《Gene》：Single cell RNA sequencing revealed the mechanism underlying the increased osteogenic capacity of porcine BMSCs upon MSTN knockout
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张松岭|朱玲|钟志宁|张宇|李子琪|陈秋月|王迅|姜安娜|周迅|孔凡丽|张金伟|孙伟|尚鹏|顾一仁|黄燕|李明珠|龙克然
四川省农业大学猪禽育种产业国家重点实验室，成都611130，中国
摘要
骨髓间充质干细胞（BMSCs）是多能基质细胞，能够分化成多种谱系，并表现出功能异质
张松岭|朱玲|钟志宁|张宇|李子琪|陈秋月|王迅|姜安娜|周迅|孔凡丽|张金伟|孙伟|尚鹏|顾一仁|黄燕|李明珠|龙克然
四川省农业大学猪禽育种产业国家重点实验室，成都611130，中国
摘要
骨髓间充质干细胞（BMSCs）是多能基质细胞，能够分化成多种谱系，并表现出功能异质性。为了研究猪BMSC的异质性，我们对从藏猪胫骨骨髓中分离出的BMSC进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。我们识别出五个基于转录组的BMSC亚群：增殖型、干细胞型、双潜能前软骨成骨细胞（双潜能型）、前成骨细胞和前软骨细胞，并推断出它们之间的发育关系及其动态表达变化，特别是在双潜能亚群双向分化过程中。通过基因编辑技术，我们生成了MSTN敲除（KO）的藏猪，并观察到KO BMSC的成骨和增殖能力增强。为了阐明其机制，我们对KO藏猪和野生型（WT）藏猪的BMSC进行了scRNA-seq分析。转录组分析显示，KO BMSC中差异表达基因显著上调。富集分析、通路活性分析、SCENIC分析和CellChat分析表明KO BMSC中与成骨相关的转录和细胞间信号通路发生了广泛的重塑。据我们所知，这项研究为早期培养的猪BMSC提供了首个单细胞框架，并揭示了MSTN敲除与大型动物模型中成骨和增殖潜力增强之间的机制联系。
引言
骨骼在猪的发育中起着重要作用，特别是在支持生长、运动和代谢方面。猪的骨骼不仅提供结构支撑，还保护重要器官，作为钙和磷等矿物质代谢的储存库，并为肌肉提供附着点以促进运动。此外，骨骼发育的质量直接影响猪的生长速度、生产性能和健康状况（Blair等人，1963年；Lunney等人，2021年；Zhu等人，2024年）。肢体骨骼的异常生长会导致腿部结构虚弱，而不健全的腿部会造成重大的经济损失，尤其是在育种猪中（Wood，2001年）。同时，肢体骨骼长度是影响猪体高的主要因素。据报道，体高与背脂厚度呈负相关，也是髋肉、腰部肉、肩前肉和肩后肉产量的决定因素（Hetzer等人，1950年；Hetzer和Miller，1972年）。
间充质基质/干细胞（MSCs）由Friedenstein于1976年首次发现（Friedenstein等人，1976年），是一类存在于骨髓和大多数结缔组织中的基质细胞，包括但不限于脂肪组织、外周血液和胎盘（Berebichez-Fridman和Montero-Olvera，2018年）。MSCs对骨骼的生长和终生更新至关重要（Bianco，2014年），这显著影响了肉的产量和体高，对养猪业具有重要的经济意义。事实上，MSCs也被认为是体外肉培养中生产肌肉纤维的有希望的细胞来源（Shaikh等人，2021年）。此外，猪被认为是探索人类MSCs治疗应用的理想动物模型，因为猪BMSC可以容易地采集、分离、扩增和在体外分化（Zhao等人，2024年；Zhu等人，2024年）。然而，猪BMSC之间的细胞异质性尚未得到充分研究，这阻碍了猪BMSC的应用。
