关于根际级联效应的机制学研究：硝化抑制剂DMPP如何重塑根系微生物组与代谢组，从而提升玉米对氮的吸收效率

《Geoderma》：Mechanistic insights into the rhizosphere cascade: how the nitrification inhibitor DMPP reshapes the root microbiome and metabolome to enhance maize nitrogen recovery

　　吉林雷 | 蒂坤关 | 孟藏 | 李家瑞 | 刘瑞
中国农业大学资源与环境科学学院，北京农田土壤污染预防控制与修复重点实验室，北京100193

**摘要**
根际是植物根系与土壤相互作用的关键区域，它控制着养分循环，并直接影响氮（N）的利用效率。虽然已知硝化抑制剂3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）可以提高土壤中氮的保留量，但其通过重新编程根际微环境来增强植物氮吸收的具体机制仍不清楚。本研究使用玉米（Zea mays L.）进行了分室根箱实验，结合15N同位素 tracing、16S rRNA测序和非靶向代谢组学方法，阐明了这一过程。结果表明，与常规氮肥施用相比，DMPP应用使玉米的氮回收效率（NRE）提高了41.1%。该抑制剂触发了一系列事件，最初表现为根际pH值的显著下降，这导致了土壤代谢组的深刻变化，尤其是脂质和有机杂环化合物的变化。这些代谢变化随后使溶解有机碳（DOC）增加了84.7%，并直接促进了某些细菌类群（如放线菌门Streptomyces和变形菌门Microvirga）的选择性富集，同时抑制了寡营养菌类（如酸杆菌门Acidobacteriota和绿弯菌门Chloroflexi）——这种群落重组还表现为共生网络的复杂性和连通性的提高。通过偏最小二乘路径模型建立了一个综合的因果路径，将pH值下降与代谢变化、DOC增加和细菌富集联系起来，表明这一系列事件最终促进了氮回收效率的提高。这些发现提出了一种从化学抑制到植物层面氮吸收的机制级联效应，暗示DMPP的功能不仅仅是通过保留铵离子，还通过积极促进根际中有益的植物-微生物反馈循环来发挥作用。

**1. 引言**
氮（N）是作物生产力的基石，然而其利用效率（NUE）——即施用的氮肥中被作物吸收和利用的比例——在农业系统中仍然很低（Liu等人，2025a）。大量施用的肥料通过多种途径流失到环境中，包括硝酸盐淋溶、氨（NH3）挥发以及硝化-反硝化过程中的气体排放（例如一氧化二氮N2O和氮气N2）（Pan等人，2016；Ju和Zhang，2017；Pan等人，2022）。尽管NH3挥发和N2排放通常是农业生态系统氮流失的主要直接原因（Pan等人，2016；Pan等人，2022），但N2O的排放因作为强效温室气体和臭氧消耗物质而具有重要的环境意义（Yan等人，2022；Vangeli等人，2022）。因此，提高氮利用效率对于推进可持续农业集约化和减轻其环境足迹至关重要，包括减少硝酸盐淋溶引起的水体富营养化和温室气体排放（例如N2O）。

一种提高氮利用效率的有前景策略是施用硝化抑制剂，如3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）。该抑制剂主要针对氨氧化细菌（AOB）中的氨单加氧酶，阻断硝化作用的第一步（Bozal-Leorri等人，2022）。通过减缓铵离子（NH4+）向硝酸盐（NO3?）的微生物氧化过程，DMPP将氮以移动性较低的NH4+形式保留下来，从而可能减少氮的损失并提高土壤中的氮保持量（Lei等人，2025）。DMPP在抑制土壤中硝化作用方面的农艺效果以及其在某些条件下提高作物产量的潜力已有充分记录（Tariq等人，2022；Liu等人，2025b）。然而，其最终成功取决于发生在植物-根界面——即根际的过程，在这里植物实际吸收氮。在这个界面，DMPP引起的NO3?向NH4+的优势转变可能会触发一系列根际事件，超出了铵离子保留的直接效应。

根际是一个生物热点，根系、微生物和土壤成分在此相互作用，控制着养分循环和可用性（Brink，2016）。这些相互作用的核心是根际分泌物——一种复杂的代谢物混合物，对塑造根际微生物组和影响土壤氮转化起着关键作用（Zhou等人，2023；Baker等人，2024）。在DMPP作用下，氮的主要形式从NO3?向NH4+的转变对根际生物地球化学有重要影响。植物优先吸收NH4+需要H+的释放，导致根际酸化（Meier等人，2020），而抑制硝化作用本身则减少了酸性的来源（Qiao等人，2015）。净pH值变化——影响养分溶解度、微生物活动和根际分泌物（Wang和Kuzyakov，2024）——反映了这些过程之间的平衡。这种pH介导的转变，加上氮可用性的改变，可能会改变根际分泌物模式并重塑微生物群落。然而，将DMPP施用、根际性质改变、代谢重组和微生物组重构与植物氮吸收增强联系起来的综合级联过程尚未得到定量描述。

