经过低温研磨处理的轮胎胎面会使自然附生藻类群落的功能和结构发生变化

《Environmental Pollution》：Cryogenically milled tire tread induces functional and structural changes in natural periphyton communities

　　萨拉·贡萨尔维斯（Sara Gon?alves）| 亚历山德拉·克罗尔（Alexandra Kroll）| 蒂博·马塞（Thibault Masset）| 安娜·托索（Anna Toso）| 艾伦·伯格曼（Alan Bergmann）| 埃蒂安·维尔梅尔森（Etienne Vermeirssen）| 弗洛里安·布赖德（Florian Breider）| 伯努瓦·J.D. 法拉利（Benoit J.D. Ferrari）| 克里斯汀·希默（Kristin Schimer）
瑞士联邦水科学与技术研究所（Eawag）环境毒理学系，地址：überlandstrasse 133，CH-8600 Dübendorf，瑞士

**摘要**
轮胎磨损颗粒（TWP）是由于磨损产生的，并因此沉积在路边，随后会转移到周围的土壤和地表水中。尽管人们对TWP及其相关化学物质对水生生物的影响越来越感兴趣，但它们与附着生物膜群落的潜在相互作用尚未得到充分了解。由于这些复杂的微生物群落构成了水生食物网的基石，因此评估轮胎颗粒对这些群落的潜在影响至关重要。我们使用冷冻粉碎的轮胎胎面物质（CMTT）作为TWP的替代品，来进行以下研究：（1）将附着生物暴露于四种浓度的CMTT（0、50、500、1000 mg/L）下14天；（2）在单独的4天暴露期间，比较附着生物对CMTT颗粒（1000 mg/L）及其相关化学物质的反应。在这两种情况下，约有25-30%的CMTT与附着生物群落结合，表明其具有吸收作用。此外，在最高测试浓度（1000 mg/L）下，光合效率略有下降；而在500和1000 mg/L的CMTT条件下，14天后藻类生物量（叶绿素a）减少了约30%。14天暴露后，所有浓度的CMTT都导致了群落结构和组成的变化。特别是，在CMTT存在的情况下，细菌门Bacillota几乎消失；同样地，硅藻的丰度在50、500和1000 mg/L的CMTT条件下分别减少了45%、85%和70%。因此，在较高浓度的CMTT下，其他群落如蓝细菌门（Cyanobacteriota）和绿藻变得更加丰富。对于4天的暴露，仅CMTT相关的化学物质就产生了与CMTT颗粒相当的影响。总体而言，这项工作强调了研究附着生物对TWP反应的重要性，因为它们容易受到轮胎衍生物的毒性影响，同时也影响了TWP和化学物质在水生环境中的命运和效应。

**引言**
轮胎和道路路面在表面磨损过程中会产生微粒和纳米颗粒（Kole等人，2017年；Kreider等人，2010年）。据估计，欧洲每年产生的这些颗粒总量约为45万吨（Giechaskiel等人，2024年）。随着更重的电动汽车的引入，这类颗粒的排放量在全球范围内呈上升趋势（Zhao等人，2019年）。超过95%的轮胎和道路磨损颗粒（TRWP）会沉积在路边（Sieber等人，2020年）。这些颗粒随后会转移到周围的土壤和地表水中，并可能与当地自然群落发生相互作用（Goonetilleke等人，2017年；Huber & Helmreich，2016年；Wik等人，2009年）。因此，过去十年里，TRWP与水生生物之间的潜在相互作用引起了越来越多的科学关注（Mayer等人，2024年；Wagner等人，2018年；Zhao等人，2024年）。

**轮胎成分（TWP）**
轮胎和道路路面在表面磨损过程中会产生微粒和纳米颗粒（Kole等人，2017年；Kreider等人，2010年）。在欧洲，这些颗粒的排放量平均每年约为45万吨（Giechaskiel等人，2024年）。随着更重电动汽车的普及，此类颗粒的排放量预计还会进一步增加（Zhao等人，2019年）。超过95%的TRWP会沉积在路边（Sieber等人，2020年）。这些颗粒随后会转移到周围的土壤和地表水中，并可能与当地自然群落发生相互作用（Goonetilleke等人，2017年；Huber & Helmreich，2016年；Wik等人，2009年）。因此，TRWP与水生生物之间的潜在相互作用在过去十年中受到了越来越多的科学关注（Mayer等人，2024年；Wagner等人，2018年；Zhao等人，2024年）。

在轮胎成分（TWP）中，使用了多种化学物质来促进聚合过程或提高耐用性，以防止橡胶在制造过程中开裂和分解（Kreider等人，2010年）。这些化学物质包括高浓度的硫化剂（如金属，特别是氧化锌），有机化学物质（如2-巯基苯并噻唑（MBT）和1,3-二苯基胍（DPG）（Unice等人，2012年），以及来自橡胶中高度芳香油的多环芳烃（PAHs）。此外，还添加了抗氧化/抗臭氧化合物（如N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-1,4-苯二胺（6PPD）（Mayer等人，2024年）。一旦进入水生环境，TWP会缓慢降解，逐渐释放化学物质，增加对环境的影响（Luo等人，2022年；Mayer等人，2024年；Wang等人，2023年）。据报道，TWP在环境中的浓度因研究地点而异，但在溪流和河流中的浓度预计不会超过10 mg/L（Rodland等人，2022年；Wagner等人，2018年）。然而，最近有报道称，在瑞典的雨水样本中TWP的浓度高达17-40 mg/L（Gaggini等人，2024年），或者在极端情况下，例如挪威的融雪水或隧道冲洗水中，浓度可达到数克/升（1-10 g/L），在中国和澳大利亚的某些水体中也发现了类似的浓度（Song等人，2024年）。

