《Gene Expression Patterns》：Defining the spatiotemporal expression pattern of Rap1 in the chicken embryonic spinal cord
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Jacob Musicante|Maia Vong|Judith Saunders|Tanushree Pandit罗德学院，2000 North Parkway，Memphis TN 38112，美国摘要神经元在发育中的脊髓内生成并迁移到最终位置的具体机制尚未完全明了。Rap1
Jacob Musicante|Maia Vong|Judith Saunders|Tanushree Pandit
罗德学院，2000 North Parkway，Memphis TN 38112，美国
摘要
神经元在发育中的脊髓内生成并迁移到最终位置的具体机制尚未完全明了。Rap1是一种小GTP酶，其表达此前已被证实与多种模式生物体中细胞的分化和迁移有关。因此，我们研究了鸡胚胎脊髓中Rap1的表达情况，特别是在室管膜区的前体细胞产生向脊髓外侧表面迁移的分化神经元时。研究结果表明，在神经发生过程中，Rap1在整个脊髓的背腹轴上广泛表达，包括在室管膜区的神经元前体细胞以及迁移中的神经元中。我们还在脊髓连合轴突和底板（连合轴突跨越中线处）观察到了Rap1的表达。除了脊髓外，还在发育中的背根神经节和腹侧运动轴突中发现了Rap1的表达。我们的表达分析表明，Rap1可能在决定前体细胞的身份、神经元的生成和迁移以及脊髓中的连合轴突形成过程中发挥作用。
引言
形成能够接收感觉输入并调节运动控制的功能性脊髓依赖于沿着胚胎背腹轴有序生成多种类型的神经元。这些神经元亚型可以通过它们的转录网络、形态、分泌的神经递质和突触连接来区分（Lai等人，2016年）。这些神经元亚型最初起源于神经管沿背腹轴模式化过程中组织起来的前体细胞。从底板和脊索向腹侧分泌的Sonic Hedgehog (SHH)配体指导腹侧前体域的形成，而骨形态发生蛋白 (BMP) 和Wingless相关的整合 (Wnt) 配体从位于背侧的顶板分泌，则指定背侧前体域（Alvarez-Medina等人，2008年；J. Briscoe等人，1999年；Ericson等人，1996年；Timmer等人，2002年）。沿神经管背腹轴建立的前体域表达不同的转录因子，这些转录因子在发育的后期驱动有丝分裂后神经元的持续生成（Pfaff等人，1996年；Wilson等人，2008年）。在空间上，产生终末分化的内神经元和运动神经元的前体细胞位于神经管的室管膜区附近。在分化过程中，这些前体细胞从室管膜区脱离并迁移到最终位置，随后以有丝分裂后神经元的形式驻留（Wilcock等人，2007年）。
多项研究表明，信号分子和神经前体转录因子之间存在复杂的相互作用，这些相互作用促进了不同细胞环境中神经元形态和迁移的变化（Pacary等人，2011年；Tozer等人，2017年；Jossin和Cooper，2011年）。虽然室管膜区的前体细胞通过不同分布的粘附分子（如cadherins）在顶端和基底两端连接（Manabe等人，2002年；Rousso等人，2012年），但这些细胞的迁移需要通过脱离顶端表面来实现（Wilcock等人，2007年；Jossin和Cooper，2011年）。在这些细胞粘附复合体中定位的蛋白质中，小GTP酶Ras相关蛋白1 (Rap1) 通过在新生皮层中形成粘附连接的作用，在神经元前体和有丝分裂后神经元的极化过程中发挥重要作用（Shah等人，2016年）。Rap1属于Ras GTP酶家族（Ja?kiewicz等人，2018年），具有两种基因上不同的异构体：Rap1A和Rap1B（Wittchen等人，2011年）。与其他GTP酶一样，Rap1在其活性形式下与GTP结合，而在GTP水解后，Rap1与GDP结合而变得不活跃。这种核苷酸的循环交换由各种鸟苷核苷酸交换因子 (GEFs) 和GTP酶激活蛋白 (GAPs) 促进（Ja?kiewicz等人，2018年）。Rap1A和Rap1B在起源于造血前体细胞（如中性粒细胞和T细胞）的细胞中广泛表达（Li等人，2007年）。在小鼠中，Rap1A和Rap1B的缺失会导致胚胎死亡，死亡通常发生在E10.5阶段，原因是严重的出血和血管缺陷（Chrzanowska-Wodnicka等人，2015年）。