使用16S rRNA研究DMPP对细菌群落的影响得出了不一致的结果：一些研究未发现其对整体细菌群落结构有显著影响（Zhang等人，2017；Luchibia等人，2020），而其他研究则显示了明显的变化（Bachtsevani等人，2021；Malakshahi Kurdestani等人，2024）。这些效应可能是剂量依赖的，较高的施用率会导致更明显的变化，例如放线菌门内的改变（Luchibia等人，2020）。DMPP的应用还与某些细菌科（如Gemmaatimonaceae、Cytophagaceae）的富集有关，并可能影响固氮细菌的增殖（Zhang等人，2017；Corrochano-Monsalve等人，2021）。关于硝化菌，研究表明DMPP对氨氧化菌群落有差异性影响，减少了AOB的数量，而对氨氧化古菌（AOA）的影响较小（Kleineidam等人，2011）。更广泛地说，氮的可用性被认为是根际微生物动态的关键决定因素（Baker等人，2024；Galindo-Casta?eda等人，2025）。然而，专门研究DMPP对更广泛的根际细菌群落（超出氨氧化菌）影响的研究仍然很少，大多数研究集中在土壤整体或特定功能群体上（Kleineidam等人，2011）。尽管取得了这些进展，DMPP引起的氮形态变化如何转化为根际微生物重组的具体代谢途径仍大部分未被探索——这一空白非常适合通过整合16S rRNA和代谢组学方法来解决。

为了解决这些空白，我们使用玉米进行了根箱实验，结合15N同位素追踪、16S rRNA测序和非靶向代谢组学方法，测试了DMPP通过引发根际pH值和溶解有机碳（DOC）的变化来驱动代谢组重组和选择性细菌群落重构，从而提高植物氮吸收的假设。具体研究内容包括：（1）DMPP引起的根际物理化学性质变化；（2）代谢组和细菌群落组成的同时变化，包括它们的相互作用网络；（3）这些协调变化是否促进了植物氮吸收的提高。多变量统计、共现网络分析和偏最小二乘路径建模被整合起来，以定量描述这一级联过程。这些发现为利用植物-微生物相互作用来改善作物系统中的氮管理提供了机制框架。

**2. 材料与方法**
**2.1. 实验土壤**
从中国农业大学衢州实验站（115°02′76″E，36°85′69″N）采集了表层土壤（0–20 cm）。将九个随机土芯混合成一个复合样品。该地区长期采用小麦-玉米轮作制度，没有施用DMPP或其他硝化抑制剂的历史。采用秸秆还田方式，不添加额外有机改良剂，长期氮肥施用量为180至240 kg N ha?1。灌溉采用喷灌系统，耕作方式采用旋转耕作。土壤的容重为1.43 g cm?3。去除石子和植物残余物后，土壤经过筛分（2 mm），分为两部分：一部分用于根箱实验，另一部分储存在4°C下进行物理化学分析。基本土壤性质见表1。根据颗粒大小分布，该土壤被分类为粉壤土（USDA土壤质地分类系统）。

表1. 测试土壤的物理化学性质。
| pH | NH4+ (mg kg?1) | NO3? (mg kg?1) | TN (g kg?1) | SOM (g kg?1) | AP (mg kg?1) | AK (mg kg?1) | WHC (%) |
|---|----------|-----------|--------------|-----------|------------|---------|---------|此计算使用15N原子百分比的过剩量来准确表示来自标记肥料的氮的比例。植物部分中的氮积累（NA，mg植物^-1）：(2) NA = 干重 × 总氮含量。植物中来自肥料的氮（Ndff，mg植物^-1）：(3) Ndff = NA × Nf(植物)。总氮积累（TNA）是通过地上（茎）和地下（根）部分的NA之和计算得出的。植物中来自土壤的氮（Ndfs，mg植物^-1）：(4) Ndfs = NA - Nf(植物)。氮回收效率（NRE，%）：(5) NRE = Ndff / 总施用的肥料氮 × 100%，其中“总施用的肥料氮”是指每个根箱中添加的氮量（518 mg氮，基于140 mg氮/千克土壤 × 每个根箱3.7千克土壤）。植物（地上和地下）和土壤样品中的总氮含量和15N丰度是使用元素分析仪（Vario Macro，Elementar，德国）与同位素质谱仪（EA-IRMS，Isoprime 100，德国）共同测定的。

2.4. 土壤DNA提取、高通量测序和生物信息学分析
使用FastDNATM Spin Kit for Soil（MP Biomedicals，美国）根据制造商的说明从0.5克土壤中提取总基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估提取DNA的完整性，并使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific，美国）确定浓度和纯度。使用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增细菌16S rRNA基因的高变区V3-V4。聚合酶链反应（PCR）反应（20 μL）包含4 μL的5× TransStart FastPfu缓冲液、2 μL的2.5 mM dNTPs、每种引物0.8 μL（5 μM）、0.4 μL的TransStart FastPfu DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。热循环包括在95°C下初始变性3分钟，然后在95°C下变性27次，每次30秒，在55°C下退火30秒，在72°C下延伸45秒，最后在72°C下延伸10分钟。PCR产物使用DNA Gel Extraction Kit（PCR Clean-Up Kit，中国）纯化，并使用Qubit 4.0荧光仪（Thermo Fisher，美国）进行定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit在Illumina Nextseq 2000平台上进行配对末端测序（2 × 250 bp）。原始测序读段使用fastp版本0.19.6（Chen等人，2018）进行质量控制，去除低质量分数（50-bp窗口内平均值< 20）、模糊碱基或长度小于50 bp的读段。使用FLASH版本1.2.11（Mago?和Salzberg，2011）组装配对末端读段，要求至少有10 bp的重叠和≤0.2的错配比率。使用UPARSE版本7.1（Edgar，2013）根据97%的相似性将组装的序列分组为操作分类单元（OTUs），并消除嵌合序列。使用RDP Classifier版本2.11（Wang等人，2007）根据SILVA数据库（版本138）对OTU代表性序列进行分类，置信阈值为70%。为了考虑测序深度的不均匀性，将每个样本标准化为20,000个序列，平均覆盖度超过99%。使用Mothur版本1.30.1（Schloss等人，2009）计算α多样性（Chao1，Shannon）和β多样性（Bray-Curtis差异）指标。原始序列数据已存入NCBI Sequence Read Archive，访问号为PRJNA1428735。后续的微生物群落分析，包括群落结构和多样性的评估，是在Majorbio Cloud Platform（https://cloud.majorbio.com）上进行的。