TWP的毒理学影响主要集中在较高营养级生物，如无脊椎动物和鱼类（LaPlaca等人，2022年；Redondo-Hasselerharm等人，2018年；Siddiqui等人，2022年）。具体而言，6PPD的转化产物6PPD-Q因其对某些鱼类的高急性毒性而成为TWP研究的重点（B.C. Ministry of Water，2025年；Bohara等人，2024年；Prosser等人，2023年；Tian等人，2022年）。少数研究探讨了TWP对初级生产者（如浮游植物或附着生物群落）的影响及其对颗粒和相关化学物质联合效应的响应（Ganie等人，2025年；Marwood等人，2011年）。尽管有关有效TWP浓度的数据有限，但该领域缺乏统一标准。这种缺乏标准的现象表现为所使用的材料不同（例如不同的轮胎部件、生成和分散颗粒及化学物质的方法不同，是否包含道路粉尘和碎屑），以及缺乏附着生物群落研究的标准指南（Lamprecht，2022年）。尽管如此，现有研究表明，暴露于此类物质和/或相关化学物质会导致附着生物的生长受到抑制和氧化应激增加。

**附着生物群落**
附着生物群落主要由嵌入细胞外聚合物物质（EPS）中的细菌、藻类和真菌组成，形成了复杂的生态系统。它们在光合作用、生物地球化学循环和生物修复等过程中发挥着关键作用（Battin等人，2016年）。附着生物的光合作用是这些系统中能量和有机物质的主要来源，支撑着整个食物链。因此，这一层次的破坏可能会对整个水生食物网产生自下而上的影响（Battin等人，2003年；Romani等人，2004年）。附着生物自然生长在沉积物和岩石上，覆盖了淡水溪流床的大面积表面，同时也能作为各种颗粒和化学物质的储存库（包括TWP）（Merbt等人，2022年；Rooney等人，2020年）。需要进一步的研究来深入理解TWP及其相关化学混合物对关键生态过程（如光合作用和群落结构与功能）的影响，以及附着生物作为颗粒/化学物质储存库的潜力。此外，使用附着生物群落而非单一藻类物种可以更好地反映实际暴露情况，从而提高生态毒理学评估的生态相关性。这是因为附着生物的复杂性使得能够评估群落组成和营养级转移等变化，而这些在单一物种研究中无法捕捉到。

在这项研究中，我们使用了标准化的冷冻粉碎轮胎胎面物质（CMTT）作为环境TRWP中轮胎成分的替代品（Kovochich等人，2021年），这也便于比较不同研究的结果（USTMA，2025年）。我们的目标是通过以下实验来研究TWP的影响：（实验1）将接近自然生长的成熟附着生物群暴露于逐渐增加的CMTT浓度（0、50、500和1000 mg/L）下；（实验2）区分TWP的物理效应与这些颗粒中渗出的化学物质的效应。我们通过流式细胞术（FC）评估了CMTT、金属和有机化学物质的渗出及其与附着生物群落的关联，以及光合效率和生物量；并通过下一代测序（NGS）评估了群落组成。我们假设：a）TWP颗粒可能与附着生物群落结合，导致金属和有机化学物质的吸收；b）TWP颗粒和化学物质可能引起附着生物群落结构和光合活性的浓度依赖性变化。

**方法**
**CMTT和化学物质的制备**
CMTT的制备和表征方法与先前研究相同（Kovochich等人，2021年；Masset等人，2021年）。具体步骤如下：首先使用工业剪刀和 Water Jet Cutter 将轮胎胎面的外层去除，然后切成约1立方厘米的小块。这些碎片随后通过锤式研磨机（型号A，Pulva）进行冷冻粉碎，得到粒径在15至300微米之间的颗粒，平均粒径为188微米。本研究中使用的颗粒代表了美国市场上的各种轮胎类型，包括乘用车轮胎（41%）、轻型卡车轮胎（14%）和重型卡车/公交车轮胎（45%）（USTMA，2025年）。根据先前的研究，选择了三种浓度的CMTT（50、500和1000 mg/L），以模拟环境中最坏的暴露情景（Song等人，2024年；Wagner等人，2018年），并在每个实验中设置了一个无颗粒的对照组（0 mg/L）。CMTT颗粒直接称重后放入20毫升的琥珀色闪烁瓶中。每个瓶子中加入搅拌磁棒和2毫升细胞外聚合物物质（EPS）提取物。EPS的提取方法与之前的研究相同（Merbt等人，2022年；Stewart等人，2013年）。我们选择EPS作为颗粒稳定的材料，因为它更能反映附着生物膜的环境条件，而不是常用的有机溶剂（如二甲基亚砜、乙醇或甲醇）。颗粒和EPS的混合物在360转/分钟的转速下搅拌过夜。第二天早上，向每个瓶子中加入18毫升Periquil（Stewart等人，2013年），并继续搅拌24小时，然后开始暴露。Periquil模拟了淡水中的盐分含量，用于替代溪流水以控制CMTT颗粒中渗出的有机化学物质和金属浓度（Stewart等人，2013年）。EPS稳定步骤至关重要，首先通过观察不同Periquil:EPS比例下的颗粒分散情况来优化这一过程，直到颗粒保持悬浮状态（图S2–SI）。在实验2中，仅使用1000 mg/L的CMTT，简称为“CMTT”。对于“化学物质”处理（即从CMTT中渗出的化学物质混合物），步骤与之前相同，但在添加混合物之前通过过滤器（GF/F，0.7 μm，Whatman?）去除颗粒（图S1–SI）。

**附着生物的培养**
附着生物在瑞士Dübendorf的Chriesbach小河的溪流水上培养在玻璃载玻片（76×26毫米）上。80片玻璃载玻片垂直放置在流道中（水流速度1厘米/秒）（Navarro等人，2008年）。实验1（2023年6月至8月）和实验2（2023年11月）中，载玻片分别培养14天，光照/黑暗周期为12小时/12小时（图S1–SI）。培养后的载玻片转移到300毫升的微生态系统中进行暴露（图S1–SI；见下文暴露部分；表S1–SI）。

