《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Identification of Small-Molecule Autophagy Activators via GFP-LC3 High-Throughput Screening and a Cargo-Based Autophagy Flux and Processing Assay
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弗雷克·梅尔滕斯（Freke Mertens）|法尔纳兹·塞迪盖赫·塔赫沙（Farnaz Sedigheh Takhsha）|梅丽莎·拉利尔（Mélissa Lallier）|尼古拉伊·恩格达尔（Nikolai Engedal）|维拉·古森斯（Vera Goossens）|多米尼
弗雷克·梅尔滕斯（Freke Mertens）|法尔纳兹·塞迪盖赫·塔赫沙（Farnaz Sedigheh Takhsha）|梅丽莎·拉利尔（Mélissa Lallier）|尼古拉伊·恩格达尔（Nikolai Engedal）|维拉·古森斯（Vera Goossens）|多米尼克·奥德纳特（Dominique Audenaert）|皮特-扬·冈斯（Pieter-Jan Guns）|林恩·罗斯（Lynn Roth）|彼得·范德阿贝勒（Peter Vandenabeele）|埃里克·弗兰森（Erik Fransen）|塞西尔·温迪斯（Cécile Vindis）|皮特·范德弗肯（Pieter Van der Veken）|文森特·蒂默曼（Vincent Timmerman）|吉多·R.Y. 德迈耶（Guido R.Y. De Meyer）|维姆·马蒂内特（Wim Martinet）
安特卫普大学生理药理学实验室，比利时安特卫普
摘要
背景与目的
自噬通过回收大分子和营养物质来维持细胞稳态。它涉及将多余的或受损的细胞成分隔离到自噬体中，这些自噬体随后与溶酶体融合进行降解。自噬功能减弱与多种疾病有关，而这些疾病可能通过诱导自噬的药物得到治疗。然而，大多数临床可用的一种诱导剂是通过抑制mTORC1来起作用的，这导致了副作用，限制了它们的治疗应用。本研究旨在识别新的、不依赖mTORC1起作用的自噬诱导化合物，从而具有更大的转化潜力。
方法
优化了一种高通量成像检测方法，用于量化表达GFP-LC3（一种荧光自噬体膜标记物）的L929成纤维细胞中的自噬体样结构。在表达LDHB-mKeima自噬体 cargo 报告基因的视网膜上皮hTERT RPE-1细胞中，这些候选化合物与几种参考自噬调节剂进行了验证。该方法能够区分真正的自噬诱导剂和仅仅通过阻断晚期自噬而增加自噬体积累的化合物。Western blotting被用来研究自噬启动的机制。
结果
高通量筛选发现了30种能够使自噬体样结构数量增加四倍以上的化合物。其中10种化合物被证实可以诱导细胞内的自噬过程。其中9种化合物不依赖于mTORC1发挥作用，且其诱导自噬的效果与mTORC1抑制剂雷帕霉素（rapamycin）相当。
结论
虽然基于GFP-LC3的检测方法实现了高效的高通量筛选，但结合使用LDHB-mKeima cargo 报告基因的检测方法对于识别真正的自噬诱导剂至关重要。研究中发现了9种通过不依赖mTORC1的机制促进自噬过程的化合物，这些化合物为发现新的分子靶点以及开发更安全、更有效的基于自噬的干预措施以治疗人类疾病提供了有希望的线索。
引言
巨自噬（以下简称自噬）是一种进化上保守的生理过程，它通过将不需要的或功能异常的细胞成分在溶酶体内降解来维持细胞内稳态（Shatz和Elazar，2024年）。研究表明，刺激自噬可以延长无脊椎动物和哺乳动物的寿命（Hansen等人，2018年）。此外，由于自噬功能减弱是多种疾病的特征，越来越多的临床前证据表明，诱导自噬是一种有吸引力的治疗手段，可以（1）预防疾病的发生，（2）延缓疾病进展，（3）减轻从心血管疾病到神经退行性疾病和某些癌症等多种疾病的严重程度（Klionsky等人，2021b年）。然而，自噬在疾病中的作用高度依赖于具体背景。虽然在某些情况下自噬能够保持基因组稳定性，但已建立的癌细胞可能会利用这一途径来抵御代谢压力和治疗效果（Jalali等人，2025年）。这种双重性突显了需要精确策略的必要性，既要利用诱导剂也要利用抑制剂，以充分发挥自噬调节的治疗潜力。然而，由于缺乏可靠的、能够在体内有效诱导自噬的化合物，进展受到了阻碍。雷帕霉素及其衍生物（rapalogs）是已知最有效的自噬诱导剂，它们通过抑制哺乳动物靶蛋白mTOR来发挥作用。尽管在多种模型系统中表现出效力，但临床试验的结果并不理想（Lee等人，2024年）。鉴于mTOR调控信号通路的复杂性，mTOR抑制剂引发的副作用多种多样，虽然多数为轻度，但有时也会非常严重甚至导致功能障碍。潜在的副作用包括血脂异常、高血糖、抗增殖毒性、肾功能障碍、感染和肺部疾病（Nguyen等人，2019年；Pallet和Legendre，2013年）。这凸显了迫切需要开发能够在体内独立于mTOR来诱导自噬的化合物。正如该领域的多篇综述所指出的（Galluzzi等人，2017年；Kim等人，2020年）。
