假单胞菌W4对石墨烯的芬顿类生物转化：结构变化、代谢产物及遗传决定因素

《Environmental Pollution》：Fenton-like Biotransformation of Graphene by Pseudomonas sp. W4: Structural Alteration, Metabolites and Genetic Determinants

　　张子|王静薇|贾权|赵燕|贾洪亮|毛巧
大连海事大学环境科学与工程学院环境系统生物学研究所，中国大连116026

摘要
作为一种二维sp2杂化碳材料，石墨烯的广泛应用引发了重大的环境问题，因为它具有潜在的持久性和毒性。本研究报道了一种名为Pseudomonas sp. W4的细菌菌株的分离，该菌株能够在经过四个月的适应期后利用原始石墨烯作为其唯一的生长碳源。在100 mg/L的石墨烯存在下培养时，微生物生长旺盛，15天内细胞密度增加了7.094 ± 0.706倍。直接证据表明发生了生物降解：透射电子显微镜观察到了石墨烯片上的孔洞形成，拉曼光谱显示结构缺陷增加，ID/IG比值从1.007 ± 0.010升高到1.097 ± 0.010。气相色谱-质谱和液相色谱-飞行时间质谱分析鉴定出了中间代谢物，包括水杨酸和苯甲酸。使用13C标记的石墨烯直接证明了碳的吸收，20天后石墨烯中的13C含量减少了57.0‰，而细菌生物量增加了1.0‰。综合基因组和转录组分析显示，与氧化还原反应、离子跨膜转运和芳香化合物代谢相关的基因发挥了关键作用。此外，自由基检测显示W4菌株采用了一种细胞外、类Fenton反应机制，生成羟基自由基来攻击石墨烯晶格。这些发现证实了一种以前未被认识的微生物降解石墨烯和碳吸收的途径，突显了Pseudomonas sp. W4在生物修复石墨烯污染环境方面的潜力。

引言
石墨烯是一种由sp2杂化轨道碳原子组成的二维材料，呈六角晶格排列，厚度为一个原子。由于其独特的物理和化学性质，石墨烯被认为是21世纪的神奇材料。自2004年Novoselov及其同事偶然合成石墨烯以来（Novoselov等人，2004年），其应用范围大幅扩展，主要集中在机械部件和材料领域，如传感器（Guo等人，2021年；Cheng等人，2013年；Zaretski等人，2016年；Shan等人，2021年）、集成电路（Joshi和Pathak，2017年；Goossens等人，2017年）和电池（El-Kady等人，2016年；Liu等人，2016年）。此外，在医学领域，石墨烯材料被用于药物输送、生物标志物检测以及肿瘤和癌症治疗研究（Priyadarsini等人，2018年；Zhao等人，2017年；Cheng等人，2016年；Li等人，2016年；Shafiee等人，2022年）。最近的市场分析表明，石墨烯市场在未来几年有巨大的增长潜力，预计到2027年市场规模将达到15亿美元（Schmaltz等人，2024年）。

石墨烯市场的持续扩展引发了环境问题。石墨烯材料在电子元件、消费品和药品中的广泛应用引发了对其环境和生物影响的重大担忧，尤其是在工业制造过程中可能释放到环境中的可能性增加（Ding等人，2022年；Goodwin等人，2020年；Malakar等人，2021年）。由于缺乏可靠的分析方法，石墨烯材料在环境中的浓度尚未确定。研究表明，石墨烯的环境浓度可能与碳纳米管相似，因为这两种材料具有类似的物理和化学性质。利用概率模型和估算技术，表面水中碳纳米管的浓度约为0.17 ng/L，废水中约为3.6 ng/L，污泥中约为0.12 mg/kg，空气中约为0.02 ng/m3（De Marchi等人，2018年）。对于能够保留石墨烯材料的环境介质（如土壤和沉积物），估计的年积累量分别为5.1 ng/kg和0.79 μg/kg。石墨烯材料具有很强的吸附能力，这可能导致环境中有毒和有害污染物的浓度增加，从而加剧吸附污染物的毒性（Gosens等人，2010年；Liu等人，2019年）。水或土壤中的石墨烯可能转移到食物链中并生物累积（Syama等人，2016年；Dong等人，2018年；Chen等人，2017年）。已经有一些关于石墨烯材料对生物体毒性的研究。体外实验表明，氧化石墨烯（GO）可导致细胞凋亡（Zhang等人，2022年）、形态变化（Puah等人，2020年）和氧化应激（Stygar等人，2021年；Sasidharan等人，2011年）。石墨烯纳米材料的高反应性表面在细胞表面或内部聚集时可能产生大量活性氧（ROS），导致DNA、细胞膜和细胞器的损伤。细胞死亡的主要机制是氧化应激和炎症反应（Jarosz等人，2016年）。体内实验表明，GO对小鼠具有慢性毒性，导致血栓形成、栓塞和炎症反应（Rhazouani等人，2023年；Gao等人，2021年）。聚集的石墨烯可能导致肺部损伤（Bengtson等人，2017年），并且石墨烯材料还具有抗菌特性（Salmi等人，2022年）。减轻石墨烯材料的环境影响和防止潜在的生物危害是关键问题。化学降解方法，如高级氧化过程（Bai等人，2014年；Xing等人，2014年；Ren等人，2015年）、酸碱氧化（Li等人，2017年）、电化学氧化（Cao等人，2017年）和热氧化（Pan等人，2010年）具有高效和操作简单的优点。然而，这些方法也有缺点，包括高昂的操作成本、大量能量消耗、降解不完全以及引入杂质。此外，这些过程中使用化学试剂可能导致二次环境污染。在生物降解领域，酶催化降解是最常用的方法之一。可用于降解石墨烯材料的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）（Kotchey等人，2011年）、髓过氧化物酶（MPO）（Kurapati等人，2015年）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）（Andón等人，2013年）和木质素过氧化物酶（LiP）（Carniel等人，2021年）等。然而，在大多数环境中，主要的降解剂并不是这些酶，而是微生物。迄今为止，已经报道了几种能够降解石墨烯材料的微生物。Zhang等人研究了一种由Burkholderia kururiensis、Delftia acidovorans和Stenotrophomonas maltophilia组成的微生物联合体，该联合体在存在外部碳源的条件下能够降解多壁碳纳米管（MWCNTs）（Zhang等人，2013年）。几种芳香化合物被鉴定为该降解过程的中间产物。Liu等人从接触石墨矿的土壤中分离出一种能够降解萘的细菌（Liu等人，2015年），当萘作为碳源时，该细菌可以降解GO、石墨和还原型氧化石墨烯（RGO）。