**附着生物群落的暴露和采样**
每个微生态系统由一个300毫升的结晶皿组成，其中随机选取3片载玻片，加入180毫升Periquil和20毫升暴露混合物（CMTT + EPS + Periquil，事先准备好的混合物；图S1和S3 - SI）。EPS占微生态系统最终体积的1%，即2毫升/200毫升培养基。在实验1中，为了避免营养耗尽并维持CMTT浓度，每隔3至4天将附着生物载玻片及其所含的CMTT转移到含有新鲜Periquil培养基的新微生态系统中。由于实验2的暴露时间仅为4天，因此不更换培养基。

在两个实验中，每种处理重复5次，暴露前后对培养基进行过滤、混合并取样以进行化学分析。过滤培养基以回收并称重其中残留的CMTT。预先称重的玻璃过滤器（GF/F，0.7 μm，Whatman?）中含有保留的CMTT，放入预先称重的50毫升Falcon?管中，然后在60°C下加入3毫升H2O2消化过夜。管子在60°C下保持至完全干燥（7天），之后称重以记录从暴露培养基中回收的CMTT质量。通过与过滤前CMTT质量相减，估算出附着生物相关的颗粒质量。我们将那些附着在周丛生物切片上或在其内部积累的颗粒称为“与周丛生物/生物膜相关的颗粒”，因为使用的方法无法区分这两种潜在的过程。在暴露终止时，分别为14天（实验1）或4天（实验2），进行了以下步骤（见图S1–SI）：（1）直接测量每个微宇宙中3个周丛生物切片的光合作用活性；（2）测量后，用干净的显微镜载玻片刮下这些周丛生物，并将其悬浮在10毫升的新鲜Periquil溶液中；（3）使用1毫升的悬浮液来测定叶绿素a的含量，作为生物量的指标；（4）对2毫升的悬浮液使用0.01%的甲醛和0.1%的丙二醛进行固定，并在4°C下储存，用于通过流式细胞术分析群落结构，仅适用于实验1；（5）对2毫升的悬浮液进行提取DNA，用于通过下一代测序分析群落组成（在13000 rpm下离心30分钟，并在-20°C下储存，仅适用于实验1）；（6）将5毫升的悬浮液在-20°C下冷冻，然后冷冻干燥，用于化学分析。此外，还从微宇宙中提取了15-18毫升的Periquil滤液，并在-20°C下冷冻，用于化学分析。在本研究中，群落结构指的是不同细胞群体及其表型（荧光和大小特征）的排列，而群落组成则用于表示物种丰富度和丰度。

**周丛生物特征描述和化学分析**

**光合作用效率：** 通过将切片逐一转移到培养皿中，使用Imaging-PAM（脉冲幅度调制）荧光计（Heinz Walz GmbH，德国）直接测量周丛生物的光合作用效率。该方法基于在施加单一光饱和脉冲前后在665 nm处测得的叶绿素a荧光，来计算有效量子产率（?’）：?’ = (FM-F0)/FM，其中FM是饱和脉冲后的最大荧光，F0是稳态荧光（Dorigo & Leboulanger, 2001）。光合作用效率是光系统II完整性的指标，从而反映了生物体进行光合作用的能力（Dorigo & Leboulanger, 2001）。

**叶绿素a：** 叶绿素a的含量被用作藻类生物量的代理指标，如Sartory等人（1984）所描述，详见A部分-SI（Sartory, 1984）。

**流式细胞术（FC；仅适用于实验1）：** 使用FC（Beckman Coulter Gallios，毛细管尺寸<50 μm）结合视觉随机网络嵌入（viSNE）（Merbt等人，2024；Sgier等人，2016）来评估周丛生物的表型结构。在FC分析之前，将2毫升的周丛生物悬浮液通过50 μm的筛网过滤器（Partec）过滤，以避免细胞和颗粒聚集。样品采集设置遵循之前研究中的协议（Sgier等人，2016），数据分析见下文。

**DNA提取和测序（仅适用于实验1）：** 通过下一代测序（NGS）研究周丛生物群落组成。根据制造商的说明，使用DNeasy PowerBiofilm Kit（Qiagen）从周丛生物沉淀物中提取DNA，包括提取阴性对照（即空管）。使用Qubit（1.0）荧光计按照dsDNA HS Assay协议（Life Technologies，加州卡尔斯巴德）检查所得DNA的浓度和质量。提取的DNA用于构建文库，采用两步聚合酶链反应（PCR）协议进行MiSeq测序。使用移码引物（表S2–SI）扩增16S和Rbcl区域，分别得到483 bp和486 bp的片段（详见B部分-SI中的热循环条件）。对于MiSeq测序，根据制造商的说明使用Nextera XT索引适配器对PCR产物进行索引。使用AMPure珠（Beckmann Coulter）和Spark荧光计对所得文库进行清洗和定量。使用移液机器人（Liquid Handling Station，品牌）将文库浓缩至最终浓度4 nM。在变性（0.2 M NaOH）后，在Illumina? MiSeq机器上以配对末端模式进行测序，读取长度为600 bp。序列存储在data.eawag.ch/dataset/cmtt-induces-functional-and-structural-changes-in-natural-periphyton-communities（另见D和E部分-SI）。使用DADA2（Callahan等人，2016）对读取数据进行稀疏化，并将原始数据聚类为扩增子序列变异体（ASVs），详见数据分析部分。

**周丛生物和暴露介质的化学分析**

**金属：** 在酸消化10毫克冻干周丛生物后，测定周丛生物或周丛生物加相关CMTT样品中的金属含量（详见C部分-SI）（Masset等人，2021）。所得样品通过0.45 μm过滤器（Chromafil?）过滤，稀释后分析金属含量。介质样品也通过0.45 μm过滤器（Chromafil?）过滤，稀释后分析金属含量。金属分析使用ICP-MS/MS（Agilent? 8900）进行。有关仪器设置和质量控制的更多信息，请参见之前的研究（Masset等人，2021）。

