土壤类型调节稻田中甲烷氧化菌群落的随机组装过程及其甲烷氧化活性

《Geoderma》：Soil type modulates stochastic assembly of methanotrophic communities and methane oxidation activity in paddy fields

　　叶林霖|姜耿波|金婉仪|李天|卢嘉楠|余汉普|马敬辉|郑世亭|王丹飞|王世忠|唐业涛|邱荣亮|赵远清
中山大学环境科学与工程学院，广州510006，中国

摘要
微生物介导的甲烷（CH4）氧化对全球气候变化产生影响，而稻田土壤是主要的缓解热点。土壤类型从根本上决定了微生物群落的结构，其在调控稻田中甲烷氧化菌的组装和CH4氧化潜力方面的作用仍不明确。本研究在中国广泛的气候梯度范围内，调查了三种主要稻田土壤（黑土、黄土和红土）中的甲烷氧化菌。我们发现，黑土中的CH4氧化潜力和pmoA基因丰度显著更高，这些黑土主要由I型甲烷氧化菌（Methylobacter）主导，而黄土和红土则主要由II型甲烷氧化菌（Methylocystis）主导。这种生物地理模式主要是由气候（年平均温度MAT）和土壤养分（碳和氮）的协同效应驱动的。一个显著的发现是，厌氧甲烷氧化菌Methylomirabilis (NC10) 在黄土中尤为突出。甲烷氧化菌的组装过程受随机因素的影响较大，且随着年平均温度的升高，这种随机性从黑土增加到红土。此外，功能预测表明，黑土中关键的CH4氧化酶（如pMMO和sMMO）的丰度最高，这与测得的氧化潜力一致。我们的研究表明，土壤类型通过筛选甲烷氧化菌群落来调节CH4氧化，进而影响其组装过程和关键物种的组成。因此，整合这些特定于土壤的微生物机制对于预测CH4的反馈效应至关重要。

1. 引言
甲烷（CH4）是一种强效的温室气体，在100年的时间范围内其全球变暖潜力是二氧化碳（CO2）的28倍（Saunois等人，2020年；IPCC，2023年）。减少CH4排放是应对气候变化的关键策略。稻田是大气中CH4的主要来源，约占全球排放量的30%（IPCC，2023年）。实际上，稻田的净CH4通量不仅取决于甲烷生成过程，还受到甲烷氧化菌这一微生物吸收过程的关键调控。
在稻田土壤中，甲烷氧化菌可分为两大类：I型（γ-变形菌）和II型（α-变形菌）（Strong等人，2015年；He等人，2021年）。它们通过一系列酶促反应氧化甲烷（Falkowski等人，2008年；Madigan等人，2021年），其中关键酶包括甲烷单加氧酶（MMO）、甲醇脱氢酶（MDH）和甲醛脱氢酶（FDH）。pmoA基因编码颗粒状甲烷单加氧酶（pMMO）的β亚基，大多数甲烷氧化菌都含有该基因，是识别甲烷氧化菌的理想标记物（McDonald等人，2008年；Knief，2015年）。这些功能基因和酶构成了研究甲烷氧化菌及其氧化潜力的基础。
甲烷氧化菌的活性和分布受多种环境因素的复杂影响，包括氧气浓度、pH值、温度和盐度（He等人，2012年；Aronson等人，2013年；Kou等人，2017年；Osudar等人，2017年）。值得注意的是，I型和II型甲烷氧化菌通常具有不同的生态策略（Siljanen等人，2011年；Ho等人，2013年）。作为世界上最大的水稻生产国，中国的稻田生态系统具有高度的空间异质性，涵盖了从中温黑土到暖温黄土，再到热带/亚热带红土的各种土壤类型。土壤类型整合了气候和物理化学特性以及相关的生物地球化学过程（Fierer和Jackson，2006年）。这种内在的异质性充当了强大的环境过滤器，调节了底物和养分的可获得性，从而驱动了甲烷氧化菌丰度、群落结构以及最终的CH4氧化潜力在地理上的差异。然而，关于土壤类型对甲烷氧化菌的调控机制，目前报道仍然不足。
甲烷氧化菌并非孤立存在，而是嵌入在复杂的土壤微生物共存网络中（Ho等人，2018年）。在这些网络中，某些“关键物种”对其群落结构和稳定性的影响远超其相对丰度（Berry和Widder，2014年；Banerjee等人，2018年；Jiang等人，2025a）。因此，明确不同稻田土壤中甲烷氧化菌是否充当关键物种，以及哪些类型扮演这一角色，将极大地加深我们对微生物调控CH4通量的理解。此外，微生物群落的组装过程受确定性（基于生态位）和随机性（中性）过程的共同作用（Zhou和Ning，2017年；Tripathi等人，2018年；Xun等人，2019年）的影响，这些过程的相对重要性决定了群落结构，进而影响生态系统功能（Luan等人，2020年；Jiao等人，2021年）。评估不同土壤类型间的组装过程对于准确预测甲烷氧化菌的生物地理分布和功能至关重要。我们假设土壤类型作为整合大尺度气候和养分梯度的复合矩阵，通过筛选甲烷氧化菌群落来改变组装过程的平衡，重塑微生物网络，并最终调节功能基因的丰度和CH4氧化潜力。为了验证这一假设，我们在中国广泛的气候梯度范围内，对三种主要稻田土壤（黑土、黄土和红土）进行了微宇宙培养和微生物组分析。具体目标包括：（1）阐明这些土壤类型之间的CH4氧化潜力、甲烷氧化菌丰度和群落结构的差异；（2）识别驱动这些变化的关键环境因素，并量化确定性过程与随机过程对其组装的相对贡献；（3）解析甲烷氧化菌在微生物共存网络中的生态作用，并将这些生态模式与关键功能基因的丰度联系起来。本研究旨在揭示土壤类型通过何种微生物机制调节稻田中的CH4氧化，为基于土壤微生物组的CH4减排策略提供理论基础。