2.5. 根际代谢物的提取和分析
使用100毫克根际土壤进行代谢物提取。代谢物用预冷却的甲醇：乙腈：水（2:2:1，v/v/v）溶剂混合物提取，并加入同位素标记的内标。样品通过球磨（35 Hz，4分钟）进行均质化，然后在冰浴中进行5分钟的超声提取。这个过程重复三次。提取后，样品在-40°C下孵育1小时以沉淀蛋白质和其他杂质，然后在4°C下以12,000 rpm离心15分钟。上清液小心收集并转移到UHPLC-MS分析的注射小瓶中。色谱分离在配备了Phenomenex Kinetex C18柱（2.1 mm × 50 mm，2.6 μm）的Thermo Vanquish UHPLC系统上进行。流动相由（A）0.01%醋酸水溶液和（B）异丙醇：乙腈（1:1，v/v）组成。柱温保持在40°C，进样体积为2 μL。质谱分析使用Orbitrap Exploris 120仪器（Thermo Scientific）进行，采用正负离子模式和数据依赖采集（DDA）。原始数据使用ProteoWizard转换为mzXML格式，并使用XCMS软件包进行峰挑选、对齐和特征提取。通过将MS/MS谱与BiotreeDB V2.1数据库匹配进行代谢物鉴定，质量误差容忍度为0.3 ppm。分析过程得到了Biotree Biomedical Technology Co., Ltd.（上海，中国）的支持。

2.6. 数据处理和统计分析
数据在Excel 2019中处理，并使用SPSS 20.0（IBM，美国）进行分析。使用单因素方差分析（ANOVA）在P < 0.05的水平上评估处理组之间的差异显著性，然后使用Tukey的 Honest Significant Difference（HSD）事后检验进行多重比较。为了进一步测试处理、土壤组分及其交互作用对细菌α多样性指数的影响，还对符合方差同质性假设的指数进行了双因素ANOVA（Levene的检验，P > 0.05）。对于Simpson指数，当方差同质性假设被违反时（Levene的检验，P < 0.05），分别对每个组分内的处理进行单因素ANOVA，相同处理内的组分之间的比较使用Student的t检验进行。对于单因素网络，选择每个处理中前200个最丰富的OTUs以减少罕见分类单元的影响。计算成对的Pearson相关性（|r| > 0.6，P < 0.05），并保留这些相关性以构建每个处理的单独网络。对于细菌-代谢物双因素网络，使用相对丰度在前100的细菌属和不同丰富度的代谢物（在N与ND下鉴定），使用相同的相关性阈值（|r| > 0.6，P < 0.05）。网络使用Gephi 0.10.1和Cytoscape 3.9.1进行可视化。为了评估观察到的网络拓扑是否偏离随机预期，进行了零模型分析；详细程序见方法S1。使用了Majorbio Cloud Platform（https://cloud.majorbio.com）进行微生物群落数据的统计分析，包括基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和相似性分析（ANOSIM）以测试处理效果。距离基于的冗余分析（db-RDA）、Zi-Pi图用于关键分类单元鉴定、线性判别分析效应大小（LEfSe）、正交投影到潜在结构的判别分析（OPLS-DA）和Mantel检验的详细描述见方法S2。

根据P < 0.05（t检验）和投影中的变量重要性（VIP）> 1识别差异丰富的代谢物。使用R 4.4.2中的'plspm'包构建了偏最小二乘路径模型（PLS-PM）（Sanchez等人，2017；Zhou等人，2024）。PLS-PM的变量和路径选择基于先前的相关性分析（例如，特定分类单元和代谢物之间的Spearman相关性）以及对土壤生物地球化学过程的了解。使用适合小样本PLS-PM应用的标准评估模型性能和拟合：（1）整体拟合优度（GoF）指数，计算为平均共有性和平均R2值的几何平均；（2）使用5000次迭代的自举重采样来评估基于95%置信区间的路径系数的稳定性和显著性；（3）内源性潜在变量的R2值以评估解释能力；（4）方差膨胀因子（VIF）以检查指标之间的多重共线性。相关热图使用OriginPro 2021（OriginLab，美国）生成。

3. 结果
3.1. DMPP介导的根际环境变化增强了玉米的氮吸收
DMPP的应用显著改变了根际化学环境。与N处理相比，ND处理使根际土壤pH值降低了0.22个单位，并使DOC增加了84.7%（从175.57 mg kg^-1增加到324.21 mg kg^-1；表S1，P < 0.05）。这些pH值和DOC的显著变化仅限于根际，在 bulk土壤中没有观察到（表S1）。关于氮动态，DMPP应用显著增加了bulk土壤中的NH4+浓度（ND中的71.18 mg kg^-1，而N中的60.87 mg kg^-1，P < 0.05）。然而，在根际，NH4+浓度在ND中数值上低于N（ND中为12.20 mg kg^-1，而N中为27.65 mg kg^-1），而NO3?-N在DMPP处理下也显示出数值下降的趋势；这些差异均未达到统计显著性（P > 0.05，表S1）。在植物水平上，DMPP应用显著增加了总植物氮积累（TNA）和氮回收效率（NRE），分别增加了40.30%和41.10%（图1a和b，P < 0.05）。关联分析显示，植物表现与根际性质的相关性比与bulk土壤更强且更一致（图1c）。TNA和NRE都与根际pH呈显著负相关，并与根际DOC呈正相关（图1c，P < 0.05）。虽然TNA也与bulk土壤pH呈正相关，但植物表现与多个根际变量之间也观察到显著相关性（图1c）。