**有机化学物质：** 使用加速溶剂萃取器（ASE 350，Dionex?）提取周丛生物或周丛生物加相关CMTT样品。萃取池填充至2/3，其中装有覆盖有0.45 μm纤维素滤膜的玻璃珠（Whatman?），详见C部分-SI。然后在氮气柔和流动下将提取物浓缩至2毫升，通过0.45 μm玻璃纤维过滤器（Whatman?）过滤并进行分析。介质样品同样通过0.45 μm玻璃纤维过滤器（Whatman?）过滤，加入氘代内标物后稀释并分析。使用UPLC-MSMS（Xevo TQ MS，Waters?）分析周丛生物和介质样品中的所有有机化学物质。每批样品分析六个校准水平（1 ng/mL至500 ng/mL，线性R2 >0.999）。详细的UPLC-MSMS方法见之前的研究（Masset等人，2022）。

**数据分析**

使用Shapiro–Wilk检验测试残差的正态性，使用Levene检验测试单变量数据的同方差性（所有数据均除外群落组成）。如果满足参数检验的假设，则对原始数据应用单因素方差分析（ANOVAs），以“处理”为自变量，并进行Bonferroni p值调整的主效应事后比较。当不满足参数检验的假设时，改为使用Kruskal-Wallis非参数检验。

FC数据使用viSNE进行分析，采用Barnes-Hut SNE（bh-SNE）算法（Amir el等人，2013；van der Maaten，2014），生成二维散点图（viSNE图）。在这种图中，具有相似荧光和光散射特性的细胞会聚集在一起形成明显的簇。使用MATLAB（Sgier等人，2016）进行簇形成和量化。所得viSNE图用于可视化数据分布。表示每个簇中事件数量的簇丰度被标出，并统计测试不同处理之间的差异。为了帮助解释，生成图表以显示所有分析通道和CMTT处理中的所有识别簇。为了将潜在的分类学身份分配给簇，将簇的特征与参考物种的光学特性进行比较（例如蓝细菌门、硅藻、绿藻和红藻）（Sgier等人，2016；Sgier等人，2018）。

对于测序数据，在稀疏化后，使用SILVA数据库版本138.2（Yarza等人，2014）为16S和Rbcl ASVs分配分类学归属。Rbcl ASVs在US National Center for Biotechnology Information参考数据库（GenBank BLAST?的核苷酸集合；“blastn”网络应用中的megablast）中进行blast值比对（Camacho，2009）。当SILVA和BLAST的分类结果不一致时，按照以下标准进行校正：（1）与任何藻类分类单元的BLAST匹配度≥95%；（2）序列覆盖率≥95%；（3）最高的e值（序列覆盖率与相似度的比率）；（4）可靠发布的序列信息（参考数据库，是否有出版物）。导致相同属/种的ASVs按样本合并。在整个数据集中，16S和Rbcl分别有2387个和174个ASV通过了我们的质量标准。从这些ASV中，那些仅出现一次或未鉴定的ASV被排除在后续分析之外。Rbcl ASV按属和藻类组分类。对于16S，由于多样性远高于Rbcl，ASV按门分类。从这个数据集中，将属于蓝细菌的ASV（102个）也作为一个藻类组进行分析。对于16S和Rbcl，分别使用R Ver. 4.2.1（Team，2025）进行存在/缺失（使用Jaccard）和丰度（使用Bray-Curtis）分析。使用phyloseq 1.34.0中的函数估计丰富度（McMurdie，2013）和成对Wilcoxon检验计算每个处理的Alpha多样性。使用Bray-Curtis、NMDS和成对PERMANOVA进行16S和Rbcl群落组成对CMTT处理的响应变化分析。此外，使用FAPROTAX 1.2.11工具将16S的数据与功能谱进行关联（Louca，2016）。图表使用Biorender、Prism GraphPad和R studio制作。文本由deepL和ChatGPT进行语法校正。文中“显著地”一词指的是统计上显著的结果（p<0.05）。

**结果**

对于两种实验设置（实验1和实验2），结果以4天或14天暴露期间相关或回收的颗粒总质量表示。我们观察到，在500-1000 mg/L CMTT浓度下，大约25-30%的CMTT质量与周丛生物相关（见图1A和D）。在50 mg/L浓度下，也发现CMTT与周丛生物相关（见图S3C–SI），但相关质量太低而无法量化（<1 mg）。此外，我们观察到在第一次更换培养基后的前两天内颗粒与周丛生物的快速结合，之后达到稳定状态（7天，见图S4–SI）。

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**图1.** 14天（A）和4天（D）暴露期间CMTT颗粒回收（黑色）和生物膜相关颗粒（粉色）的质量（以毫克计），虚线表示添加的CMTT总质量。光合作用效率以有效PSII量子产率（φ’）（B和E）表示，生物膜生物量以叶绿素a含量（μg/mL）表示（C和F），分别以箱形图展示（最小值到最大值，* p<0.05，** p<0.01，**** p<0.0001）。对照组（0 mg/L CMTT）以黑色显示，1000 mg/L CMTT以紫色显示，适用于14天和4天的暴露，而化学物质（橙色）表示从1000 mg/L CMTT中浸出的化学负荷。

**金属含量**

在量化暴露介质和周丛生物中的金属含量时出现了多种模式（见图S5和S6 - SI），表明CMTT浸出的贡献较低，锌（Zn）是例外。事实上，已知Zn在CMTT中浓度很高，并似乎对暴露介质中的Zn含量有贡献。相比之下，与周丛生物相关的金属含量通常随着CMTT浓度的增加而减少，Zn再次是一个显著的例外。在Zn的情况下，与周丛生物相关的量达到了约1500 mg/kg的最大值，与添加的CMTT浓度无关（见图S5M和N - SI）。在实验2中，CMTT也发现了高浓度的Zn（5.5 g/kg；见图S6D–SI）；在单独的浸出液中测得的Zn非常少，这表明Zn是被周丛生物直接释放并立即吸收的。