2. 材料与方法
2.1. 研究区域与采样
土壤样本来自中国的主要水稻生产区，包括三种不同的土壤类型：黑土、黄土和红土。采样地点覆盖了广泛的纬度（19.89°N至49.47°N）和经度（106.31°E至132.57°E）范围，涵盖了我国中温、暖温和亚热带/热带气候区90%以上的稻田面积。这些地区具有显著的气候梯度，年平均降水量（MAP）介于429.8毫米至1500.5毫米之间，年平均温度（MAT）介于1.4℃至24.3℃之间。我们的采样策略旨在确保对这些环境梯度的全面覆盖。样本来自中国的11个省份的12个地点，在每个地点至少设置了三個相距50米的样方作为生物学重复。所有样本均在收获后的排水期采集（根据不同气候区的变化，时间从7月到11月，以确保生理阶段的一致性），因为这一时期能够捕获最大的CH4氧化潜力和相对稳定的甲烷氧化菌群落（Reim等人，2012年；Ma等人，2013年）。从每个样方随机采集5个土芯（顶部20厘米），合并成一个复合样本。新鲜土壤样本用冰块运输到实验室。每个复合样本进一步分为三个子样本：一个在4℃下保存用于CH4氧化活性分析，另一个在-20℃下保存用于微生物DNA提取和分子分析，剩余的样本风干用于土壤物理化学分析。详细的采样地点信息和土壤物理化学性质见表S1和S2。气象数据来自国家气象信息中心，用于计算每个采样点的MAT、MAP和年平均湿度。
2.2. 甲烷氧化潜力的测定
使用实验室微宇宙培养测定了稻田土壤样本的甲烷氧化潜力。具体方法是将7.0克（干重当量）均匀放置在120毫升血清瓶底部，加入超纯水使土壤水分达到其最大持水能力的60%，以模拟非淹没排水期间的最佳通气和水分平衡状态（Cai等人，2016年；Ding等人，2024年）。瓶子在黑暗中预培养48小时以重新激活甲烷氧化菌活性。随后用丁基橡胶塞密封瓶子，并用铝盖压紧。从每个瓶中抽取1.2毫升环境空气，然后替换为1.2毫升高纯度CH4，使初始顶空CH4浓度约为1%（10,000 μL·L^-1）。每个样本制备三个重复实验。待气体平衡后，使用气相色谱仪（GC-2014，SHIMADZU，日本）测量初始CH4浓度。所有培养都在黑暗中25℃下静态进行。每隔24小时采集一次顶空气体样本以监测CH4浓度。当注射的CH4消耗超过95%时终止培养。CH4氧化潜力通过CH4浓度随培养时间线性减少的斜率计算得出（Shrestha等人，2012年）。
2.3. 物理化学分析
按照标准协议，测量土壤在水-土悬液（1:2.5，w/v）中的pH值。总有机碳（TOC）和总氮（TN）使用元素分析仪（Vario EL Cube，Elementar，德国）测定。土壤中的铵氮（NH4+-N）和硝酸盐氮（NO3?-N）浓度用1 M KCl提取，并根据中国国家环保标准（HJ634-2012和GB/T32737-2016）进行测定。土壤水分含量通过将5克新鲜土壤在105℃下干燥至恒重来确定，并计算重量损失百分比。风干的土壤样本用王水在微波消化系统中消化，然后使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-OES，Thermo，美国）测定总磷（TP）、总钾（TK）及其他元素的浓度。
2.4. DNA提取、pmoA基因扩增和测序
根据制造商的说明书，使用FastDNA? SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，法国）从培养的稻田土壤中提取总基因组DNA。使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美国）通过分光光度法验证提取DNA的浓度和质量。使用引物对A189f/mb661r定量甲烷氧化菌功能基因pmoA的丰度。定量PCR（qPCR）反应混合物（总体积20 μL）包含10 μL TB Green? Premix Ex Taq?（Takara），各0.5 μL正向和反向引物（10 μmol·L^-1），1 μL DNA模板和8 μL无菌水。pmoA基因的扩增条件为：95℃预热3分钟；94℃循环30次，每次30秒；54.5℃循环30秒；72℃循环45秒；最后在72℃延伸10分钟。通过熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增的特异性和效率。所有扩增的效率在80%至100%之间，R2值介于0.990至0.999之间（Applied Biosystems QuantStudio 5 qPCR系统，美国）。对于细菌群落分析，使用条形码通用引物515F和907R扩增16S rRNA基因V4-V5高变区（Stubner，2002年）。所得PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用EZNA Gel Extraction Kit（Omega，美国）纯化。根据制造商的建议，使用NEBNext? Ultra? DNA Library Prep Kit（New England Biolabs，MA，美国）构建测序文库。纯化的文库以等摩尔量合并，并在Illumina HiSeq 2500平台上进行测序，生成双端读取序列。