MSTN是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的成员（McPherron等人，1997年）。许多研究调查了MSTN基因的功能，发现MSTN可以激活p38 MAPK、Erk1/2和Wnt通路（Allendorph等人，2006年；Joulia-Ekaza和Cabello，2007年）。MSTN受体也存在于成骨细胞膜上（Hamrick等人，2007年），而Wnt信号通路是调节成骨细胞增殖和分化的经典信号通路（Sun等人，2016年；Liu等人，2017年）。大量证据表明，MSTN缺乏不仅能够增强骨骼肌，还能促进骨骼形成。与野生型小鼠相比，MSTN敲除（KO）小鼠的骨矿物质密度（BMD）增加（Hamrick，2003年）。此外，MSTN敲除小鼠的BMD增加效应可持续到老年（Morissette等人，2009年）。Christoph（Wallner等人，2019年）发现，抑制MSTN不仅可以增强小鼠脂肪来源干细胞（mASCs）和小鼠骨髓来源干细胞（mBMSCs）的成骨潜力，还能抑制mASCs的脂肪分化，使其向成骨方向分化。然而，MSTN敲除对猪BMSC成骨的影响以及细胞异质性是否参与了猪BMSC成骨潜力的增强尚未得到研究。
本研究首次对猪BMSC亚群进行了系统的单细胞分析，揭示了它们的细胞异质性，这对于理解BMSC在维持骨骼稳态中的作用至关重要。我们建立了MSTN敲除模型，以研究MSTN缺失对BMSC的影响，揭示了几种促进BMSC成骨能力增强的分子机制。总体而言，这项研究加深了我们对猪BMSC异质性的理解，并阐明了MSTN对BMSC的影响。
章节摘录
动物伦理声明
所有猪都喂食相同的标准饲料，并在相同的条件下饲养。本研究中描述的与动物实验相关的一切方案都经过了四川省农业大学动物伦理和福利委员会（AEWC）的审查和批准，许可号为DKY-B2022202051。
生成MSTN?/?猪
简而言之，使用在线CRISPR设计工具（http://crispor.tefor.net/）设计了针对MSTN基因外显子1区域的sgRNA。sgRNA目标DNA序列：
猪骨髓间充质干细胞的异质性
从骨髓抽吸物中无菌分离出猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）。为了表征猪BMSC的异质性，使用SINGLERON平台从野生型（WT）和MSTN敲除（MSTN-KO）猪中获取第一代细胞进行单细胞RNA测序。经过严格的质量控制后，保留了29,823个WT样本的细胞，并将其分为三种细胞类型：间充质干细胞（MSCs）、单核细胞和中性粒细胞。
讨论
间充质干细胞具有自我更新能力、多向分化潜力、旁分泌效应和免疫抑制特性，被认为是再生医学的有希望的候选细胞（Nombela-Arrieta等人，2011年；Bianco，2014年）。然而，尽管MSC的亚群结构已得到广泛研究，但大多数研究集中在人类或小鼠上（Zhang等人，2022年；Zhang等人，2023b），而猪BMSC的潜在亚群尚未得到充分研究。
结论
在我们的研究中，我们利用单细胞测序技术识别了从藏猪中分离出的BMSC中的五个基于转录组的细胞亚群。我们探讨了它们的异质性，重建了这些亚群之间的发育关系，并追踪了双潜能亚群的动态轨迹。我们发现，MSTN敲除后，藏猪BMSC的成骨能力得到了增强。这一发现进一步得到了富集分析的支持。
未引用的参考文献
Lavery等人，2008年；Reddi，1997年；Wang等人，2020年。
CRediT作者贡献声明
张松岭：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿、软件使用、正式分析。朱玲：方法学研究、正式分析。钟志宁：软件使用、方法学研究、正式分析。张宇：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿、软件使用、正式分析。李子琪：可视化处理、软件使用。陈秋月：软件使用、正式分析。王迅：方法学研究、实验设计。姜安娜：方法学研究。周迅：方法学研究、实验设计。孔凡丽：正式分析。张金伟：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