**有机化学物质**

在实验1中，随着CMTT浓度的增加，有机化学物质（分别为BT- 84 μg/L, 4.7 g/kg；2A-BT – 0.2 g/kg；2H-BT - 43 μg/L, 8.3 g/kg；MTBT – 5 μg/L, 8.6 g/kg；2S-BT – 19.6 g/kg；Aniline - 32 μg/L, 16.0 g/kg；6PPD – 0.42 μg/L, 1050.0 g/kg；DPG – 149.7 g/kg；6PPD-Q – 0.57 μg/L, 3.1 g/kg；6QDI – 25.0 g/kg；TMQ – 0.6 g/kg；HMM – 4.5 μg/L, 0.2 g/kg；CPU – 9 μg/L, 0.3 g/kg；DCU – 8 μg/L；HDPA - 2 μg/L, 2.5 g/kg；ADPA - 6 μg/L, 20.0 g/kg）在介质和周丛生物中均有所增加（见图S7–SI）。在实验2中，无论是在介质还是周丛生物中，随着CMTT暴露，有机化学物质也无一例外地增加（见图S8–SI）。然而，在渗滤液暴露的情况下，只有少数有机化合物（2H-BT - 75 μg/L、苯胺 – 45 μg/L、6PPD – 1.8 μg/L、DPG – 160 μg/L、6QDI – 2.5 μg/L、HMMM – 3.2 μg/L、CPU – 23 μg/L 和 DCU – 15 μg/L）在培养基中能够被定量测定，而在附着生物中能够被量定的化合物更少（6PPD – 800.0 g/kg、DPG – 150.0 g/kg、6PPD-Q – 2.8 g/kg）（图 S8–SI），这再次支持了 CMTT 与附着生物之间的直接相互作用是导致附着生物暴露的必要条件。

**光合作用和生物量**
在 1000 mg/L CMTT 的条件下，与对照组相比，光合作用效率下降了约 10%（图 1B 和 E）；然而，这一显著效应仅在实验 1 中的 50 mg/L 和/或 1000 mg/L CMTT 暴露条件下出现（图 1B；表 S3–SI）。有趣的是，在实验 2 中，暴露于渗滤液后光合作用效率也显著降低（图 1E）。
作为藻类生物量代理指标的叶绿素 a 含量在两个实验中的结果有所不同。在持续 14 天的实验 1 中，500 mg/L 和 1000 mg/L 暴露组的叶绿素 a 含量较对照组显著减少了约 30%（图 1C；表 S3–SI），而在实验 2 的 4 天后则没有发现显著差异（图 1F）。

**群落结构（实验 1）**
对微生物细胞表型差异的分析产生了 22 个簇（图 S9 和 S10 - SI），其中 5 个簇对 CMTT 暴露表现出统计学上的显著反应（图 S11–SI）。对于这些显著簇，进一步进行了方差分析（ANOVA）以检测各分析参数之间的差异（表 S4–SI）。变化主要发生在 500 mg/L 或 1000 mg/L CMTT 与对照组之间（表 S4–SI）。观察到所有五个簇中的细胞大小都有显著变化，但无法确定处理之间的普遍模式（见通道 SS，图 S10，表 S4–SI）。将不同藻类群体的参考数据叠加（用红色圆圈表示，图 S11B-E - SI）显示，簇 1 与蓝细菌有很强的相似性（图 S11B–SI），而硅藻和绿藻的信号则分散在不同的簇中（图 S11C 和 E - SI）。簇 19 与衰亡的细胞有很强的相似性，主要区分了 1000 mg/L 处理组与其他处理组（图 S11D–SI）。此外，大量硅藻参考数据与簇 19 重叠，表明硅藻细胞可能发生了死亡（图 S11C 和 D - SI）。

**细菌群落组成（实验 1）**
细菌群落组成的主成分分析（PCoA）显示出对 CMTT 颗粒存在的明显反应（50 mg/L、500 mg/L 和 1000 mg/L），即基于门组成的不同分组（图 2A），尽管技术重复样本存在变异性（相同颜色的点）。PERMANOVA 分析支持所有 CMTT “处理组”之间存在显著差异，除了对照组与 50 mg/L 处理组（表 S3–SI）。丰富度（Chao 1）和多样性（Shannon）指数显示，在较高 CMTT 浓度下物种数量和丰度略有增加（图 2B 和 C，表 S3）。

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**图 2. 基于 NGS 16S 测序的实验 1 中细菌丰度组成，暴露于 0-1000 mg/L CMTT 14 天。**
A) 使用 Bray-Curtis 的主坐标分析（PCoA）；
B) 基于 Chao 指数的物种丰富度；
C) 基于 Shannon 指数的物种多样性；
D) 基于 Faprotax 分析的功能谱。
E) Acidobacteriota 的个体丰度，表示为平均值 ± 标准差；
F) Actinobacteriota；
G) Armatimonadota；
H) Bacteroidota；
I) Cyanobacteriota；
J) Pseudomonadota；
L) Verrumicrobiota；
M) Bacillota；
N) Bacillota 属的相对丰度。

