低剂量无机砷暴露会重新编程巨噬细胞的分化和功能，使其趋向于促进肿瘤生长的表型

《Environmental Research》：Low-dose Inorganic Arsenic Exposure Reprograms Macrophages Differentiation and Function Toward Tumor-promoting Phenotypes

　　

艾米丽·J·伊林沃思（Emily J. Illingworth）|西尔维娅·S·桑切斯（Sylvia S. Sanchez）|克里斯塔尔·A·里奇利克（Kristal A. Rychlik）|安德烈·克伦桑（Andre Kleensang）|杰森·莱尔德（Jason Laird）|加布里埃尔·A·洛佩兹-塞塞塔伊特（Gabriel A. Lopez-Cecetaite）|M·卡罗莱纳·罗德里格斯·斯图贝（M. Carolina Rodriguez Steube）|阿克里蒂·马图尔（Aakriti Mathur）|普里塔姆·萨杜坎（Pritam Sadhukhan）|丹尼尔·A·梅迪纳-克莱格霍恩（Daniel A. Medina-Cleghorn）|丹尼尔·野村（Daniel Nomura）|马蒂恩·T·史密斯（Martyn T. Smith）|穆罕默德·O·霍克（Mohammad O. Hoque）|芬娜·C.M. 西莱（Fenna C.M. Sillé）

约翰霍普金斯大学，彭博公共卫生学院，环境健康与工程系，美国马里兰州巴尔的摩市

摘要

无机砷（iAs）是一种已知的致癌物和免疫毒素，它污染了用于饮用、食品生产和灌溉的地下水，导致全球约有2亿人暴露在超过世界卫生组织安全饮用水限值10 μg/L的砷环境中。国际癌症研究机构（IARC）将无机砷列为致癌物，同时它还会增加感染疾病的易感性，这突显了其作为免疫毒素的作用。本研究利用体外暴露模型阐明了砷对巨噬细胞的影响。从成年雄性和雌性C57BL/6小鼠中分离出骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。幼稚巨噬细胞（“M0” BMDMs）在7天的分化期间暴露于非细胞毒性的无机砷剂量中，并分别用LPS和IFNγ或IL-4和IL-13刺激24小时，以诱导“M1”或“M2”活化状态。与此同时，RAW 264.7（RAW）巨噬细胞长期暴露于无机砷中70天，并在最后24小时被激活。培养上清液分析显示，“M1” RAW巨噬细胞的 nitric oxide 产生减少，而BMDMs则没有；尽管在激活状态之间存在显著的性别差异，但BMDMs主要表现出细胞因子/趋化因子的表达抑制。流式细胞术证实了这些与性别和刺激相关的巨噬细胞极化变化，“M2”标志物在无机砷暴露后上调，而功能标志物iNOS和MHCII仅在雄性BMDMs中降低。脂滴形成的增加以及脂质组和代谢组谱型的改变进一步表明无机砷暴露会诱导促肿瘤微环境。因此，暴露于无机砷的巨噬细胞表现出向癌细胞培养基迁移的增加，并促进癌细胞的增殖。总体而言，这些结果提供了表型和机制上的见解，表明无机砷不仅抑制免疫功能，还会使巨噬细胞极化和免疫代谢偏向促进肿瘤的表型。

引言

无机砷（iAs）是一种天然存在的类金属物质，由于其在饮用水和农作物灌溉系统中的广泛污染，已成为一个紧迫的公共卫生问题（世界卫生组织，2006年）。尽管世界卫生组织（WHO）的安全标准为10 μg/L（10 ppb），但全球仍有超过2亿人饮用水中砷的含量超过了这一阈值（Podgorski & Berg, 2020; Shaji et al., 2021; WHO, 2006）。国际癌症研究机构（IARC）将无机砷列为1类致癌物（IARC, 2012），流行病学研究（Banerjee et al., 2009; A. Rahman et al., 2011; Smith et al., 2011）和实验结果也支持无机砷作为免疫毒素的作用（Bishayi & Sengupta, 2006; Kozul et al., 2009; Lemaire et al., 2015; Lemarie et al., 2006, 2008; Medina et al., 2020; Sengupta & Bishayi, 2002），这与结核病等传染病的死亡率增加以及下呼吸道感染易感性的增加有关（Smith et al., 2011）。多项综述概述了支持无机砷作为免疫毒素的证据（Bellamri et al., 2018; Dangleben et al., 2013），特别是在怀孕和早期生命阶段（Attreed et al., 2017），以及在对专业抗原呈递细胞的影响（Bahari & Salmani, 2017; Giles & Mann, 2022; Raqib et al., 2017, 2023）。