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图1. 植物氮吸收及其与土壤特性的相关性。（a）不同处理下玉米植物的总氮积累（TNA）和氮回收效率（NRE）：对照组（CK）、氮肥（N）和添加DMPP的氮肥（ND）。数据以均值±标准差（n = 3）表示。不同的大写字母表示处理之间的显著差异（P < 0.05，Tukey的HSD检验）。条形图上的星号表示基于Student's t检验的N和ND处理之间的显著差异（**P < 0.01，*P < 0.05）。（c）植物表现指数（TNA，NRE）与根际（R）和bulk土壤（B）的物理化学性质之间的相关热图。所有相关系数均基于N和ND处理的6个样本（每种处理3个重复）。星号表示显著相关性（*P < 0.05）。DOC：溶解有机碳。SOM：土壤有机质。TN：总氮。NH4+：铵。NO3?：硝酸盐。

3.2. DMPP改变了根际土壤的微生物组组成
DMPP显著重塑了根际细菌群落。双因素ANOVA显示，细菌α多样性指数受到处理、土壤组分及其交互作用的显著影响（表S2）。在根际，ND处理的细菌丰富度（Chao1）和多样性（Shannon指数）最低，Chao1显著低于CK（P < 0.05），Shannon指数也显著低于CK和N（P < 0.05）（图2a，表2）。Ace和Simpson指数显示出相似的模式，ND与CK显著不同（P < 0.05）。在bulk土壤中，处理效应不那么明显。主坐标分析（PCoA）显示ND处理与CK和N明显分开，而CK和N则更接近，有相当大的重叠（图2b）。相似性分析（ANOSIM；R = 0.35，P < 0.05）和排列多元方差分析（PERMANOVA；pseudo-F = 1.62，P < 0.05）确认了三种处理之间根际细菌群落的整体显著差异。
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图2. DMPP诱导的细菌群落多样性和组成的变化。（a）不同处理下根际（R）和bulk土壤（B）的细菌α多样性指数（Chao1和Shannon）的箱形图。（b）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA），显示根际（R）和bulk土壤（B）的整体细菌群落组成。椭圆表示按处理对样品的分组以便于可视化。ANOSIM结果显示根际（R：ANOSIM统计量R = 0.35，P < 0.05）和bulk土壤（B：ANOSIM统计量R = 0.19，P > 0.05）。R统计量的范围从0到1，接近1的值表示组间分离较大，接近0的值表示组间无显著差异。（c）不同组分中优势细菌门的相对丰度。

表2. 不同处理下根际（RS）和bulk土壤（BS）中细菌群落的α多样性指数。
处理 Ace Chao1 Simpson
CK 47 71 1.41 A
N 46 74 7.49 A
0.0030
ND 69 2A 6.92 A*
BS 47 32 4.40 a
46 37 4.70 a
0.0020
b 70 58 8.99 AB**
44 37 3.72 AB*
0.0031
AB 47 47 99 a
46 8.72 a
0.0030
a 69 44 4.36 B*
0.0042 A**
6.73 B**
BS 46 42 37 4.51 1.53 B
0.0042 A**
6.73 B**
BS 46 42 37 12.49 a
0.0030 ab
6.94 b

注：RS：根际土壤；BS：bulk土壤。RS或BS列中的数值后跟着不同的大写或小写字母，根据Tukey的HSD检验（P < 0.05）在不同处理之间显著不同。星号表示在同一处理内RS和BS之间的显著差异（*P < 0.05，**P < 0.01）。Ace、Chao1和Shannon指数的完整双因素ANOVA结果见表S2。
根据OTU分类的结果，每个组分中的优势门类是Actinobacteria（18.3–28.3%）、Proteobacteria（20.2–24.9%）、Acidobacteriota（9.7–16.7%）和Firmicutes（4.9–8.3%），占总读数的70%以上（图2c）。与CK和N处理相比，DMPP应用下根际土壤中Actinobacteria、Proteobacteria和Firmicutes的相对丰度增加，而Acidobacteriota和Chloroflexi的相对丰度降低（图2c）。bulk土壤则显示出相反的趋势。在属水平上，ND处理下的根际形成了一个独特的群集，与CK和N处理区分开来（图S3a）。DMPP显著富集了有益的属，如链霉菌（Streptomyces）、微病毒菌（Microvirga）和诺莫菌属（Nonomuraea）（图S3b，P < 0.05），同时抑制了来自酸杆菌门（Acidobacteriota）和绿弯菌门（Chloroflexi）的几个未分类分类单元。

3.3 根际细菌群落结构与环境变量之间的关系
通过基于距离的冗余分析（db-RDA）研究了根际细菌群落结构与土壤物理化学性质之间的关系。分析表明，根际土壤pH值（R2 = 0.67）和溶解有机碳（DOC）（R2 = 0.70）是导致不同处理间细菌群落显著差异的关键环境因素（图3a，P < 0.05）。此外，回归分析揭示了这些关键因素与α-多样性之间的对比关系（图3b）。具体来说，DOC与Chao1（R2 = 0.54，P < 0.05）和Shannon（R2 = 0.50，P < 0.05）指数呈显著负相关，而pH值与这些指数呈显著正相关（Chao1：R2 = 0.84，P < 0.01；Shannon：R2 = 0.64，P < 0.05）。

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图3. 根际细菌群落的关键环境驱动因素。(a) 基于距离的冗余分析（db-RDA）展示了根际细菌群落结构与土壤物理化学性质之间的关系。实线黑色线条表示与根际细菌群落有显著关联的根际土壤物理化学性质，而虚线灰色线条表示无显著关联。(b) 关键土壤性质（pH，DOC）与细菌α-多样性指数（Chao1，Shannon）之间的线性回归分析。