对最丰富的 10 个细菌门进行分析后，发现不同群组对 CMTT 暴露的反应各不相同（图 2D）。根据这些丰度变化，我们还预测了不同 CMTT 处理下细菌群落的功能谱的变化（图 2E）。在较低浓度（对照组和 50 mg/L）下，与氮代谢相关的分类单元更为丰富。然而，基于基因组潜力，我们观察到从最低测试浓度（50 mg/L）开始光自养细菌的数量增加（图 2E），这可能与蓝细菌群的较高丰度有关（50–500 mg/L；图 2J）。而在 500 mg/L 和 1000 mg/L 下，与氮代谢和光自养相关的分类单元被化能异养细菌（即非光合细菌）所取代（图 2E）。进一步仔细观察个别门，一些群组的丰度随着 CMTT 浓度的增加而增加，如 Acidobacteriota、Pseudomonadota 和 Verrumicrobiota（图 2F、K 和 L）。相比之下，蓝细菌仅在 CMTT 浓度处于中间范围（50 mg/L 和 500 mg/L）时表现出更高的丰度，高于对照组和最高处理组（图 2J）。相反，一些门在 CMTT 暴露增加时丰度下降，包括 Actinobacteriota、Armatimonadota、Bacteroidota 和 Bacillota（图 2G、H、I 和 M）。例如，Bacillota 在对照组中的丰度大约是其他 CMTT 处理组的六倍（图 2M）。这种模式表明，在该实验设计中，低于 50 mg/L 的浓度不会对群落组成产生影响。

**属水平分析**
我们识别出两种 Bacillota 代表：Bacillus sp. 和 Romboutsia sp。Bacillus sp. 是对照组（0 mg/L）中唯一可检测到的属，在 50 mg/L、500 mg/L 和 1000 mg/L CMTT 处其相对丰度分别下降了 25%、65% 和 75%（图 2N）。

**藻类**
自养群落组成随着 CMTT 浓度的增加而发生变化，尽管这种变化不如细菌明显。基于属丰度的 PCoA 分析仅将对照组和 500 mg/L 处理组区分开来，这可能是由于样本内部变异较大（图 3A）。多样性分析显示两个响应组：对照组和 50 mg/L 处理组的丰富度和多样性较高，而 500 mg/L 和 1000 mg/L 处理组的 Chao 1 和 Shannon 指数较低（图 3B 和 C）。按藻类组分对分类单元进行分组后，处理之间的差异更加明显（图 3D）。对照组主要由硅藻组成，其他藻类组丰度较低（图 3D 和 G）。相比之下，CMTT 处理组与黄绿色藻类、绿藻和蓝细菌的比例增加相关（图 3E-H）。这些群组在 50 mg/L 和 500 mg/L 时最为丰富，但在 1000 mg/L 时减少。

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**图 3. 基于 NGS Rbcl 测序的实验 1 中藻类丰度组成，暴露于 0-1000 mg/L CMTT 14 天。**
A) 使用 Bray-Curtis 的 PCoA 显示 CMTT 暴露对属分布的影响；
B) 基于 Chao 指数的物种丰富度；
C) 基于 Shannon 指数的物种多样性；
D) NMDS 显示 CMTT 暴露对藻类组分布的影响。
E) 黄绿色藻类的个体丰度，表示为平均值 ± 标准差；
F) 绿藻；
G) 硅藻；
H) 基于丰度平方根转换的蓝细菌。

在属水平上，蓝细菌 Allocoleopsis sp.、Phormidesmis sp. 和 Plectolyngbya sp. 以及硅藻 Karayevia sp. 和 Seminavis sp. 对处理组的区分贡献最大（表 S5）。然而，由于 RbcL 基因拷贝数的高种间变异性，未检测到属丰度的统计学显著差异（表 S5）。尽管如此，SIMPER 分析显示，如 Gomphonema sp.、Nitzschia sp. 和 Achnanthidium sp. 等常见属的减少对处理组之间的差异贡献最大（表 S5）。

**讨论**
我们的研究表明，附着生物群落作为 CMTT 及相关化学物质的吸收体（假设 a），这种快速且密切的相互作用可能是通过 CMTT 嵌入EPS-微生物组装体中介导的。此外，CMTT 相关化学物质导致附着生物功能在 4 天内发生变化，即光合作用（实验 2 - 假设 b）。在更长时间的暴露（14 天）和 CMTT 含量增加的情况下也观察到了类似的光合作用变化，但同时附着生物生物量下降，其组成也发生了变化（实验 1 - 假设 b）。这些发现与季节无关（实验 1 在夏季进行，实验 2 在秋季进行）；然而，我们也承认这一因素可能会增加附着生物反应的变异性。此外，我们必须承认本研究的其他限制，因为使用了 CMTT。除了大小、形状和成分与环境中的 TWP 和 TRWP 不同外，本研究中使用的 CMTT 仅经过 EPS 作为风化形式处理，因此自然环境中的 TRWP 可能与附着生物的不同方式相关。此外，本研究使用 CMTT 并未考虑 TRWP 中存在的其他成分（如道路灰尘和轮胎磨损）。尽管如此，CMTT 仍然代表了这些颗粒中轮胎来源的部分，因为它含有相关的化学添加剂，包括 6PPD。因此，我们的发现为轮胎成分的具体贡献提供了宝贵的见解，并有助于在设计上更可持续的轮胎配方的发展。

在实验 2 的“化学物质”处理组中，CMTT 相关化学物质的含量在附着生物中低于检测限（LOQ），但在培养基中高于 LOQ。后者表明未经处理的生物膜在 4 天内未吸收到可检测量的化学物质。可能发生了其他过程，如同化、代谢或转化，这需要进一步研究。

此外，在实验 1 和 2 中的颗粒处理中，我们无法区分与附着生物相关的 CMTT 相关化学物质、吸附在附着生物上的化学物质以及仍然存在于颗粒本身的化学物质。正是由于这些不确定性（积累、吸收还是吸附到生物体外），根据欧盟水框架指令（WFD）推导环境质量标准（EQS）时，藻类的生物浓缩因子值被认为不太可靠（SCHEER, 2017）。尽管如此，与附着生物相关的颗粒以及相关的化学物质，无论是与附着生物相关还是仍存在于颗粒中，都代表了其他营养级的暴露途径（例如食草动物）。