为了识别新的自噬诱导化合物，我们开发了一种基于图像的高通量筛选方法，该方法监测L929成纤维细胞中与绿色荧光蛋白（GFP）融合的自噬体标记物LC3。通过定量细胞质中的GFP-LC3阳性结构，快速且可重复地识别出能够促进自噬体样结构积累的小分子。由于自噬体数量的增加也可能反映了溶酶体融合受损而非自噬过程增强，因此还引入了乳酸脱氢酶B（LDHB）-mKeima检测方法（Engedal等人，2022年）。这种方法利用mKeima的pH依赖性荧光以及LDHB这种稳定胞质蛋白的自噬特异性降解，来量化自噬体向酸性及蛋白水解活性区域的货物运输。最后，对新发现的自噬诱导剂进行了细胞毒性评估，并研究了它们对能量传感器mTORC1和AMPK的影响，这两种因子都参与了自噬的启动。虽然mTORC1的抑制通常因对细胞生长途径的广泛影响而不被看好，但AMPK的激活提供了一种更具前景的治疗途径。通过将代谢从合成代谢转向分解代谢，AMPK成为治疗肥胖症和2型糖尿病等代谢性疾病的有希望的治疗靶点（Steinberg和Carling，2019年）。本研究鉴定并表征了几种具有独立于mTOR机制的自噬诱导小分子，为发现新的治疗靶点和开发更安全、更有效的自噬基础干预措施提供了依据。
章节摘录
基于图像的高通量筛选
在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养稳定表达GFP-LC3的小鼠L929纤维肉瘤细胞（RRID: CVCL_0462），培养基中添加了10%的胎牛血清（FBS），并在含5% CO?的湿润环境中于37°C下培养。进行高通量筛选（HTS）时，将细胞悬浮在不含酚红的DMEM中，每孔接种2000个细胞（95 μL），使用多滴加器（Thermo Scientific）接种到384孔微孔板（PhenoPlate 384-well microplates）中，然后进行孵育
通过基于图像的高通量筛选识别能够增加自噬体样结构的小分子
为了发现新的自噬诱导药物，将表达GFP-LC3的L929成纤维细胞与来自Pharmacological Diversity文库的10,240种化合物（浓度为10 μM）共培养24小时。通过测量每个细胞在单个Z平面上的GFP荧光，评估了两个参数：含有超过5个GFP-LC3结构的细胞比例以及每个细胞中的平均GFP-LC3结构数量（包括不含GFP-LC3结构的细胞）。
讨论与结论
本研究首先在L929小鼠成纤维细胞中使用了基于GFP-LC3的检测方法。筛选出了30种能够使GFP-LC3结构数量增加四倍以上的化合物。为了验证这些化合物是否真的能诱导自噬过程，进行了LDHB-mKeima检测。这种方法克服了基于LC3的探针的几个局限性。实际上，动力学实验表明，自噬诱导化合物最初可能会增加自噬体标记物LC3-II的水平，随后
CRediT作者贡献声明
林恩·罗斯（Lynn Roth）：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。多米尼克·奥德纳特（Dominique Audenaert）：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，数据分析，数据整理。皮特-扬·冈斯（Pieter-Jan Guns）：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。维姆·马蒂内特（Wim Martinet）：撰写 – 审稿与编辑，监督，方法学研究，资金获取，概念构思。尼古拉伊·恩格达尔（Nikolai Engedal）：撰写 – 审稿与编辑，监督，方法学研究，资金获取，概念构思。维拉·古森斯（Vera Goossens）：
利益冲突
作者声明与本文内容无关的任何行业利益关系。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有任何可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了安特卫普大学（）、BOF SEP（项目编号：41477，iBOF项目编号：21-053，GOA项目编号：41667）、INSERM国际研究项目（SUBSIDI）、弗兰德斯科学研究基金（FWO项目编号：G040821N、G014525N）以及挪威东南部地区卫生局（项目编号：2021088、2024072）的支持。FM是FWO-弗兰德斯的博士研究员（资助编号：N°1SH1824N）。作者感谢Bronwen Martin博士对手稿的细致审阅。图中包含的图解由她提供。