3.4 DMPP处理下根际网络复杂性的增加和关键分类单元
基于最丰富的200个细菌OTU构建了每个处理的共现网络（图4a）。ND处理在边缘数量、平均度数、平均聚类系数和密度方面均最高，同时在平均路径长度和网络直径方面最低（表S3）。Zi-Pi分析确定诺卡氏菌（OTU3407，放线菌门）是ND网络中的模块枢纽，多个变形菌门OTU是连接者（图S3）。

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图4. 对DMPP响应的微生物网络复杂性和差异分类单元。(a) 不同处理下根际细菌群落的共现网络（最丰富的200个OTU）。节点按门分类标记颜色。(b) 线性判别分析（LDA）效应大小显示ND和ND处理间差异富集的细菌分类单元（LDA得分≥3.0，P < 0.05）。左侧面板：展示从门到属级别的分类差异的系统发育树。红色节点表示在ND处理中显著富集的分类单元，蓝色节点表示在N处理中富集的分类单元，黄色节点表示处理间没有显著差异的分类单元。右侧面板：条形图显示每个差异富集分类单元的LDA得分，条形长度代表效应大小。

空模型分析显示，所有三种处理下的平均聚类系数显著高于随机预期（P < 0.001；表S4）。CK（P = 0.001）和N（P = 0.001）的网络密度显著高于随机水平，而ND（P = 0.999）的网络密度与随机水平没有显著差异。所有处理下的平均路径长度显著长于随机水平（P > 0.999）。

3.5 对DMPP应用响应的特定分类单元生物标志物
使用线性判别分析效应大小（LEfSe）在N与ND比较策略下识别根际土壤中从门到属级别差异富集的细菌分类单元（生物标志物）（P < 0.05，LDA得分≥3.0）。共有46个细菌支系表现出显著富集，在N处理中富集了20个生物标志物，在ND处理中富集了26个生物标志物（图4b）。
LDA结果与先前的分析一致（图2b，图S2）。ND处理的特点是放线菌门（链霉菌科）（Streptomycetaceae）、厚壁菌门（Bacilli纲，Bacillaceae科，Bacillus属）和变形菌门（Rhizobiales目）的显著富集（图4b）。重要的是，之前被确定为DMPP显著增加的属，如链霉菌（Streptomyces）和诺莫菌属（Nonomuraea）（放线菌门），都属于这些富集的高级支系，从而巩固了它们作为关键生物标志物的地位。相反，N处理主要由浮霉菌门（Planctomycetota）和绿弯菌门内的多个谱系（Chloroflexia纲，Caldilineales目、Ardenticatenales目和Chloroflexales目）的富集定义（图4b）。

3.6 与关键微生物分类单元相关的潜在代谢物
利用非靶向代谢组学研究DMPP对根际土壤代谢组的影响。正交投影到潜在结构判别分析（OPLS-DA）模型显示不同处理间代谢物的相对丰度有明显分离（图S4）。根据HMDB分类系统，根际土壤代谢组主要由脂质和类脂质分子（42.53%）、有机杂环化合物（14.66%）和苯族化合物（12.36%）组成（图S5）。N和ND处理之间的重点比较识别出几个关键的差异丰度代谢物（图5a）。与N处理相比，DMPP的应用显著促进了特定代谢物的积累，包括3-羟基己二酸3,6-内酯和(R)-N-甲基萨尔索利诺尔（均为有机杂环化合物）、乙炔酸酯（一种有机酸及其衍生物）和DL-丙二醇二苯甲酸酯（一种苯族化合物）。相反，DMPP的应用显著抑制了其他代谢物的相对丰度，如十八烷酰胺（一种有机酸及其衍生物）、油酰胺和二十二六碳 Hexaenoic acid（均为脂质和类脂质分子）（图5a，P < 0.05）。Mantel测试分析显示DOC与处理间的根际代谢组显著相关（图5b，P < 0.05）。

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图5. DMPP下的根际代谢组重塑及其与溶解有机碳（DOC）的关系。(a) ND处理与N处理相比，根际中显著改变的代谢物。x轴表示log2倍数变化（log2FC），正值表示在ND中丰度较高，负值表示在N中丰度较高。(b) Mantel测试分析确定DOC是与代谢组谱型差异相关的主要物理化学因素。
在N vs ND比较策略下的双因素相关性网络分析显示，根际细菌群落结构与土壤代谢组之间存在密切关联（图S7）。这些交互作用以54.5%的正相关和45.5%的负相关为特征。该网络的中心性系数（表S4）确定了几个与差异代谢物强相关的细菌属。这些重要分类单元包括来自绿弯菌门（例如，norank_f__Caldilineaceae）、微病毒菌（Microvirga）、中根瘤菌（Mesorhizobium）、异根瘤菌-新根瘤菌-副根瘤菌-根瘤菌（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）和诺莫菌属（Nonomuraea）的未分类属。观察到特定的关联（图S8）：例如，十八烷酰胺和油酰胺的抑制与链霉菌（Streptomyces）和中根瘤菌（Mesorhizobium）的富集相关，而(R)-N-甲基萨尔索利诺尔的积累与微病毒菌（Microvirga）和中根瘤菌（Mesorhizobium）呈正相关。

3.7 DMPP介导的植物-微生物相互作用的级联效应
为了阐明DMPP增强氮回收（NRE）的机制级联，我们建立了一个偏最小二乘路径模型（PLS-PM），整合了关键的根际组分（图6）。该模型整体拟合良好（拟合优度指数=0.66），有效捕捉了由DMPP应用引发的连续效应。