2.5. 生物信息学分析
本研究的原始序列存储在NCBI Sequence Read Archive（SRA）中，访问号为PRJNA1365792。36个土壤样本的原始序列读长约为40,615至72,749个，经质量过滤后平均为57,012个。使用QIIME2流程（Bolyen等人，2019年）处理原始测序读段。简要来说，对读段进行质量过滤和修剪以获得高质量的清洁读段，然后合并成标签。去除嵌合体以产生最终的清洁标签。这些标签在97%相似度阈值下聚类为操作分类单元（OTUs）。使用RDP Classifier（Wang等人，2007年）根据核糖体数据库项目对OTUs进行分类注释。所有后续统计分析都在R环境（v4.0.2）中进行。为了确保样本间的可比性，在进行下游多样性分析之前，根据读数最少的样本将OTU表简化为均匀的测序深度。甲烷氧化菌群落的α多样性指数是使用vegan包计算的。β多样性是通过基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）来评估的。相关性热图分析计算环境因素与优势甲烷氧化菌属之间的皮尔逊相关性系数，然后通过热图以直观的方式呈现获得的数值矩阵。随机森林（randomForest）包被用来评估环境因素在解释甲烷氧化菌群落组成变化中的相对重要性（Subramanian等人，2014年），其中树的数目（ntree）设置为1,000。使用百分比增加的均方误差（%IncMSE）来评估预测因子的显著性。此外，还使用vegan包中的varpart函数进行了变异分割分析（VPA），以量化气候因素和土壤物理化学性质对甲烷氧化菌群落变化的个别和协同贡献。在属级别构建了共现网络以识别关键物种。在去除稀有物种后，使用R（v4.0.2）中的WGCNA包基于Spearman相关性分析构建了初始物种关联矩阵（Langfelder和Horvath，2008年）。随后对这个矩阵进行了反卷积，并使用RMThreshold包来确定构建网络的显著性阈值（p < 0.05）和Spearman相关性强度阈值（r > 0.85）。最终网络使用Gephi（v0.9.2）（Bastian等人，2009年）进行可视化，其中计算了网络拓扑属性以评估网络复杂性。使用Gephi中包含的Louvain算法识别网络模块。应用Sloan中性群落模型（NCM）来量化决定性和随机过程在甲烷氧化菌群落组装中的相对作用（Sloan等人，2006年）。此外，使用NST包基于Bray-Curtis差异计算了标准化随机性比率（NST），并进行了999次随机排列。NST值大于50%表明组装以随机性为主，而NST值小于50%表明组装以决定性为主（Ning等人，2019年）。为了量化决定性和随机过程在甲烷氧化菌群落组装中的相对重要性，我们使用了集成的R包microeco（Liu等人，2021年）。具体来说，利用trans_nullmodel类进行了999次随机化的零模型模拟。计算了β-最近分类单元指数（βNTI）来评估系统发育转变，其中|βNTI| ≥ 2表示决定性过程（变量选择或同质选择），而|βNTI| < 2表示随机过程（Stegen等人，2012年）。为了进一步划分随机成分，我们使用相同的包基于Bray-Curtis差异计算了Raup–Crick指数（RCbray）。根据Stegen等人（2013年）描述的框架，确定了五种不同的组装过程：变量选择（βNTI > 2）、同质选择（βNTI < -2）、扩散限制（|βNTI| < 2且RCbray > 0.95）、均质化扩散（|βNTI| < 2且RCbray < -0.95）以及漂变（及其他）（|βNTI| < 2且|RCbray| < 0.95）。使用FAPROTAX数据库预测了甲烷氧化菌群落的功能潜力。PICRUSt2用于预测参与甲烷氧化途径的关键酶的丰度，酶委员会（EC）编号和基因丰度基于京都基因组和基因组百科全书（KEGG）数据库进行映射（Douglas等人，2020年）。

