《Gene Reports》：Mitochondrial DNA analysis of Apis mellifera L. in Mocache, Ecuador, using COI and tRNALeu–COII markers
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卡米洛·亚历山大·梅斯塔尼亚·乌基利亚斯（Camilo Alexander Mestanza Uquillas）| 罗克萨娜·斯特凡妮亚·萨拉扎尔·昆迪（Roxana Stefanía Salazar Quinde）| 黛安娜·维罗尼卡·贝利兹·萨莫拉（Diana Verónic
卡米洛·亚历山大·梅斯塔尼亚·乌基利亚斯（Camilo Alexander Mestanza Uquillas）| 罗克萨娜·斯特凡妮亚·萨拉扎尔·昆迪（Roxana Stefanía Salazar Quinde）| 黛安娜·维罗尼卡·贝利兹·萨莫拉（Diana Verónica Véliz Zamora）| 娜加·拉朱·马德拉（Naga Raju Maddela）
厄瓜多尔洛斯里奥斯省克韦多市（Quevedo）国立技术大学（UTEQ）畜牧科学学院
摘要
线粒体标记被广泛用于鉴定Apis mellifera的母系谱系。本研究通过使用E2/H2引物扩增COI–tRNALeu–COII区域的一段序列，评估了在厄瓜多尔沿海洛斯里奥斯省马奥卡切（Mocache）和瓦伦西亚（Valencia）采集的十个养蜂群体中的线粒体变异情况。这些序列富含AT碱基（平均含量为88.36%），并表现出明显的长度多态性（638–1231 bp），这反映了基因间片段中插入/缺失和重复序列的多样性。在十个群体中我们识别出了七种单倍型（h = 7），单倍型多样性很高（Hd = 0.933）。基于替换的多样性统计分析是在一个无间隙的核心比对序列（637个位置）上进行的（S = 9；π = 0.0039）。由于样本量有限（n = 10），Tajima的D值呈负数（D = ?0.95），因此在描述性意义上进行解释。为了保留系统的进化信息，我们将含有大量重复/插入序列的片段（比对位置189–381）编码为离散的重复结构状态（R0–R5），并通过最小生成树网络进行了可视化。包括非洲系（谱系A）和欧洲系（谱系E）参考亚种在内的最大似然系统发育分析表明，所有马奥卡切和瓦伦西亚的单倍型都属于非洲系谱系。这些结果为厄瓜多尔沿海地区人工饲养的蜜蜂提供了初步的母系多样性基准。
引言
养蜂业通过提供授粉服务以及生产蜂蜜和其他蜂产品来支持农业生产并维持农村生计。在热带和亚热带地区，人工饲养的蜜蜂群体直接提高了许多水果、油料作物和园艺作物的产量和质量，同时还通过生产蜡、花粉、蜂胶和王浆等多样化产品增加了农场收入。然而，尽管养蜂业具有重要意义，但其生产力和盈利能力仍受到技术培训不足、管理实践不佳、病虫害压力以及改良技术和高质量育种材料获取受限等因素的制约（Bareke等人，2024；Bihonegn和Begna，2021；Mulatu等人，2021；Mushonga等人，2019；Schouten等人，2025）。这些限制因素常常因技术服务薄弱、市场分割以及蜂王供应链不完善而加剧，导致蜂群频繁更替和生产力不稳定。因此，加强养蜂价值链越来越重视蜂王育种计划、遗传质量控制以及使用适应当地环境的蜜蜂品种，以提升蜂群的健康状况、生产力和系统的韧性（Schouten等人，2025）。
从生物学和管理的角度来看，蜂群的表现受到环境条件、病原体和寄生虫以及蜜蜂遗传背景的相互作用的影响。在新热带地区，人工饲养的蜜蜂种群经历了多次欧洲系与非洲系之间的引入和杂交，形成了所谓的“非洲化”种群。这些种群具有复杂的人口历史和空间异质性的遗传背景，这对养蜂实践具有实际影响，因为它们可能影响蜜蜂的防御行为、分群倾向以及对局部压力的耐受性。重要的是，可以使用线粒体DNA（mtDNA）标记高效追踪这些种群的母系起源（Collet等人，2006；Cornuet等人，1991；Garnery等人，1992）。由于mtDNA是母系遗传的且几乎不发生重组，它为重建母系谱系和监测非洲系线粒体类型在多样化景观中的地理传播和持续性提供了可靠的基础（Collet等人，2006；Garnery等人，1992）。了解母系谱系有助于记录区域遗传组成、比较人工饲养与野生种群，并支持与蜂王交换相关的可追溯性工作。