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图6. DMPP增强氮回收的机制路径。偏最小二乘路径模型（PLS-PM）说明了由DMPP应用引发的因果关系和提出的级联效应。路径系数及其显著性水平分别用*P < 0.05和**P < 0.01表示。蓝色和红色箭头分别表示显著的正面和负面影响。灰色箭头表示非显著路径。箭头厚度与路径系数的大小成正比。
建立的PLS-PM用于阐明DMPP效应的机制级联，显示DMPP应用对根际pH值有显著的负路径系数（P < 0.01）。根际pH值又对代谢组组成有显著的负路径系数（P < 0.01）。代谢组对细菌群落和DOC含量有显著的正面路径系数，DOC也对细菌群落有显著的正面路径系数（P < 0.05）。最终，细菌群落对植物氮回收（NRE）有显著的正面路径系数（P < 0.05）。所有路径系数均在图6中展示。

4. 讨论
4.1 DMPP引起的酸化和碳富集塑造了根际微环境
目前的发现表明，DMPP的应用引发了根际化学环境的显著重塑，其特征是pH值的显著降低和DOC的同步增加（图6，表S1）。这种耦合变化代表了根区生物地球化学的根本变化，从而驱动了随后的微生物和植物响应。
观察到的土壤酸化可以归因于由硝化抑制引起的多方面机制。主要通过减缓NH4+向NO3?的微生物氧化，DMPP改变了土壤溶液中主要的氮形式。这通过ND处理下土壤中NH4+浓度显著高于N处理得到证实（71.18对比60.87 mg kg?1，表S1），证实了有效的硝化抑制。随后植物优先吸收NH4+而非NO3?是一个众所周知的过程，导致阳离子的过量摄入，迫使植物向根际释放H+离子以维持电化学平衡（Meier等人，2020）。与此机制一致，ND处理下的根际NH4+浓度在数值上低于N处理（12.20对比27.65 mg kg?1，P > 0.05，表S1），反映了DMPP下植物对NH4+的增强吸收。这种模式——土壤中NH4+含量较高，但根际中NH4+含量较低（尽管不显著）——解释了这一明显的悖论：DMPP有效抑制了硝化作用，同时保留了土壤中的NH4+，而根际作为活性养分吸收的场所，由于植物吸收的增加而趋于NH4+的耗尽（Li等人，2023a）。在这个吸收过程中释放的H+离子驱动了ND根际中观察到的局部pH下降。这种植物驱动的酸化与DMPP在土壤中的效应形成对比，在土壤中，抑制产生质子的硝化过程短期内减少了酸度的关键来源（Qiao等人，2015）。这解释了为什么DMPP没有使土壤酸化（N处理的pH为8.03，ND处理的pH为8.09，表S1），与报告中DMPP通过减缓硝化作用减轻土壤酸化的结果一致（Luchibia等人，2020；Li等人，2023a）。
目前的结果表明，在根际中，植物对NH4+的生理响应主导了净酸化效应，强调了在评估硝化抑制剂生物地球化学影响时区分土壤和根际过程的重要性。这种局部pH下降至关重要，因为它是一个控制微生物群落组成、酶活性和养分溶解度的主调节器（Wang和Kuzyakov，2024）。根际pH值与植物N积累和NRE之间的强负相关强调了其作为N吸收增强途径启动器的重要作用（图1c）。
同时，DMPP处理下根际DOC的显著增加表明碳可用性的动态变化。虽然这种增加通常归因于根系分泌物对N形式改变的响应（Novak等人，2024），但也应考虑土壤有机质（SOM）分解的潜在贡献。在本研究中，根际SOM从N处理的18.38 g kg?1略微下降到ND处理的18.11 g kg?1（表S1），从化学计量学上足以解释观察到的DOC增加的相当部分。因此，由于根系来源碳输入的“启动效应”可能刺激的SOM矿化增强也可能有助于DOC池的增加（Wang和Kuzyakov，2024）。这两种机制可能同时起作用：DMPP引起的变化可能刺激根系分泌物，提供可分解的碳，促使微生物群落分解天然SOM（Sokol等人，2022；Sahil等人，2025），从而释放额外的DOC。这种相互作用创造了一个潜在的反馈循环，其中微生物活动既响应又塑造了DOC的动态。db-RDA分析确定pH和DOC是与细菌群落结构变化相关的主要环境因素（图3a）。这种根际环境的重塑超出了DMPP仅调节N形式的传统观点，强调了它在触发植物与其微生物组之间更广泛生化对话中的作用。
虽然DMPP引起的DOC增加通过促进有益微生物活动增强了植物的N吸收，但升高的DOC也可能成为反硝化菌的碳来源。在厌氧或水淹条件下，这种额外的碳供应可能刺激反硝化作用（Tang等人，2024），可能导致气态氮的损失（N2O + N2），从而降低DMPP在减轻总氮损失方面的有效性。然而，反硝化的增加并不总是导致更高的N2O排放。反硝化的最终产物严重依赖于氧的可用性、DOC与NO3?的比率以及一氧化二氮还原酶（NosZ）的丰度和活性（Shan等人，2021；Li等人，2024a）。在某些情况下，DMPP已被证明会增加携带nosZ的反硝化菌的相对丰度，并降低N2O/(N2O + N2)比率，从而有利于完全反硝化为N2（Torralbo等人，2017）。DMPP还可能改变DOC与NO3?的比例：在我们的研究中，土壤中的NH4+含量增加，而NO3?含量趋于下降，这可能会使DOC与NO3?的比例向更高的方向偏移，从而可能促进反硝化作用，但并不一定导致N2O的排放。因此，DMPP应用的净农学和环境后果——即它是否减少、不变或甚至略微增加N2O的排放——取决于具体情境，并会受到土壤湿度、温度和本土微生物群落组成的影响。这种复杂性有助于解释不同田间研究中报告的硝化抑制剂效果的不同（Tariq等人，2022年；Liu等人，2025b年）。未来研究需要结合植物氮吸收、N2O和N2排放、DOC与NO3?动态以及反硝化细菌群落功能基因（特别是nosZ）的同步测量，以解决这些相互作用问题。

