利用基于4D-DIA的蛋白质组学技术，揭示假单胞菌HNGD-T31通过将(+)-芳樟烯生物转化产生柑橘风味物质(+)-诺卡酮的分子机制

《Food Bioscience》：Unraveling the molecular mechanism of Citrus flavor (+)-nootkatone biotransformation from (+)-valencene by Pseudomonas sp. HNGD-T31 via 4D-DIA based proteomics

　　

肖莉|张梦菊|刘一卓|李凯|文一?|谢艳丽|杨金初|冯迎杰|杨峰|徐永明|黄振振

河南省工业大学小麦与玉米深加工国家工程技术研究中心，郑州 450001，中国

摘要：

倍半萜类天然产物(+)-诺卡酮在制药、化妆品、农业和食品工业等多个领域得到广泛应用。本研究旨在阐明Pseudomonas sp. HNGD-T31菌株将(+)-缬烯生物转化为(+)-诺卡酮的分子机制。通过高通量LC-MS/MS和4D-DIA定量蛋白质组学技术分析了差异表达蛋白（DEPs）。蛋白质组学分析共鉴定出129个DEPs，其中48个上调，81个下调。在25%振幅、1:15的固液比例下，使用超声波处理15分钟时酶活性最高。进一步研究表明，负责将(+)-缬烯转化为(+)-诺卡酮的关键酶主要位于细胞内部，并且可以通过40-60%的硫酸铵沉淀出来。功能富集分析显示，与氨基酸代谢和ABC转运蛋白相关的DEPs显著上调；而参与能量代谢、脂肪酸代谢和碳水化合物代谢的DEPs则显著下调。此外，参与(+)-缬烯转化的关键酶可能与细胞色素P450（I7AXI1）和漆酶（I7C802）有关。Pseudomonas sp. HNGD-T31的蛋白质组学研究为(+)-缬烯向(+)-诺卡酮的生物转化机制提供了新的见解。

引言

萜类化合物是自然界中最丰富的天然化合物，其多样的结构和广泛的生物活性使其在食品、制药、化工以及新兴的生物燃料行业得到广泛应用（Zhang, Wu等，2023）。萜类化合物根据C₅半萜前体的化学计量关系进行分类，包括单萜（C₁₀）、倍半萜（C₁₅）、二萜（C₂₀）、三萜（C₃₀）和四萜（C₄₀）（Wang, Zhang等，2021）。目前已鉴定出超过80,000种萜类化合物及其衍生物。直接从天然来源提取和分离萜类化合物通常效率低下、技术要求高且对环境不友好（Liu等，2022）。此外，许多萜类化合物复杂的结构和多个手性中心给合成带来了挑战，限制了传统化学合成方法的应用（Zhang, Ma等，2023）。

倍半萜(+)-诺卡酮（C₁₅H₂₂O）具有类似葡萄柚的香气，并具有杀虫、抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤等药理活性（Huang等，2025；Ye等，2022）。(+)-诺卡酮可从阿拉斯加雪松、柑橘（芸香科）果实（如葡萄柚）、香根草（Vetiveria属）和高良姜（姜科）等植物中分离得到（Fan等，2022）。尽管在食品和香水行业中作为类似葡萄柚的香料需求很高，但从Citrus grandisis中天然获得的(+)-诺卡酮产量极低，这严重限制了其商业应用的可持续性（Deng等，2024）。因此，在消费者对天然产品需求的推动下，(+)-诺卡酮的生产已从传统的植物提取和化学合成转向基于生物合成的方法（Ma等，2023）。微生物转化和合成生物学为生产(+)-诺卡酮提供了可持续且经济可行的替代方案（Zhang, Chen等，2023）。根据美国食品药品监督管理局和欧盟的相关法规，如果生物转化过程中的底物来自自然，所得产品也可被视为天然产品（Xu等，2007）。

尽管已有多种微生物被用于(+)-缬烯的生物转化研究，但仍存在显著局限。虽然对Penicillium digitatum和Yarrowia lipolytica等真菌和酵母的研究提供了基础性见解，但这些真核系统的生长速度较慢，且培养要求更为复杂（Li, An等，2022；Zhang等，2016）。相比之下，Pseudomonas菌株具有显著优势，表现在对多种理化和营养条件的强适应性、对内源性和外源性压力的高耐受性以及合成生物活性化合物的能力（Sun等，2020）。特别是新分离的Pseudomonas sp. HNGD-T31在转化(+)-缬烯为(+)-诺卡酮方面表现出色，使其成为工业生物催化的有希望的候选菌株。然而，这一高效生物转化过程中涉及的分子机制，尤其是能量代谢和调控网络，在该细菌属中尚未得到充分研究。

