《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：SAHA induces immunogenic cell death in triple negative breast cancer cells and its efficacy is enhanced by SOCS3 functional replacement.
编辑推荐：
朱利亚诺·卡斯特拉诺（Giuliano Castellano）|坎迪达·布奇耶罗（Candida Bucciero）|亚历西亚·库古达（Alessia Cugudda）|萨拉·拉·曼纳（Sara La Manna）|丹妮拉·马拉斯科（Daniela Marasco）|朱塞佩·波泰
朱利亚诺·卡斯特拉诺（Giuliano Castellano）|坎迪达·布奇耶罗（Candida Bucciero）|亚历西亚·库古达（Alessia Cugudda）|萨拉·拉·曼纳（Sara La Manna）|丹妮拉·马拉斯科（Daniela Marasco）|朱塞佩·波泰拉（Giuseppe Portella）|安娜·玛丽亚·马尔菲塔诺（Anna Maria Malfitano）
那不勒斯费德里科二世大学转化医学科学系，意大利那不勒斯 80131
摘要
三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer, TNBC）是一种侵袭性较强的亚型，预后较差，治疗选择有限。表观遗传变化促进了TNBC的肿瘤发生，组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylases, HDACs）已被证明是具有前景的治疗方法。然而，它们作为单一疗法在实体瘤中的疗效仍有限。最新研究强调了它们的免疫调节潜力，这支持了联合策略的发展。
我们研究了HDAC抑制剂苏罗伊兰尼利德羟胺（Sahairolanilide Hydroxamic Acid, SAHA）对细胞活力和免疫原性细胞死亡（Immune Genic Cell Death, ICD）的影响，以及其与SOCS3肽模拟物（KIRCONG chim PEG）联合使用的效果。KIRCONG chim PEG旨在抑制STAT3的磷酸化（pSTAT3）。
SAHA降低了TNBC细胞的活力，在其IC25剂量下，诱导了MDA-MB-231细胞中的ICD特征，包括ATP释放、钙网蛋白表面暴露和HMGB1水平升高，同时促进了IL-6的分泌。相比之下，MDA-MB-468细胞在相同条件下的ICD特征较为有限。未经处理的MDA-MB-231细胞中观察到的较高IL-6分泌与较低的SOCS3表达水平相关。
鉴于IL-6/JAK/STAT3信号通路在限制HDAC抑制剂疗效中的潜在作用，我们将SAHA与SOCS3肽模拟物KIRCONG chim PEG联合使用。在MDA-MB-231细胞中，联合治疗降低了pSTAT3水平并增加了BAK表达。此外，该组合降低了SAHA的IC25剂量，表明对这些亚毒性浓度更加敏感。联合处理的MDA-MB-231细胞产生的条件培养基促进了CD4+T细胞的活化，表现为HLA-DR和CD69表达的增加。
总体而言，这些发现表明SOCS3的功能替代增强了SAHA在IL-6高表达的TNBC细胞中的抗癌和免疫原性效应，支持了一种针对IL-6/STAT3轴的依情境依赖的联合策略。
引言
三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer, TNBC）是一种高度转移性的乳腺癌亚型，其特征是缺乏雌激素受体（Estrogen Receptor, ER）、孕酮受体（Progesterone Receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2/neu或ERBB2）（Bianchini等人，2022年）。在表观遗传修饰中，组蛋白的乙酰化和去乙酰化在TNBC的进展中起着关键作用。组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylases, HDACs）通过去乙酰化组蛋白（H3和H4）和非组蛋白蛋白（如p53、Hsp90、PTEN和微管蛋白）来促进染色质凝聚和转录重编程。作为Zn2+或NAD+依赖的酶，HDACs促进了异常细胞增殖，从而有利于TNBC的侵袭、干性、血管生成和转移到其他部位（Nimal等人，2024年）。
在这一背景下，HDAC抑制剂（Histone Deacetylase Inhibitors, HDACi）作为有前景的治疗药物出现，能够逆转与癌症相关的表观遗传异常（Bolden等人，2013年；G?ttlicher等人，2001年）。HDACi的表观遗传疗法显示出免疫调节作用（Medon等人，2017年），包括增强自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞的细胞毒性（Shen等人，2017年）、增加HER2+乳腺癌细胞中对Trastuzumab的吞噬作用（Laengle等人，2020年）以及改善T细胞在体外对TNBC细胞的裂解作用（Gameiro等人，2016年）。迄今为止，几种HDACi已获得FDA的癌症治疗批准（He等人，2001年），其中包括苏罗伊兰尼利德羟胺（SAHA），这是一种I类和II类HDAC抑制剂，被批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（Mann等人，2007年）。