巨噬细胞是专业的抗原呈递细胞，也是砷毒性的关键目标。这些先天免疫细胞具有高度可塑性，可以根据其微环境在多个活化状态之间转变（Mills et al., 2000; Orecchioni et al., 2019）。为简化起见，我们将这些活化状态称为M0（稳态或静息巨噬细胞，未受到刺激）、M1（“促炎”巨噬细胞，通常对感染作出反应）和M2（“抗炎”巨噬细胞，参与组织重塑）。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的一个成分，会触发以TNF和IL-6等促炎细胞因子为特征的M1反应（Martinez & Gordon, 2014; Mosser & Edwards, 2008），而肿瘤微环境则会通过IL-10、IL-4、TGFβ以及癌细胞的代谢物（如前列腺素）使巨噬细胞向M2表型极化（Cui et al., 2017; Liu et al., 2021; R?szer, 2015）。这些与肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）往往具有促肿瘤性，由于它们分泌诸如IL-10和TGFβ等细胞因子（Chen et al., 2019; Fiorentino et al., 1991; Zhang et al., 2016）以及其他代谢物（例如脂质），这些物质会促进肿瘤生长和免疫抑制微环境的形成（Jayasingam et al., 2019; Liu et al., 2021），因此预示许多癌症的不良预后。多项研究表明，砷暴露会破坏正常的M1/M2巨噬细胞平衡（Cui et al., 2017; Hung et al., 2022; Illingworth et al., 2025; Yu et al., 2025）。巨噬细胞功能的破坏可能损害免疫稳态，并增加疾病风险。例如，砷引起的动脉粥样硬化是通过暴露于砷的巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块内的脂质稳态失调来介导的（Lemaire et al., 2011）。在癌症背景下，与肺（Cui et al., 2017）或肝（C. Wang et al., 2021; Xue et al., 2021）癌细胞共培养的暴露于砷的巨噬细胞已被证明会增强癌细胞的增殖，相比之下，未暴露的对照组巨噬细胞的共培养效果较差。在某些情况下（Cui et al., 2017; Xue et al., 2021），这种增殖效应伴随着M2极化标志物的表达增加，表明向免疫抑制表型的转变。砷还影响与造血相关的基因表达，包括单核细胞和髓系来源的抑制细胞（MDSCs）——这些髓系前体在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）存在下可分化为成熟巨噬细胞。这些细胞类型在许多与砷相关的疾病中发挥关键作用，主要是免疫抑制作用，包括癌症（Veglia et al., 2021）。

综上所述，这些数据表明巨噬细胞的分化、极化和脂质代谢是砷暴露的关键机制目标，并强调了在各种极化刺激背景下进一步表征暴露于砷的巨噬细胞的必要性。尽管脂质信号传导在与砷暴露相关的各种免疫相关状况中起着重要作用（例如动脉粥样硬化和心血管疾病（Balarastaghi et al., 2023; Lemaire et al., 2011, 2014）、肥胖和代谢综合征（Eick & Steinmaus, 2020; Koshta et al., 2024; Pánico et al., 2022）、糖尿病（Navas-Acien et al., 2006; Y. Zhang et al., 2025）、非酒精性脂肪肝病（Lu et al., 2025; X. Yang et al., 2023）以及癌症（Cui et al., 2017; Ruan et al., 2022; Speer et al., 2023）），以及脂质富集/泡沫巨噬细胞作为这些状况的标志性表型之一（Lee-Rueckert et al., 2022; Martinez-Campanario et al., 2025; Zheng et al., 2026），但目前尚未对暴露于砷的初级巨噬细胞进行全面的脂质和代谢研究。通过非靶向和靶向脂质组学以及LC/MS的靶向代谢分析，我们获得了关于砷暴露对巨噬细胞影响的表型和机制见解。

