《European Journal of Cell Biology》：Immunogenicity of mRNA encoded MUC1 glycopeptides toward CAR-T cells
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靶向低糖基化糖蛋白的疫苗和抗体一直是癌症免疫治疗的热点。尽管mRNA疫苗在诱导针对病毒糖蛋白和肿瘤抗原的有效T细胞免疫及抗体反应方面已取得成效，但mRNA编码的癌症糖蛋白（如MUC1）的免疫原性仍属未知。本研究采用嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）作为衡量标准，
靶向低糖基化糖蛋白的疫苗和抗体一直是癌症免疫治疗的热点。尽管mRNA疫苗在诱导针对病毒糖蛋白和肿瘤抗原的有效T细胞免疫及抗体反应方面已取得成效，但mRNA编码的癌症糖蛋白（如MUC1）的免疫原性仍属未知。本研究采用嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）作为衡量标准，检测由mRNA疫苗编码的MUC1糖肽的信号强度。结果显示，单个串联重复序列内的糖肽显示出比含多个串联重复序列的糖肽更高的刺激作用。此外，当MUC1糖肽融合至GPI锚（糖基磷脂酰肌醇）时，其刺激作用提高了五倍以上。利用总内反射荧光显微镜（TIRFM）测量了糖肽抗原的分子流动性，发现GPI锚定的MUC1抗原的扩散速度比带有自身跨膜结构域的MUC1糖肽快五倍。本研究揭示了糖蛋白的内在无序区域与CAR-T细胞相互作用的复杂机制。针对CAR-T细胞和B细胞的mRNA疫苗的联合使用，或可进一步研究以协同细胞免疫和体液免疫。
针对实体瘤治疗面临的巨大挑战，研究人员聚焦于肿瘤相关糖抗原（如MUC1）的异常糖基化特征，探讨了mRNA疫苗编码策略对嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫原性的影响。该研究发表在《European Journal of Cell Biology》。研究背景在于，虽然mRNA疫苗在抗病毒和血液肿瘤中表现出色，但其在实体瘤中对糖蛋白（如MUC1）的免疫原性机制尚不明确，且传统多价串联重复（TR）设计往往面临免疫耐受和空间位阻的限制。为此，研究人员设计了五种不同构象的MUC1 mRNA编码抗原，旨在阐明抗原呈递方式、分子流动性与CAR-T细胞激活效率之间的关系。研究结果表明，抗原的膜锚定方式和空间排列是调控CAR-T活性的关键因素。具体而言，采用糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定并呈现单重复（1TR）平行柱状结构的抗原，相比跨膜结构域固定的抗原或多重复串联结构，能显著增强CAR-T细胞的干扰素-γ（IFN-γ）分泌和细胞增殖。这一发现揭示了通过优化mRNA编码抗原的生物物理特性来克服实体瘤免疫抑制微环境的新策略。
在关键技术方法方面，研究人员首先设计并合成了编码不同MUC1变体（包括不同数量串联重复序列及GPI锚定融合蛋白）的mRNA，并将其包封于脂质纳米颗粒（LNP）中。随后，利用慢病毒系统构建了稳定表达16A单链可变片段（scFv）的CAR-T细胞。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术检测CAR-T细胞的活化标志物IFN-γ。利用总内反射荧光显微镜（TIRFM）结合单分子追踪技术，量化分析了不同膜锚定方式下MUC1抗原的二维扩散系数。此外，还通过糖苷酶消化和Western blot验证了mRNA编码糖蛋白的糖基化模式。
研究结果部分显示：
在“2.1. MUC1 epitopes encoded by mRNA are efficiently expressed with aberrant glycosylation pattern”中，研究人员通过流式细胞术发现mRNA编码的MUC1在293T细胞中呈现两种糖基化表型（16A-high和16A-medium），证实了mRNA平台能有效表达具有异常糖基化特征的肿瘤抗原。
在“2.2. MUC1 epitope presented on glycosylphosphatidylinositol anchor showed greater stimulation of chimeric antigen receptor T cells”中，ELISA和细胞成像结果显示，与携带自身跨膜结构域的MUC1相比，GPI锚定的MUC1(1TR)对CAR-T细胞的刺激作用增强了五倍以上，且伴随更强的细胞聚集和增殖。
在“2.3. MUC1 epitope presented as parallel lipid-carried epitope pillars increased stimulation of chimeric antigen receptor T cells”中，比较研究发现，包含五个串联重复的MUC1(5TR)-CD24对CAR-T的刺激作用反而比单重复的MUC1(1TR)-CD24降低了三倍以上，表明平行排列的单表位优于串联重复结构。
在“2.4. MUC1 epitope presented on glycosylphosphatidylinositol anchor diffuse much faster”中，TIRFM单分子追踪数据显示，GPI锚定的MUC1抗原（0.26 μm2/s）比跨膜结构域固定的抗原（0.03 μm2/s）具有更快的膜扩散速率，揭示了分子流动性与免疫刺激效能的正相关性。
讨论部分总结指出，该研究提出了三种不同的CAR-T细胞与抗原结合模式。GPI锚定的“表位柱”（epitope pillars）因其位于脂筏微区，具有最佳的二维移动性和约10-20 nm的理想间距，促进了免疫突触的形成和激酶的隔离，从而触发最强的信号传导。相反，跨膜蛋白固定的抗原受限于刚性螺旋的空间约束，而多重复串联结构则因熵塌缩导致内部表位掩埋，阻碍了CAR的有效聚类。
结论部分归纳了三个具有转化意义的设计原则：第一，GPI锚定融合作为一种模块化策略可普遍提升抗原流动性；第二，单重复平行表位展示优于串联重复，挑战了单纯增加表位数量即能增强免疫的传统假设；第三，脂筏定位优化了免疫突触的生物物理界面。这些原则为下一代针对实体瘤的mRNA-LNP疫苗工程提供了理性设计的框架。