我们关于颗粒与附着生物关联的发现与先前的研究一致，这些研究表明微生物定植和 EPS 分泌促进了颗粒的聚集和沉淀（Wang 等，2024；Yang 等，2024）。颗粒与附着生物之间的快速关联（本研究中为 25-30%）在自然环境中尤为明显，因为 TWP 主要在降雨事件（Wik 等，2009）、道路冲洗、除雪或农业灌溉期间引入水体。这种短期输入导致水体中的浓度峰值超过当前淡水溪流的最高估计值（10 mg/L），在某些情况下甚至达到 g/L 范围（参见 Song 等，2024）。此外，这样的峰值浓度为颗粒提供了足够的机会，使其以与我们研究的浓度相似的方式进入附着生物膜。

除了 CMTT，我们还观察到附着生物中的有机化学物质增加，而对于金属，除锌外，其浓度随着 CMTT 浓度的增加而下降。根据现有数据，我们无法解释这一模式；不过我们提出三个假设，这些假设应在未来的研究中得到验证：
(1) CMTT 稀释金属含量：对照样本包含 100% 的附着生物，因此测量到的金属浓度较高。而在含有颗粒的样本中，不含这些金属的 CMTT 颗粒降低了金属浓度，降低程度与 CMTT 浓度成反比。
(2) 过量锌导致的金属置换：CMTT 中过量的锌通过错误配位阻止了蛋白质巯基的结合（Hussain 等，2022），可能影响了其他必需金属的吸收。由于附着生物中的锌浓度在最低 CMTT 暴露浓度时就已达到最大值，这一假设似乎合理。
(3) 颗粒表面性质的变化：未与附着生物相关的颗粒及其表面性质改变可能吸附了金属，从而降低了培养基和附着生物中的金属浓度。这些非相关颗粒占添加颗粒的 70-75%。随着更多非相关 CMTT 的添加，CMTT 颗粒可能吸附了更多的金属，这解释了金属浓度随 CMTT 浓度增加而降低的现象。这种潜在的更高吸附能力可能是由于 CMTT 中的化学键在紫外线或其他老化过程中断裂所致。这种破损会释放化学添加剂，并导致颗粒表面形成氧化基团（即颗粒表面性质发生变化），从而增加它们的负电荷、亲水性以及吸附金属离子的能力（Anirudhan, 2012; Kreider et al., 2010）。在有机化学方面，CMTT与附生生物的直接接触似乎在颗粒持续释放化学物质的过程中起着作用。先前已有研究表明，与附生生物相关的轮胎相关化学物质有所增加（Li et al., 2025）。这种化学物质的积累尤其令人担忧，因为附生生物是水生食物链的基础。从那里，这些化学物质可以转移到以附生生物为食的生物体中，例如无脊椎动物或食藻鱼类（Chai et al., 2024; Justino et al., 2023; Zhao et al., 2024）。在我们的研究中，与附生生物相关的化学物质包括6PPD（培养基中为0.2–2 μg/L；附生生物中为1–500 g/kg）和6PPD-Q（培养基中为0.2–0.7 μg/L；附生生物中为1–4 g/kg），这两种物质是被广泛认为与鱼类毒性有关的轮胎相关化学物质。早期的一项研究发现，6PPD-Q（浓度高达100 μg/L）对蓝藻Synechocystis sp.的类囊体结构有显著影响（You et al., 2024）。醌类物质可以从光合作用位点接受电子，从而扰乱电子流动，可能导致我们观察到的光合作用效率和生物量下降。然而，并非所有观察结果都与先前的报道一致。例如，6PPD/6PPD-Q在200 μg/L的浓度下还能增强绿藻C. vulgaris的光合作用和生长，而在400 μg/L的浓度下则抑制了生长（Liu et al., 2024）。在我们的研究中，其他可能与轮胎相关的化合物，如环胺（DCU、ANILINE、ADPA、HDPA）和苯并噻唑类（BT、MTBT、2A-BT、2H-BT、2S-BT）也可能对藻类的毒性产生影响。尽管如此，这些化学物质的毒性明显低于对苯二胺类（例如6PPD），这一点已在绿藻C. vulgaris和S. oblisquus中得到研究（Jiang et al., 2024; Jiang et al., 2023）。我们发现，只有在最高测试浓度（500和1000 mg/L的CMTT）下，14天后生物量（叶绿素a）才会受到影响，而光合作用在4天和14天的暴露下都会受到影响。这些发现似乎得到了先前研究的支持，但由于使用的浓度不同、生成轮胎颗粒的方法、实验设计和暴露时间不同，直接比较这些研究是具有挑战性的（见附录F – SI）（Chai et al., 2024; Cui et al., 2024; Ganie et al., 2025; Jiang et al., 2023; X. Li et al., 2024; Liu et al., 2024; Wang et al., 2024）。尽管如此，在使用藻类的研究中，由于轮胎相关暴露导致的生物量减少和光合作用受损是一个常见结果（见附录F – SI）。此外，在我们的研究中，当CMTT浓度为500和1000 mg/L时，还观察到附生生物的荧光和细胞大小（FC分析）发生了显著变化，表明在细胞和生理层面上发生了改变。在实验2中，光合作用效率显著下降，但生物量没有相应减少，这表明出现了早期应激反应，其中光合作用装置的损伤（例如PSII受损）先于可测量的生物量影响发生。正如实验1所示，附生生物生物量的可测量影响需要更长的时间。虽然群落结构的变化没有遵循简单的线性剂量依赖模式，但观察到了与特定生物群体（如蓝藻、硅藻和衰败细胞）相关的显著变化。实际上，在类似的TWP浓度下，也观察到了蓝藻M. aeruginosa的形态变化（Cui et al., 2024）。我们研究中的附生生物含有大量常见于淡水微生物群落的细菌和藻类，这突显了我们的研究设计产生的接近自然群落的特性。不同的细菌门对CMTT的增加反应不同。在最低测试浓度（50 mg/L）下，Bacillota的缺失这一点非常重要，因为它适用于环境相关的浓度（Gaggini et al., 2024; Song et al., 2025）。Bacillota也称为Firmicutes，是常见于各种生境中的革兰氏阳性细菌，包括肠道微生物群、沉积物和淡水（Wang et al., 2016）。在这个广泛的门中，两个鉴定出的属对CMTT暴露的反应非常不同。根据相对丰度，Bacillus sp.在对照组中占主导地位。这些细菌是有氧或兼性厌氧的，能够形成内孢子，因此能够在极端条件下存活。当暴露于逐渐增加的CMTT浓度时，这个属被主要是厌氧的Romboutsia sp.所取代。它们的相对丰度可能与沉积物中的金属污染有关（Fernandes et al., 2020），并且它们是鱼类和无脊椎动物肠道微生物群的核心属（Dueholm et al., 2024; Vaughn et al., 2023）。以Bacillota为例，细菌群落的这种变化可能导致群落功能特性的改变。基于细菌组成的基因组潜力的Faprotax分析支持了这种可能的反应变化，即在最高测试的CMTT浓度下，有氧化能异养菌的数量增加，而N还原和有氧NH3氧化菌的数量减少。以我们的研究为例，参与N代谢的细菌明显减少。然而，由于这项分析基于基因组潜力，这些发现需要在未来的研究中进一步验证。在先前的研究中已经观察到由于轮胎相关颗粒或化学物质暴露导致的N代谢减少（Jiang et al., 2023; Liu et al., 2022; Mo et al., 2025）。在海洋沉积物中，Bacillus sp.在分别暴露于TRWP和渗滤液30天后数量减少，而且渗滤液的毒性更强（Liu et al., 2022）。在同一项研究中，个别Bacillus subtilis、Halioglobus lutimaris、Aliivibrio fischeri（ formerly Vibrio fischeri）菌株表现出对TRWP的特别敏感性。与未受影响并能附着的其他细菌相比，这些菌株的生长受到抑制（Liu et al., 2022）。此外，与厌氧N代谢相关的基因上调，表明TRWP可能调节微生物代谢N和S的能力（Liu et al., 2022）。另一个功能变化的例子是在暴露于50 mg/L的老化TRWP后，污泥细菌群落中的P去除功能受到抑制（K. Li et al., 2024）。总体而言，越来越多的证据表明轮胎相关颗粒和化学物质暴露会干扰重要营养素（如N、P和S）的生物地球化学循环以及自养功能（通过光合作用进行C固定）。在这种情况下，我们还证明了不同藻类群体在对CMTT暴露后的丰度上发生了相关变化。硅藻受到的影响最大，而蓝藻在50和500 mg/L CMTT暴露下数量增加，但在更高浓度下多样性和丰富度下降。绿藻在500 mg/L CMTT暴露下也似乎受益，这与先前的研究结果一致（Lv et al., 2024; You et al., 2024）。CMTT暴露期间硅藻的减少可能促进了其他藻类群体的增殖，这与淡水自养群落的典型演替模式一致。此外，被鉴定为在不同CMTT处理下具有更强差异性的藻类属具有支持群落功能变化的特征。例如，Allocoleopsis.sp和Phormidesmis sp.参与N固定和EPS生产（Koch et al., 2022），Plectolyngbya sp.对极端环境具有很高的适应性（Kim et al., 2022），Karayevia sp.和Seminavis sp.具有高遗传多样性和沿化学和物理梯度的移动能力（Bondoc et al., 2019）。总体而言，尽管物种组成发生了深刻变化，自养群落仍然具有足够的冗余性和稳健性来维持光合作用功能，只有在高CMTT浓度下才会有轻微下降，尽管这种下降程度高于自然环境中的预期。然而，这项研究还表明，即使在群落具有较强鲁棒性的情况下，潜在的功能变化也可能在较低的CMTT浓度下开始，并可能干扰重要的营养循环。这可能表明对生态系统功能的负面影响。