在这项研究中，我们使用了体外小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的暴露模型。BMDMs暴露于非细胞毒性的、与人类相关的无机砷浓度，以评估其对巨噬细胞分化和极化的作用。我们评估了一系列与M1和M2相关的终点，包括 nitric oxide（NO）的产生、通过流式细胞术检测的M1和M2表面标志物的表达、细胞因子的分泌、脂滴的形成，以及全面的脂质组和代谢组谱型分析。鉴于BMDMs的培养寿命有限（约1周），我们还将某些发现与长期（70天）在体外暴露于砷的RAW 264.7巨噬细胞进行了比较（Berghaus et al., 2010）。最后，为了评估无机砷对巨噬细胞在癌症背景下的影响，我们确定了暴露于无机砷的巨噬细胞是否表现出任何促肿瘤特征，包括向癌细胞培养基的迁移增加以及在共培养中促进癌细胞增殖。

节选

动物

从Charles River Laboratories（马里兰州弗雷德里克）购买了8-10周大的成年雄性和雌性C57BL/6CR小鼠（每种性别五只），并在实验前进行了为期1周的适应期。小鼠以每笼五只的方式饲养，并在温度和湿度受控的环境中保持，光照周期为14:10，食物和饮用水不限量提供。小鼠食用低砷饲料（AIN-93M：Research Diets，新不伦瑞克，NJ，CAT# D10012Mi）和无砷水（Crystal Geiser，

无机砷对BMDMs的细胞毒性

为了确定下游分析的非细胞毒性暴露剂量，我们在7天的分化期间对BMDM培养物施加了不同浓度的亚砷酸钠（0-1 μM）进行剂量-反应评估。简而言之，为了确定每种剂量下无机砷对BMDMs的细胞毒性，我们使用结晶紫试验测量细胞活力。在0.0001、0.001、0.01或0.1 μM的无机砷剂量下未观察到明显的细胞毒性；然而，1 μM的剂量导致了

讨论

在这项研究中，我们报告了长期暴露于无机砷（iAs）的巨噬细胞在性别和刺激因素依赖性方面的表型变化。我们观察到的 nitric oxide（NO）产生减少与先前关于人类（Banerjee et al., 2009）、小鼠腹膜巨噬细胞（Arkusz et al., 2005; Liu et al., 2008）、脾脏巨噬细胞（Bishayi & Sengupta, 2006; Sengupta & Bishayi, 2002）和RAW 264.7巨噬细胞（Chakravortty

CRediT作者贡献声明

普里塔姆·萨杜坎（Pritam Sadhukhan）：撰写 – 评审与编辑、方法学、研究。丹尼尔·A·梅迪纳-克莱格霍恩（Daniel A. Medina-Cleghorn）：撰写 – 评审与编辑、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。艾米丽·J·伊林沃思（Emily J. Illingworth）：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。马蒂恩·T·史密斯（Martyn T. Smith）：撰写 – 评审与编辑、资源管理。加布里埃尔·A.

未引用参考文献

Bishayi和Sengupta, 2003; Kelly和O’Neill, 2015; Liu et al., 2020; T et al., 2022; Trauelsen et al., 2021; Zhang et al., 2016.

利益冲突

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：芬娜·西莱（Fenna Sillé）、艾米丽·伊林沃思（Emily Illingworth）和克里斯塔尔·里奇利克（Kristal Rychlik）获得了美国国家环境卫生科学研究所的财务支持。芬娜·西莱还获得了约翰霍普金斯彭博公共卫生学院2019年Ho-Ching Yang纪念教师创新奖和2021年马里兰州香烟赔偿基金会的额外财务支持

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

作者在写作过程中没有使用生成式AI或AI辅助技术。

资助

本工作获得了...

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：芬娜·C·M·西莱（Fenna C. M. Sille）获得了国家环境卫生科学研究所的财务支持。艾米丽·伊林沃思（Emily Illingworth）获得了国家环境卫生科学研究所的财务支持。克里斯塔尔·A·里奇利克（Kristal A. Rychlik）获得了国家环境卫生科学研究所的财务支持。西尔维娅·S·桑切斯（Sylvia S. Sanchez）