管癌等癌症同样长期暴露于微塑料中，其发展可能受到类似机制的影响（Lin等，2026年）。除了PET之外，其他类型的微塑料（如聚苯乙烯和聚乙烯）也被证明具有促进肿瘤的作用，包括促进肿瘤细胞增殖、诱导免疫抑制和增强药物耐药性（Kim等，2022年；Tong等，2022年）。因此，不同类型微塑料影响肿瘤发生和进展的机制共性和差异值得进一步深入研究；这些效应可能与微塑料引起的炎症反应、免疫逃逸和细胞死亡异常调节等共同机制有关（Jiang等，2026年）。尽管如此，本研究主要关注PET纳米颗粒在GC中的作用，为理解环境微塑料暴露与肿瘤进展之间的关系提供了新的实验证据。

5. 结论
最近的研究表明，来自外卖容器的微塑料会渗出（Jin等，2024年）。作为一种常见的食品包装材料，PET纳米颗粒通过饮食进入人体，在体内积累并在胃标本中被检测到。我们的工作表明，PET纳米颗粒通过抑制TNF-α/JAK1/STAT1信号通路显著促进GC细胞的增殖和迁移，同时抑制凋亡，降低对奥沙利铂的敏感性。此外，PET纳米颗粒改变了肿瘤免疫微环境，表现为CD8+ T细胞浸润减少和M2型巨噬细胞极化增加，从而加剧GC的进展。这些发现证实，微塑料可能通过多种途径（包括分子信号传导和免疫调节）加速肿瘤的发展，并为临床环境中的肿瘤耐药性和免疫反应受损提供了新的见解。

6. 资助
本工作得到了中国国家重点研发计划（项目编号2023YFC2506700）、国家自然科学基金（项目编号82472366）和山东省自然科学基金（项目编号ZR2022QH322）的支持。

CRedI作者贡献声明
李璐宇：撰写——审阅与编辑、原始草稿撰写、方法学设计、研究实施、数据管理、概念构思。
张宏宇：原始草稿撰写、验证、软件使用、研究实施。
金欣：软件使用、研究实施、正式分析、数据管理。
徐倩：项目管理、研究实施、正式分析。
丁焕新：软件使用、方法学设计、研究实施。
刘楚轩：验证、监督、软件使用。
彭实：验证、软件使用、资源协调。
刘吉泽：可视化、方法学设计、正式分析。
胡尧瑞：可视化、验证、监督。
李林川：监督、资金筹集、正式分析。
朱建康：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调。
张云：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源协调、概念构思。
张光勇：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调、资金筹集、概念构思。