结论
TWP及其相关化学物质现在在全球水道中被检测到。在这些环境中，它们与微生物群落相互作用，并可能破坏附生生物的结构和功能。特定的微生物群体对CMTT暴露反应强烈，应作为未来轮胎相关研究的模型群体进行进一步评估。当前研究的一个典型例子是Bacillota和硅藻在50 mg/L浓度下的数量减少，这一浓度在隧道冲洗、融雪事件和严重污染的城市地区等最坏情况下是现实的。虽然在目前仅在这些极端情况下认为相关的浓度（500和1000 mg/L）下才会出现明显的功能影响，但它们展示了如果发生此类暴露可以预期的响应范围。此外，我们的发现对于环境风险评估非常重要，因为它们表明这些浓度可以引起群落组成的可测量变化，从而导致功能损伤。在这种情况下，附生生物群落可以作为内在生态系统功能的指标，例如营养循环，以及颗粒和化学物质的分布介质。这是因为附生生物在水柱和沉积物之间形成界面，同时为食物网中更高营养级的生物（例如食草生物）提供了进入途径。因此，附生生物结构和功能的变化直接与环境风险评估相关，因为它们可能影响生态系统过程和通过食物网的污染物转移。

CRediT作者贡献声明
Thibault Masset：写作 - 审稿与编辑、方法学、调查、形式分析、概念化。
Anna Toso：写作 - 审稿与编辑、概念化。
Alan Bergmann：写作 - 审稿与编辑、概念化。
Etienne Vermeirssen：写作 - 审稿与编辑、概念化。
Florian Breider：写作 - 审稿与编辑、资金获取、概念化。
Benoit Ferrari：写作 - 审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念化。
Kristin Schirmer：写作 - 审稿与编辑、监督、方法学、调查、资金获取、形式分析、概念化。
Sara Gon?alves：写作 - 审稿与编辑、原始草案编写、可视化、方法学、调查、形式分析、数据管理、概念化。
Alexandra Kroll：写作 - 审稿与编辑、方法学、调查、形式分析、概念化。