尽管HDACi在血液系统恶性肿瘤中显示出疗效，但在包括乳腺癌、肾癌和前列腺癌在内的实体瘤中，作为单一疗法的效果有限（Kelly等人，2005年；Giannini等人，2012年）。因此，针对互补途径的联合疗法越来越受到关注。在TNBC模型中，SAHA与免疫检查点抑制剂（Terranova-Barberio等人，2017年）、白血病抑制因子受体（Leukemia Inhibitory Factor Receptor, LIFRα）抑制剂EC359（Li等人，2021年）或G-四链稳定剂（Jiang等人，2022年）联合使用，显示出增强的抗癌活性。其他组合，包括SAHA与埃立布林（Eribulin，Oba等人，2021年）、奥拉帕利布（Olaparib，Min等人，2015年）、赖氨酸特异性去甲基化酶1（Lysine-Specific Demethylase 1, LSD1）抑制剂帕吉林（Pargyline，Vasilatos等人，2013年）或芹菜素（Apigenin，Nimal等人，2024年）联合使用，也进一步提高了治疗效果。此外，研究还表明SAHA通过减少肺部转移增强了TNBC人类和小鼠细胞的放射敏感性（Chiu等人，2013年）。
新的证据表明，持续的STAT3激活可能限制HDAC抑制剂在实体瘤中的疗效。像Roxyl-zhc-84这样的混合分子结合了HDACs和周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-Dependent Kinases, CDKs）的药理活性元素，已被证明可以克服JAK1-STAT3-BCL2介导的药物耐药性，增加TNBC细胞的凋亡（Huang等人，2018年）。类似地，双靶向JAK/HDAC抑制剂在TNBC模型中表现出强烈的抗增殖和促凋亡作用，通过抑制磷酸化的STAT3（pSTAT3）和下调LIFR-JAK-STAT信号通路（Liang等人，2022年）。细胞因子信号通路3（SOCS3）的抑制剂作为IL-6介导的JAK/STAT信号的内源性负调节因子。已经开发出SOCS3的肽模拟物来抑制癌症中的IL-6诱导的pSTAT3激活。值得注意的是，含有聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）部分的嵌合SOCS3肽模拟物KIRCONG chim PEG已被证明能够选择性穿透TNBC细胞并降低pSTAT3水平和转录活性（La Manna等人，2024年）。
在这项研究中，我们研究了SAHA在TNBC细胞中的效果，重点关注其诱导免疫原性细胞死亡（Immune Genic Cell Death, ICD）的能力，并评估了其与SOCS3肽模拟物KIRCONG chim PEG联合使用的抗癌潜力。
节选片段
细胞和药物
TNBC细胞（MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系）在Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM，GIBCO，Paisley，英国）中培养。DU4475细胞在Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI-1640，GIBCO，Paisley，英国）中培养。健康女性捐赠者的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）通过Lymphosep（AU-L0560-500，Aurogene）离心分离，并在RPMI-1640中培养。培养基中添加了2 mM L-谷氨酰胺和50 ng/mL的链霉素。
SAHA抑制TNBC细胞活力
评估了SAHA对TNBC细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和DU4475的细胞活力影响。使用逐渐增加的SAHA浓度（0.04-10 μM）进行的剂量-反应实验显示，经过72小时的处理后，三种细胞系的抑制效果相当（图1）。所有模型中的细胞活力均显著下降，其中MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞在较低浓度及IC25时就已经显示出明显的抑制作用。
讨论
近年来，已经开发出了许多HDAC抑制剂，其良好的抗癌效果支持它们进入临床试验（Mann等人，2007年）。尽管作为单一疗法时疗效有限，但据报道它们可以提高乳腺癌细胞对放疗和化疗的敏感性（Chiu等人，2013年），并与传统化疗药物联合使用时具有协同或叠加效果（Wawruszak等人，2015年）。
CRediT作者贡献声明
安娜·玛丽亚·马尔菲塔诺（Anna Maria Malfitano）：撰写、审稿与编辑、资金获取、概念构思。朱塞佩·波泰拉（Giuseppe Portella）：数据可视化、监督。丹妮拉·马拉斯科（Daniela Marasco）：数据验证、资金获取。萨拉·拉·曼纳（Sara La Manna）：方法学、数据管理。亚历西亚·库古达（Alessia Cugudda）：方法学、数据管理。坎迪达·布奇耶罗（Candida Bucciero）：方法学、数据管理。朱利亚诺·卡斯特拉诺（Giuliano Castellano）：方法学、数据管理
资金来源
本研究得到了以下机构的支持：PROGETTI DI RICERCA DI 国家重要研究项目（PRIN）000013_PRIN_2022_(Malfitano_A.M.)，代码20224JSC3M，以及意大利癌症研究协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro（AIRC）的资助，代码IG 2022，代码27378（Marasco D.）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢Leonardo Cristinziano博士提供的技术帮助。
