基于结构的设计与合成A组链球菌素：这类化合物能够结合到核糖体中新合肽分子的出口通道上

《European Journal of Medical Genetics》：Structure-based design and synthesis of group A streptogramins that bind to the nascent peptide exit tunnel of the ribosome

　　

伊莎贝尔·J·李（Isabel J. Lee）|齐莉（Qi Li）|图沙尔·拉斯卡尔（Tushar Raskar）|詹娜·佩莱格里诺（Jenna Pellegrino）|安德鲁·K·埃克（Andrew K. Ecker）|萨拉·Y·霍华德（Sara Y. Howard）|詹姆斯·S·弗雷泽（James S. Fraser）|伊恩·B·塞普尔（Ian B. Seiple）

美国加利福尼亚大学旧金山分校心血管研究所药物化学系，加利福尼亚州旧金山94158

摘要

天然产物及其衍生物长期以来一直是治疗细菌感染的强大工具，但抗生素耐药性的出现威胁到了它们的持续有效性。对现有抗生素类别进行有针对性的结构修饰是克服耐药性并延长临床应用的有效策略。开发出能够克服乙酰转移酶耐药性的A组链霉菌素就是这一策略成功实施的例子。然而，合成化学在C4位点的修饰方面存在局限性，而C4正是迄今为止产生最强效链霉菌素的关键修饰位点。在这里，我们报告了一种改进的A组链霉菌素合成方法，该方法能够在C4位置引入多种功能性基团。利用冷冻电镜（cryo-EM）数据指导结构修饰，我们合成了一系列C4位点经过修饰的A组链霉菌素，这些化合物的侧链被设计为能与核糖体的出口通道发生结合。我们发现了几种对多重耐药细菌有效的类似物，包括对大环内酯类、β-内酰胺类、万古霉素以及第一代链霉菌素都具有耐药性的菌株。通过解析这些类似物与细菌核糖体的结合结构，我们揭示了C4侧链与非典型U1782-U2586碱基对之间的π-堆叠相互作用。这些发现表明，基于结构的药物设计能够推动下一代抗生素的研发，并提升链霉菌素类的治疗潜力。

引言

链霉菌素类抗生素由链霉菌属（Streptomyces）产生，分为两类：23个原子的环状大分子（A组链霉菌素）和17个原子的环状肽（B组链霉菌素）。¹天然链霉菌素的溶解度较低，因此难以制成适用于静脉注射的制剂。20世纪90年代，耐万古霉素的肠球菌（VREfm）感染病例不断增加，而A/B组链霉菌素的卓越疗效促使了针对这些分子优化以用于临床的研究。达福普利辛/奎努普利辛（Synercid?）是一种由罗纳-普朗克公司（Rh?ne-Poulenc）开发的含三级胺的链霉菌素组合，于1999年获得FDA批准，用于治疗VREfm引起的菌血症以及由金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌引起的复杂皮肤和皮肤结构感染。34尽管效果显著，但常见的副作用如静脉刺激和特定菌株的耐药性限制了其应用范围，使其仅适用于氧化唑酮类或脂肽类药物不可行的情况。5首个可口服的链霉菌素组合——氟普利辛-利诺普利辛（flopristin-linopristin，NXL 103）在2011年的二期临床试验中表现出更好的疗效，但由于公司更迭和经济因素，后续未能进一步推进。1

链霉菌素通过结合细菌核糖体中的特定位点来抑制蛋白质合成：A组链霉菌素结合肽基转移酶中心（PTC），从而阻止肽键的形成；B组链霉菌素则结合相邻的新生肽出口通道（NPET），阻碍多肽的延伸和释放。⁶值得注意的是，A组链霉菌素首先与PTC结合，这会导致NPET发生结构重排，从而利于B组链霉菌素的结合。¹⁷单独使用时，两组链霉菌素均为抑菌剂；然而联合使用时，它们会表现出协同作用，对某些菌株具有杀菌效果。¹这种协同作用至少部分归因于它们的协同结合机制，尽管这可能无法完全解释某些菌株中的显著协同效应。⁷

