尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中C型凝集素（ONCLEC10A）的特性研究：作为一种具有抗菌特性的模式识别受体

《Fish & Shellfish Immunology》：Characterization of a C-type lectin (OnCLEC10A) in Oreochromis niloticus functioning as a pattern recognition receptor with antibacterial properties

　　

崔淼|郑高军|王世旭|梁静文|徐先纪|吴金辉|徐德林

中国广东省济南市济南大学生命科学技术学院水生生物学研究所生态学系，邮编510632

摘要

C型凝集素（CTLs）是一类依赖Ca²⁺的碳水化合物识别蛋白，参与病原体的识别和清除。在本研究中，从Oreochromis niloticus中鉴定出一种C型凝集素家族成员（暂命名为OnCLEC10A）并对其功能进行了分析。OnCLEC10A包含一个依赖Ca²⁺的碳水化合物识别结构域，该结构域具有保守的Gln-Pro-Asp（QPD）基序。重组的OnCLEC10A（rOnCLEC10A）蛋白对脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）以及包括Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii、Streptococcus agalactiae和Staphylococcus aureus在内的细菌表现出强烈的结合和凝集活性。S. agalactiae感染后，OnCLEC10A在血液、大脑、鳃、头部肾脏、心脏、肠道、肝脏和脾脏中的表达显著上调。此外，转染了pcDNA3.1⁺-OnCLEC10A的血液细胞对S. agalactiae的吞噬活性增强。OnCLEC10A的抑制作用显著提高了O. niloticus的存活率，并在细菌感染期间升高了炎症因子的表达水平。这些发现表明，OnCLEC10A通过介导病原体识别和促进抗菌免疫反应，在O. niloticus的宿主防御中起着重要作用。

引言

Oreochromis niloticus是重要的水产养殖物种之一，为人类提供了重要的蛋白质来源[1]。随着对鱼类需求的增长，工厂化养殖和高密度养殖方式在O. niloticus的生产中得到了广泛应用[2]。这种集约化养殖方式增加了传染病传播的风险[3],[4]。虽然药物预防和治疗方法有效，但可能会带来严重的环境负担[5]。因此，增强免疫系统功能以提高抗菌能力已成为水产养殖领域的一项新策略。在这种情况下，由于凝集素的稳定性和生物降解性，添加凝集素可能有助于预防细菌感染[6]。

C型凝集素（CTLs）属于凝集素家族，具有依赖Ca²⁺的碳水化合物识别结构域（CRD）。CTLs参与病原体识别、抗病毒防御、炎症调节以及先天性和适应性免疫反应的调控。CTLs具有保守的CRD结构，与其他凝集素类别不同[7]。CRD由大约110–140个氨基酸和两个保守的二硫键组成，形成双环结构[8]。Glu-Pro-Asn（EPN）和Gln-Pro-Asp（QPD）是CRD中的保守基序，负责碳水化合物的结合和特定糖类（如甘露糖和半乳糖）的识别[9]。这些基序通过羰基侧链与Ca²⁺离子形成配位键[10]。Ca²⁺离子维持了CTLs的结构完整性和碳水化合物结合功能[11]。EPN和QPD基序对于碳水化合物配体的识别及配体结合特异性至关重要。例如，大西洋鲑鱼的SCLRA和斑马鱼的ILLR1-3具有与QPD基序相似的结构[12],[13]。这些受体通过保守的QPD基序识别病原相关分子模式（PAMPs），从而直接触发促炎细胞因子的上调和抗菌反应基因的激活。