4.2. 根际微生物组的重塑和微生物相互作用的增强
DMPP的应用显著降低了根际细菌的α多样性（图2a）。这种下降可能是由于DMPP引起的根际环境变化导致的筛选作用。较低的pH值和升高的DOC浓度创造了一个独特的化学生态位，可能有利于某些细菌种类的生存，同时抑制了敏感菌类（Morrissey等人，2023年；Duan等人，2025年）。这种筛选作用可以解释总体多样性的降低以及富集大量营养型细菌（如放线菌门和变形菌门）的现象，同时抑制了寡营养型菌类（如酸杆菌门和绿弯菌门）（图2c）。在资源条件改变的情况下，敏感菌类的损失为这些模式提供了一个简洁的解释（Yan等人，2025年），而目前缺乏直接证据表明植物参与了这一过程。像链霉菌和芽孢杆菌这样的菌属的富集表明，在DMPP的作用下，有机氮的矿化潜力得到了增强（Zhu等人，2024年；Shao等人，2025年；Pantigoso等人，2025年）。同样，与固氮和促进植物生长相关的Microvirga和Mesorhizobium的增殖表明，微生物功能可能发生了转变，以补充植物的氮营养（Han等人，2020年；Zhang等人，2025年）。值得注意的是，本研究主要关注细菌群落，因为细菌是根际过程的主要驱动者，包括有机物分解、代谢物交换和促进植物生长（Philippot等人，2013年；Khan等人，2021年）。虽然反氨氧化菌（AOA）参与硝化作用，但在不同研究中AOA和反硝化氧化菌（AOB）在碱性土壤中的相对优势各不相同。许多研究表明，在碱性农业土壤中AOB通常占据主导地位（Prosser和Nicol，2012年；Yin等人，2022年），但也有一些情况下即使在高pH值下AOA也起重要作用（Guardia等人，2024年）。关于DMPP，多条证据表明它主要针对AOB而不是AOB（Kleineidam等人，2011年；Lei等人，2025年），尽管这也可能取决于土壤特性和实验条件。鉴于细菌在根际过程中的核心作用，我们关注细菌群落是合理的。然而，未来研究如果结合使用针对古菌的方法（例如，古菌amoA基因分析）在不同的土壤类型中进行研究，将进一步阐明AOA在DMPP作用下对硝化抑制和根际氮循环的潜在贡献。

除了分类学上的变化之外，共现网络分析还提供了关于DMPP效应背后微生物相互作用的更深入见解。零模型比较显示，所有三个网络的聚类系数显著高于随机预期（P < 0.001；表S4），表明细菌的共现模式是由确定性过程而非随机组装形成的（Li等人，2023b年；Jiang等人，2025年）。然而，不同处理之间的随机性偏差有所不同：在CK和N处理中网络密度显著高于随机水平（P = 0.001），但在ND处理中则没有这种差异（P = 0.999）。这表明尽管DMPP处理后的网络仍保持非随机聚类，但非随机正关联的程度可能比未处理时降低。ND处理下观察到的较低平均路径长度进一步支持了更集成的网络结构，即使非随机密度降低（Li等人，2025年）。通过Zi-Pi分析确定的关键菌类在DMPP形成的网络中具有独特的拓扑作用（图S4）。唯一的模块中心是OTU3407，属于放线菌门的诺卡氏菌。来自变形菌门的多个OTU起到了连接者的作用，包括OTU3319（属于TRA3-20家族）、OTU3602（酸杆菌）、OTU3921和OTU5226（赖氏菌）、OTU3978（东氏菌）。此外，属于放线菌门的Sporichthyaceae家族的OTU4589也被识别为连接者。这些菌类可能协调关键的生物过程，如有机物分解和代谢物交换，从而形成更有效的养分循环途径，有利于植物（Jiang等人，2024年；Yu等人，2025年）。值得注意的是，最近的研究表明诺卡氏菌是影响土壤生态系统稳定性的关键菌类（Wang等人，2024年）。

将这些关键菌类与LEfSe识别的生物标志物进行比较（图4b）揭示了重要区别。诺卡氏菌和Sporichthyaceae属于在ND处理中显著富集的放线菌门。然而，大多数变形菌门的连接者——酸杆菌、赖氏菌和东氏菌——并未被单独检测为富集的生物标志物，尽管它们属于富集的菌门。这突显了网络分析和差异丰度分析的互补性质：LEfSe识别出丰度发生变化的菌类，而网络分析则揭示了无论其丰度如何变化都具有重要组织作用的菌类（Zheng等人，2021年）。此外，ND处理下26个生物标志物的富集进一步证实DMPP显著重塑了根际微生物群落，使其更倾向于富集大量营养型和有益于植物的菌类。