Rap1 GTP酶在神经元和非神经元组织中均具有功能。在发育中的小鼠新生皮层中，Rap1在包含前体细胞的室管膜区表达（表1）（Shah等人，2016年）。与此表达模式一致，Rap1A和Rap1B的缺失导致小鼠新生皮层中的神经元前体和有丝分裂后神经元数量增加。此外，由于室管膜区内前体细胞的顶端和基底过程丧失，这些小鼠的室管膜区神经元前体的极性也受到了干扰（Shah等人，2016年）。在非洲爪蟾神经管闭合过程中，上皮细胞的顶端收缩需要Rap1的活性（Haigo等人，2003年）。此外，在小鼠胚胎的上胚层极化过程中也需要Rap1的活性（Kim等人，2022年）。总体而言，这些研究表明Rap1在调节细胞形态方面起着重要作用，尤其是在各种组织的顶端表面。
与其他神经组织类似，胚胎脊髓室管膜区的前体细胞从顶端表面脱离并径向迁移到最终位置。这种径向迁移之后，这些神经元亚型沿着脊髓的背腹轴广泛迁移（Lai等人，2016年）。脊髓神经元如何横向迁移以及如何沿背腹轴迁移的细胞机制尚不完全清楚。虽然已经探讨了Rap1在其他胚胎组织中对神经发生和神经元迁移的调节作用，但其在中枢神经系统发育中的具体作用仍有待直接研究。此外，缺乏关于脊椎动物脊髓发育不同阶段Rap1表达的详细时空谱谱。因此，我们研究了鸡胚胎脊髓在神经管模式化、神经发生和连合轴突引导过程中的Rap1表达情况。我们的研究发现，Rap1在鸡的神经管中广泛表达，包括在室管膜区前体细胞的顶端侧以及神经发生过程中的迁移中有丝分裂后神经元中。与此广泛表达一致的是，在脊髓的整个背腹轴上也有Rap1的表达。在连合轴突引导过程中，Rap1在即将交叉的连合神经元和连合轴突交叉处的底板中表达。除了胚胎脊髓外，还在发育中的背根神经节、运动轴突和皮肌节中观察到了Rap1的表达。我们的表达分析表明，应进一步研究Rap1 GTP酶在脊髓前体细胞的生成、神经元迁移和连合轴突引导中的作用。此外，还应探讨Rap1 GTP酶在胚胎发育期间背根神经节的形成和运动轴突的腹侧输出中的作用。
章节片段
动物使用
我们从Charles River Laboratories购买了特定的无病原体受精莱格霍恩鸡卵，并根据Hamburger和Hamilton (HH) 胚胎发育阶段（对应于HH13至HH26）进行培养。卵在37.5°C下培养46-49小时（HH13-14阶段）用于神经管模式化，65-72小时（HH16-18和HH20阶段）用于神经发生，或120小时（HH26阶段）用于轴突发育。在所需的发育阶段，将胚胎在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中解剖
结果
- 1.
在神经发生过程中，Rap1在胚胎脊髓中广泛表达
为了评估发育中的脊髓中Rap1的表达情况，我们在HH17和HH20阶段对鸡胚胎进行了成像，此时细胞退出细胞周期并从室管膜区向侧面迁移（图1 A）（Kasioulis和Storey，2018年）。为了标记有丝分裂后神经元，我们使用了先前在背侧端脑特异性验证的抗体 Rap1A/Rap1B 来检测Rap1的表达。
讨论
脊髓中的体感系统和运动系统通过以时空方式为各种感觉输入提供整合并控制运动活动。虽然已经确定了调节这些神经元亚型增殖、分化和迁移的信号传导线索和转录网络，但最近人们越来越关注这些外在因素下游的机制
结论
总之，我们的研究揭示了胚胎脊髓中Rap1的详细时空表达谱，这在前人研究中尚未涉及。我们的表达分析显示Rap1在前体细胞和有丝分裂后神经元中均有表达。在室管膜区内，Rap1主要在前体细胞的顶端侧表达。此外，在迁移中的有丝分裂后神经元中也能观察到Rap1的表达，包括背侧内神经元和腹侧运动神经元。
CRediT作者贡献声明
Judith Saunders:撰写 – 审阅与编辑，验证，方法学，研究，正式分析，数据管理。Tanushree Pandit:撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，可视化，监督，资源获取，方法学，资金申请，正式分析，概念化。Jacob Musicante:撰写 – 审阅与编辑，验证，方法学，研究，正式分析，数据管理。Maia Vong:撰写 – 审阅与编辑，验证
资金来源
本研究得到了提供给Pandit博士的研究启动资金以及2023年罗德学院教师发展委员会颁发的教师发展基金的支持。
致谢
作者们感谢生物系实验室经理Jordy Gentry在购买实验室试剂和用品方面的协助。我们还要感谢Elaine Frawley博士、Christina Daly博士、Daniel Stewart博士、Laura Shanahan博士和Christophe Laumonnerie博士对手稿的阅读和宝贵反馈。