在线粒体DNA标记中，COI–COII区域（包括tRNALeu和COII的5′端片段）已成为用于谱系鉴定和群体水平筛查的常用标记。该区域的信息量大，因为它结合了核苷酸替换、插入/缺失和重复序列，能够高精度地区分不同母系谱系和群体内的单倍型（Cornuet等人，1991；Garnery等人，1992）。COI–COII基因间片段的结构多态性（通常以重复单元和长度变异表示）也是经典的DraI COI–COII测试的基础，该测试仍然是Apis mellifera快速谱系分型的有效工具。因此，COI–tRNALeu–COII数据可以提供基于序列的单倍型信息以及补充的限制性分析结果，便于与以往研究进行比较，并在资源有限的条件下实现经济有效的监测。
在厄瓜多尔，养蜂活动分布在从沿海低地到安第斯高地和亚马逊丘陵的各种环境中。这种气候和生产环境的多样性，加上蜂群和蜂王的地区性流动，导致了母系起源和单倍型组成的区域差异。然而，尽管mtDNA分析对于育种决策、卫生管理和生产系统的遗传资源保护具有重要意义，但在地方层面的应用仍然有限。对于养蜂业不断扩展和农业集约化的地区来说，建立基线数据尤为重要，因为这些地区的授粉需求和蜂群流动可能增加。此外，基础mtDNA数据为未来的综合研究提供了基础，这些研究可以结合核标记（微卫星或SNP）来量化全基因组范围内的遗传混合情况、评估蜂场之间的连通性，并测试遗传背景与农艺性状之间的关联。
因此，本研究旨在利用COI–tRNALeu–COII序列生成厄瓜多尔洛斯里奥斯省马奥卡切和瓦伦西亚地区蜜蜂群体的线粒体变异本地参考数据。具体来说，我们旨在：（i）描述COI–tRNALeu–COII序列的变异和长度多态性；（ii）估计单倍型和核苷酸多样性并评估其中性程度；（iii）通过计算机模拟的DraI限制性分析推断基因型；（iv）利用Bombus ignitus作为外群，将本地单倍型置于非洲系（A）和欧洲系（E）参考亚种的系统发育框架中。通过结合多样性指标、限制性分析和系统发育推断，我们的方法为遗传监测提供了实用框架，有助于指导蜂王管理并支持厄瓜多尔沿海农业地区的养蜂业长期可持续发展。
章节片段
研究区域和采样
样本来自厄瓜多尔洛斯里奥斯省的十个养蜂群体（主要位于马奥卡切县（?1.089472, ?79.503341）和瓦伦西亚县（?0.8808782, ?79.40868）（图1）。样本用乙醇保存并在?20°C下储存，直至提取DNA。群体标识信息见表1。同时，我们还记录了相关的群体健康观察数据（如瓦螨侵染情况、蜜蜂的梳理行为和螨虫引起的损伤）作为背景信息。
序列特征和长度多态性
来自马奥卡切/瓦伦西亚群体的COI–tRNALeu–COII序列富含AT碱基（平均含量为88.36%），并表现出显著的长度多态性（638–1231 bp）（表2）。尽管序列长度存在显著差异，但各群体之间的AT碱基含量保持一致，说明序列变异的主要来源是结构上的（即插入/缺失丰富的片段），而非整体碱基组成的变化。最短的序列对应于A1
讨论
本研究使用COI–tRNALeu–COII标记，对厄瓜多尔洛斯里奥斯省马奥卡切和瓦伦西亚地区的人工饲养蜜蜂群体进行了线粒体DNA（mtDNA）特征分析。通过整合基于序列的单倍型、计算机模拟的DraI限制性分析结果以及最大似然（ML）系统发育推断，我们获得了该地区母系多样性的清晰画像，而该地区的系统遗传基线数据相对较少。总体而言，我们的研究结果表明：
结论
在马奥卡切和瓦伦西亚采集的人工饲养蜜蜂群体中，单倍型丰富度较高，但基于替换的核苷酸多样性较低；重复/插入序列的结构对标记区分起到了重要作用。系统发育分析结果显示，这些群体主要具有非洲血统。建议在更多县和省份开展更广泛的地理采样，并加入核标记分析，以进一步明确遗传多样性。
作者贡献声明
卡米洛·亚历山大·梅斯塔尼亚·乌基利亚斯（Camilo Alexander Mestanza Uquillas）： 负责初稿撰写、监督、数据分析及概念构思。罗克萨娜·斯特凡妮亚·萨拉扎尔·昆迪（Roxana Stefanía Salazar Quinde）： 负责数据收集和分析。黛安娜·维罗尼卡·贝利兹·萨莫拉（Diana Verónica Véliz Zamora）： 负责数据审查和编辑。娜加·拉朱·马德拉（Naga Raju Maddela）： 负责初稿撰写和形式化数据分析。
Kumar等人，2024
Saitou和M，1987
Sievers等人，2011
作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。
本研究是罗克萨娜·斯特凡妮亚·萨拉扎尔·昆迪（Roxana Stefanía Salazar Quinde）农业生物技术硕士学位项目的一部分。作者感谢SENESCYT奖学金和财政援助计划的支持。