4.3. 代谢组重编程促进了植物-微生物之间的对话
本研究采用的非靶向代谢组学方法直接将根际化学变化与重新构建的微生物组联系起来，有效地解码了DMPP影响下植物-微生物对话的生化语言（Baker等人，2024年）。处理之间代谢物谱的分明差异表明（图S5），Mantel测试分析显示DOC与整体代谢组之间存在显著相关性（图5b，P < 0.05）。这与最近的研究结果一致，即根际DOC浓度和代谢物谱在根系-土壤相互作用过程中紧密相关（Wen等人，2022年）。鉴于DOC是一个包含许多在代谢组学分析中测量的相同代谢物的综合指标，这种相关性反映了组成关系而非单向的驱动-效应关系。根系产生的化合物和微生物产生的代谢物共同构成了DOC池，并共同塑造了代谢物谱（Fan等人，2025年）。最近的原位测量显示，虽然根系出现时总的根际DOC增加，但特定的化合物组成，尤其是糖类和有机酸，与根际过程的变化更为相关（Garcia Arredondo等人，2024年）。某些有机杂环化合物和有机酸的特定促进作用，以及各种脂类和有机酸衍生物的同时抑制作用（图5a），表明根际生化景观发生了靶向重塑。相关性网络和Spearman分析证实了这些代谢变化与富集细菌菌类之间的紧密联系（图5c，图S6）。例如，十八烷胺和油胺等代谢物的抑制与链霉菌和中等根瘤菌等有益菌类的增殖有关。虽然这些化合物具有抗菌特性（Casillas-Vargas等人，2021年），但链霉菌本身也是主要的抗菌物质生产者，这表明可能有其他解释（Huang等人，2024年）；这些代谢物可能作为碳源被富集的微生物群落利用。相反，(R)-N-Methylsalsolinol的积累与Microvirga和中等根瘤菌的丰度正相关。这种化合物或其代谢前体可能作为碳和氮的特定来源，或作为刺激这些有益变形菌属生长和活性的信号（Seitz等人，2024年；Chen等人，2025年）。或者，其积累可能是富集微生物群落代谢活动的结果，代表了DMPP诱导的微生物群落的特征（Dong等人，2024年）。本质上，DMPP下的改变代谢组反映了植物来源化合物（如根系分泌物）、微生物产生的代谢物以及SOM分解产物的综合贡献（Fan等人，2025年）。这种复杂的化学环境精选了功能性的微生物群落，而微生物活动可能通过代谢转化和有机物质周转反过来影响代谢物谱，突显了根际植物-微生物相互作用的动态和互惠性质（Zhuang等人，2024年；Fan等人，2025年）。

4.4. 对DMPP增强氮回收的综合性机制洞察
部分最小二乘路径模型（PLS-PM）提供了一个连贯的机制框架，阐明了DMPP通过连续的根际改变增强氮回收（NRE）的潜在机制（图6）。该模型表明，DMPP的应用与根际pH值的显著降低有关（P < 0.01）。这种pH变化应被视为DMPP下植物-微生物-氮循环相互作用的共同结果，特别是增强了植物的NH4+吸收（Meier等人，2020年），同时抑制了硝化作用（Qiao等人，2015年），而不是抑制剂本身的直接影响。随后降低的pH值成为根际代谢组重大重组的主要驱动力（P < 0.01），突显了土壤pH值对根系分泌物和更广泛的土壤代谢物池的生化组成的深远影响（Li等人，2024b）。改变的代谢物谱直接促进了有益细菌群的选择性富集（图6），并同时增加了根际DOC含量（P < 0.05）。由于DOC是一个包含许多在代谢组学分析中测量的相同化合物的综合指标，这种关联部分反映了数学上的包含关系（Delory等人，2024年）。碳可用性的增加支持了选择性富集细菌的生长，形成了正反馈循环。PLS-PM捕捉到了主要的方向路径，但代表了更复杂动态系统的简化描述（Fan等人，2016年）。虽然未对诸如增强植物表现影响根系分泌物或微生物活动改变代谢物谱的反馈进行建模，但这些反馈在体内很可能确实存在。从细菌群落到NRE的强正路径系数（0.87，P < 0.05）表明DMPP形成的微生物联盟与氮吸收增强之间存在稳健的统计联系，支持了所提出的机制级联。尽管基于16S rRNA分类数据（捕捉群落结构），但这种组成变化被广泛认为是根际研究中功能潜力的指标（Sun等人，2025年）。未来研究如果结合使用功能基因标记物（如amoA、nifH、nirK/nosZ），将有助于揭示潜在的代谢途径，从而补充这些发现。从pH值到微生物组的弱直接路径相对于代谢物介导的路径反映了pH值通过重塑化学环境的间接效应（Wang和Kuzyakov，2024年），揭示了该研究的一个关键机制途径。我们还注意到，pH值、DOC和代谢物之间的共线性是这些生物地球化学关系的固有特征，并不削弱模型的有效性。下一步的重要工作将是评估该模型在不同土壤条件和功能上的稳健性，并验证所识别关键菌类和代谢物的作用。这样的研究将确定这一机制的普遍原则和情境依赖性细节，最终有助于设计下一代硝化管理策略。

5. 结论
本研究概述了一种系统的植物-微生物-土壤相互作用级联，通过该机制硝化抑制剂DMPP提高了玉米的氮回收效率。该机制始于DMPP诱导的酸化作用，推动了根际代谢组的深刻重组。这些代谢变化随后增加了溶解有机碳（DOC），并直接促进了有益细菌群（如链霉菌、Microvirga）的选择性富集。这个特定的复杂细菌群的组装被定量验证为植物氮吸收改善的直接驱动因素。这些发现表明，DMPP作为一个根际工程师，利用植物-微生物-土壤的反馈来提高氮利用效率。这里提出的级联模型提供了一个新颖且可测试的框架。未来研究需要在不同土壤和作物基因型中验证这一模型，以将这些机制见解转化为广泛适用和精确的氮管理策略。

**作者贡献声明**
吉林雷：撰写 - 审稿和编辑，撰写 - 原始草稿，可视化，调查，正式分析，数据管理，概念化。
管提坤：软件，调查，正式分析。
臧敏：方法论，正式分析。
刘睿：撰写 - 审稿和编辑，验证，监督，项目管理，资金筹集。