日益严重的抗生素耐药性使得许多抗生素（包括链霉菌素）的效果减弱。A组链霉菌素的主要耐药机制之一是它们被维吉尼亚霉素O-乙酰转移酶（Vat）酶失活，该酶会乙酰化C18位点的醇基，破坏其与核糖体RNA在G2505处的氢键相互作用，从而降低其结合能力。⁸基于对Vat耐药性的结构认识以及A组链霉菌素的模块化合成平台，我们基于天然产物维吉尼亚霉素M2（VM2）合成了一系列类似物。9其中两种化合物（SA1和SA2，见图1）含有氟原子（与氟普利辛4中的氟原子相同），对多种具有不同耐药性的细菌表现出强效活性，包括那些对Vat耐药的菌株。10

对SA1和VS1与大肠杆菌核糖体结合的冷冻电镜结构分析显示，SA1的C4位烯丙基侧链朝向VS1，几乎达到范德华距离（3.7 ?，见图2A）。NPET的这一区域也是芳香族聚酮类抗生素四环素X（2）的结合位点，后者通过π-堆叠与非典型的U1782-U2586碱基对相互作用。10我们假设，在A组链霉菌素的C4位置引入合适位置的芳基（或联芳基）基团可以实现与U1782-U2586的π-堆叠，类似于四环素在该区域的结合方式。类似策略也应用于酮内酯类抗生素（如泰利霉素和索利霉素），其中添加含芳基的侧链有助于与A752-U2609碱基对之间的π-堆叠相互作用，从而显著增强抗菌效果（见补充信息S1）。¹¹¹²

由于进一步扩展C4位会阻碍B组链霉菌素的结合，这种方法实际上会将A+B组链霉菌素组合替换为单一的、结构经过改良的A组链霉菌素。虽然这样会丧失协同作用，但它具有避免B组链霉菌素耐药机制的优势。例如，这种改良不会受到Erm介导的A2058甲基化（导致对大环内酯类、林可酰胺类和B组链霉菌素如VS1（MLS_B表型）的耐药性）的影响，也不会受到A2058和A2059突变的影响。¹³此外，C4位修饰的A组链霉菌素不会成为Vgb裂解酶的底物，后者会通过环断裂使B组链霉菌素失活。¹⁴因此，这种方法可以完全规避针对A+B组链霉菌素组合中B组成分的多种耐药机制。尽管存在这些潜在优势，但目前尚不清楚具有扩展结合位点的A组链霉菌素是否能达到与A+B组链霉菌素组合相同的效力。本文报告了两组初步设计的类似物，以验证这一方法的有效性。

章节摘录

酰胺连接子的合成

我们之前合成的A组链霉菌素通常是将多个构建块组装成复杂度大致相等的两个部分，然后将其偶联、环化并脱保护以获得最终化合物。^9151617原则上，每个构建块都可以进行变化，从而在最终产品中实现功能模块化替换。然而，在实际操作中，这种合成方法并不总是适用于含有其他功能基团的情况。

结论

通过结合基于结构的药物设计、模块化化学合成、抗菌性能评估和高分辨率冷冻电镜技术，我们开发出了一类新的A组链霉菌素。在C4位引入含芳基三唑基团的侧链后，这些化合物在核糖体出口通道内产生了额外的结合位点。早期设计使用了含酰胺的连接子来引入侧链，但抗菌活性较低。随后我们利用TPSA技术重新设计了这些类似物。

CRediT作者贡献声明

詹娜·佩莱格里诺（Jenna Pellegrino）：撰写、审稿与编辑、可视化、方法学研究、数据分析与整理。图沙尔·拉斯卡尔（Tushar Raskar）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据分析与整理。齐莉（Qi Li）：撰写、审稿与编辑、方法学研究、数据分析与整理、概念构思。伊莎贝尔·J·李（Isabel J Lee）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学研究、数据分析与整理。

数据可用性声明

所有数据均可见于正文、支持信息文件以及EMDB和PDB数据库中。

J.S.F是Relay Therapeutics的顾问及股东，并从该公司获得研究资助；同时还是Interdict Bio的创始人和股东。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务关系和个人关联：伊恩·B·塞普尔（Ian B Seiple）表示获得了国家通用医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）的财务支持；詹姆斯·S·弗雷泽（James S Fraser）表示与Interdict Bio存在董事会成员关系，并从该公司获得财务支持；同时与Relay Therapeutics存在关联。

致谢

本项工作得到了NIH GM148184项目的支持。J.S.F还获得了NIH GM145238项目的支持。UCSF的冷冻电镜设备部分资金来自NIH的项目编号S10OD020054、S10OD021741和S10OD026881，以及University of的QB3质谱实验室的Z. Zhou在实验中的协助。