在我们之前的研究中，从接触GO的土壤中分离出了Labrys sp. WJW，并证明了其能够利用各种基于碳的纳米材料作为唯一的生长碳源（Qu等人，2018年；Wang等人，2020年；Wang等人，2021a；Wang等人，2021b）。此外，WJW菌株还表现出降解各种芳香化合物的能力。中间产物的鉴定揭示了含有苯甲酸和酚类结构的芳香中间体。对Labrys sp. WJW降解碳基纳米材料机制的全面分析表明，该过程涉及一种类似Fenton的反应，其中通过H2O2的还原诱导生成羟基自由基（·OH），涉及Fe(II)/Fe(III)的连续循环。进一步的实验观察到类似的机制和现象，例如Shewanella oneidensis MR-1这种已知能催化Fenton反应的细菌菌株。MR-1产生的Fe(II)和H2O2通过Fenton反应促进·OH的生成，从而促进氧化（羧基化）单壁碳纳米管（O-SWCNTs）的降解（Takahashi和Hori，2023年）。这些研究提供了微生物降解石墨烯材料潜力的有力证据，特别是从受芳香烃污染的土壤中分离出的细菌。

然而，尽管有一些关于石墨烯材料生物降解的研究，但能够降解石墨烯的微生物资源仍然稀缺。需要进一步研究的关键问题包括：微生物是否真正吸收了石墨烯中的碳用于生长，以及类Fenton反应是否是细菌降解碳纳米材料的普遍机制。关于细菌菌株降解石墨烯材料所涉及基因的研究仍然有限。本研究成功分离出了一种名为Pseudomonas sp. W4的菌株，该菌株能够降解石墨烯。对其降解性能、中间产物和13C同位素追踪实验进行了详细研究。通过对W4菌株进行全面的基因组和转录组测序分析，鉴定出可能参与降解过程的基因及其相关途径，并对其降解机制进行了深入探讨。

材料
石墨烯购自南京XFNano材料技术有限公司（产品编号：XF001w，直径：0.5-5.0 mm，厚度：0.8-1.2 nm，纯度：>99 wt%）。Cu箔上的13C标记石墨烯购自南京XFNano材料技术有限公司（产品编号：XF211，尺寸：2 cm × 2 cm）。石墨烯母液（1 mg/mL）加入培养基中，分散液为去离子水，经过超声分散一小时后方可使用。无机盐培养基包含(NH4)2SO4（mg/L）。

石墨烯降解菌株W4的分离与鉴定
在实验室进行了四个月的适应期后，从预先接触石墨烯的活性污泥中分离出一种名为W4的细菌菌株。该菌株表现出利用石墨烯作为唯一碳源的能力，在添加了石墨烯的无机盐琼脂上产生了白色圆形菌落（图1a）。SEM分析显示W4菌株具有大约1 μm长的细长杆状形态（图1b）。根据16S rRNA基因...

结论
本研究评估了细菌菌株W4降解石墨烯的能力，证明了其能够利用石墨烯作为唯一的生长碳源。通过13C同位素标记实验，证实了碳原子直接从石墨烯晶格中被吸收。此外，还鉴定出几种中间代谢物，并利用综合基因组和转录组分析了与石墨烯分解相关的基因。

作者贡献声明
贾洪亮：撰写–审稿与编辑，数据管理。
毛巧：撰写–审稿与编辑，方法学。
贾权：撰写–审稿与编辑，研究。
赵燕：撰写–审稿与编辑。
王静薇：撰写–审稿与编辑，初稿撰写，监督，资源管理，方法学，研究，资金获取，概念化。
张子：撰写–审稿与编辑，初稿撰写，可视化，方法学，研究，数据分析。

未引用的参考文献
Syama and Mohanan, 2016。

利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。