目前，蛋白质组学已成为探索微生物变化相关生物学机制的流行工具（Ahmad等，2022）。蛋白质组学以生物体内的所有蛋白质为研究对象，能够提供关于蛋白质组成和功能的信息，从而系统地研究蛋白质的变化、代谢和相互作用（Shi等，2024）。以往关于萜类化合物生物转化的蛋白质组学研究依赖于较旧的技术，例如在Penicillium中使用的同位素标签相对和绝对定量（iTRAQ）基于的定量蛋白质组学（Zhang等，2016），或在Y. lipolytica中使用的串联质量标签（TMT）基于的策略（Li, An等，2022）。这些基于标签的方法在定量准确性和动态范围方面存在局限性。为克服这些限制，出现了四维数据独立采集（4D-DIA）定量蛋白质组学技术，该方法在肽覆盖范围、分析效率、质量准确性和重复可靠性方面优于传统的iTRAQ/TMT和无标签方法（Nie等，2025）。

本研究采用4D-DIA定量蛋白质组学技术，全面揭示了Pseudomonas sp. HNGD-T31中(+)-缬烯生物转化的差异蛋白表达和代谢途径。通过结合超声波辅助提取和硫酸铵沉淀的酶学分析，阐明了促进高效底物转化的具体代谢网络，特别是能量代谢和转运系统。该研究为理解(+)-缬烯生物转化的分子机制提供了系统基础，并为Pseudomonas菌株的天然产物生物合成代谢工程提供了宝贵见解。

节摘

材料与菌株

Pseudomonas sp. HNGD-T31（CCTCCM 20251583）是从中国长沙的Citrus reticulata区域土壤中分离得到的。该菌株在Luria-Bertani（LB）培养基上培养，生物转化所用的培养基包含葡萄糖、蛋白胨和硫酸亚铁。(+)-缬烯（≥ 65.0%，Sigma-Aldrich）和(+)-诺卡酮（≥ 97.0%，TCI）分别作为底物和分析标准品。葡萄糖和蛋白胨由北京Aoboxing Bio-Tech有限公司提供。硫酸铵...

Pseudomonas sp. HNGD-T31的蛋白质信息

从未经(+)-缬烯处理（对照组）和经过(+)-缬烯处理（实验组）的Pseudomonas sp. HNGD-T31中制备蛋白质样本。对照组（P_48h_1-3）的三个生物学重复样本的蛋白质浓度范围为4.805至8.096 μg/μL，而经过48小时生物转化后的实验组（P_V_48h_1-3）的蛋白质浓度范围为5.529至6.723 μg/μL（表1）。提取蛋白质的完整性和均一性通过SDS-PAGE进行了验证（图1A）...

与(+)-缬烯生物转化相关的能量代谢DEPs

能量代谢对于维持Pseudomonas sp. HNGD-T31中的生理活动和驱动(+)-缬烯的生物转化至关重要。在氧化磷酸化（OXPHOS）过程中，质子泵由电子传递链中的NADH氧化驱动，从而建立电化学梯度，ATP合成酶利用该梯度生成ATP。尽管OXPHOS是主要的ATP生成过程，但关键组成蛋白（I7B4J3、I7B4I9、I7B5K4、I7AVC3、I7B5J3、I7C007）的下调...

结论

本研究利用4D-DIA蛋白质组学技术研究了Pseudomonas sp. HNGD-T31中(+)-缬烯向(+)-诺卡酮的生物转化机制。蛋白质组学分析表明，Pseudomonas sp. HNGD-T31中有129个不同的蛋白质发生变化，其中48个上调，81个下调。这些DEPs主要参与能量代谢、ABC转运蛋白、脂肪酸代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢。

CRediT作者贡献声明

黄振振：写作 – 审稿与编辑，概念构思。徐永明：研究，概念构思。杨峰：项目管理，概念构思。冯迎杰：写作 – 审稿与编辑，监督。杨金初：写作 – 审稿与编辑，监督。谢艳丽：写作 – 审稿与编辑，研究。文一?：写作 – 审稿与编辑，方法学研究。李凯：写作 – 审稿与编辑，方法学研究。刘一卓：写作 – 审稿与编辑，研究。张梦菊：

Li等，2022；Wang等，2021；Zhang等，2023；Zhang等，2023。

数据可用性声明

原始蛋白质组学质谱数据可在Proteome Xchange Consortium的PRIDE数据库中找到，数据集标识符为PXD068761。

作者声明没有可能影响本文报告工作的已知财务利益或个人关系。

作者声明没有可能影响本文报告工作的已知财务利益或个人关系。

本研究得到了中国博士后科学基金会（2025M772982）、河南省自然科学基金（252300420655）、河南省科技研发计划联合基金（252301420045）、河南省高校关键科研项目（26A550003）、河南省科技研究项目（262102110085）、以及国家小麦与玉米深加工研究中心的开放性项目的支持。