糖链是细菌细胞壁的重要组成部分，决定了细胞壁的功能[14]。细菌糖链作为PAMPs与模式识别受体（PRRs）相互作用[15]。作为PRRs的CRDs决定了细菌的结合能力[16]。CTLs以可溶性蛋白的形式分泌或嵌入细胞膜[17]。可溶性CTLs聚集形成花束状寡聚体，对微生物上的特定糖类具有很强的结合能力[18]。可溶性CTLs与糖链的相互作用会激活MBL相关丝氨酸蛋白酶（MASPs），进而激活补体系统的凝集素途径，最终导致细菌的裂解和吞噬[19]。另一方面，跨膜CTLs呈现在免疫细胞上，如树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞[20]。先天免疫细胞通过CTLs识别细菌病原体，并将微生物信号转化为免疫细胞的信号传导和激活事件[21]。CTLs诱导抗原呈递细胞内吞病原体、处理并呈递抗原[22]。处理后的抗原与共刺激信号共同作用，激活T细胞并启动特异性免疫反应[23]。

尽管已在多种鲤科鱼类中广泛鉴定并研究了CTLs的功能，但CLEC10同源物在O. niloticus中的具体致病体识别和免疫调节作用仍不完全清楚。特别是在它们的碳水化合物结合特异性、吞噬作用以及在疾病预防和治疗中的应用方面，现有信息有限。

因此，本研究旨在表征尼罗罗非鱼中的CLEC10同源物（OnCLEC10A），并系统地研究其生物学功能。具体而言，我们研究了其在细菌感染后的表达谱，评估了其对PAMPs和细菌的结合活性，探讨了其在吞噬作用中的作用，以及其对S. agalactiae的潜在预防和治疗效果。这些发现为了解鲤科鱼类的CLEC10A的免疫功能提供了新的见解，并有助于理解宿主对细菌感染的防御机制。

节选内容

实验动物、细胞系和细菌病原体

O. niloticus来自广东省罗非鱼养殖场，平均体重为50 ± 5克。鱼被随机分配到50升的玻璃水箱中，每箱30条鱼，循环系统中的水温维持在25 ± 2°C。经过两周的适应期后，这些鱼被用于后续实验。

在所有后续实验中，随机抽取尼罗罗非鱼样本以确保实验数据的可靠性。除非另有说明

OnCLEC10A的序列分析

获得了OnCLEC10A的完整mRNA序列（图1A）。OnCLEC10A的开放阅读框（ORF）长度为840 bp，编码279个氨基酸，预测分子量为32.18 kDa，理论等电点为6.75。该蛋白质的分子式为C₁₄₂₁H₂₁₈₁N₄₀₅O₄₂₆S₁₃。在C端区域鉴定出一个N端跨膜结构域（氨基酸33-50）。C端区域的CRD包含225个氨基酸。OnCLEC10A与来自其他物种的同源物具有6个保守的半胱氨酸残基和QPD基序

讨论

模式识别是激活先天免疫的关键步骤，是鲤科鱼类的重要防御机制[28]。CTLs与PAMPs的相互作用可以促进吞噬作用，激活补体系统，进而中和病原体[29]。在本研究中，从O. niloticus中鉴定并分析了OnCLEC10A的功能。OnCLEC10A与已知的CTLs在结构上高度相似，包含C端CRD、由半胱氨酸形成的环结构等特征

结论

本研究鉴定并表征了O. niloticus中的C型凝集素，并证明了其在病原体识别和抗菌免疫反应中的作用。OnCLEC10A具有依赖Ca²⁺的病原体识别能力，能够识别多种微生物病原体。在测试的组织中，细菌可以诱导OnCLEC10A的表达。此外，OnCLEC10A增强了血液细胞的吞噬活性

作者贡献

崔淼：概念提出、方法设计、资源提供、监督、写作 - 审稿与编辑。郑高军：形式分析、数据管理、初稿写作。王世旭、梁静文、徐先纪：验证、实验设计、数据可视化。吴金辉和徐德林：概念提出、写作 - 审稿与编辑、监督。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

作者声明没有已知的潜在利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

动物和人权声明

所有实验均遵循广东省实验动物管理条例的规定，并得到了中国济南大学伦理委员会的批准（批准号IACUC-20250515-01）。

致谢

本研究得到了广东省科技创新计划（KTP20240484、SQBW2024037）、国家自然科学基金（项目编号32271568）和广东省自然科学基金（项目编号2023A1515012806）的支持。