2.6. 统计分析
统计分析使用SPSS（v26.0）进行。首先进行单因素方差分析（ANOVA），然后使用Duncan的多重范围测试来确定处理均值之间的显著差异。进行皮尔逊相关性分析以识别变量之间的显著线性关系。所有测试中，p值小于0.05（p < 0.05）被视为统计学上显著的。使用vegan包中的adonis函数通过999次排列进行置换多元方差分析（PERMANOVA）来测试不同土壤类型间群落结构差异的统计显著性。

3. 结果
3.1. CH4氧化潜力和pmoA基因丰度
三种水稻土类型的CH4氧化潜力范围从0.758到1.439 ng g?1 dry soil h?1。黑土中的CH4氧化潜力（1.040 ng g?1 dry soil h?1）显著高于黄土（0.852 ng g?1 dry soil h?1）和红土（0.909 ng g?1 dry soil h?1），后两者之间没有显著差异（图1a）。pmoA基因的丰度从黑土（9.042 × 106 copies g?1）显著减少到黄土（4.780 × 106 copies g?1），再到红土（6.564 × 106 copies g?1）（图1b）。发现pmoA基因丰度与CH4氧化潜力之间存在显著的正相关（R2 = 0.33，p = 0.00023），表明甲烷氧化菌关键功能基因的丰度是决定CH4氧化活性的基本因素（图1c）。

3.2. 甲烷氧化菌的多样性和组成
如Shannon和观察丰富度（Sobs）指数所示，黑土中的甲烷氧化菌多样性（1.508 ± 0.389和7.667 ± 2.741）显著高于黄土（0.964 ± 0.389和5.417 ± 1.443）和红土（0.886 ± 0.93和5.004 ± 1.651）（p < 0.01和p < 0.05；图2a，b）。其他多样性指数也观察到了类似的趋势，包括Simpson和Pielou_e多样性指数（图S1）。土壤类型也显著影响了甲烷氧化菌群落的组成。I型甲烷氧化菌Methylobacter的相对丰度在黑土中最高，而II型甲烷氧化菌Methylocystis在黄土和红土中占主导地位（图2c）。具体来说，与黑土相比，黄土中Methylocystis的相对丰度增加了104.99%，红土中增加了145.07%。相反，I型甲烷氧化菌Methylobacter、Methylomonas和Methylosarcina的相对丰度在黄土和红土中显著降低。与黑土相比，Methylobacter在黄土中减少了92.86%，在红土中减少了94.64%；Methylomonas分别减少了21.42%和64.28%；Methylosarcina分别减少了49.98%和83.3%。主坐标分析（PCoA）进一步证实了水稻土中甲烷氧化菌群落结构的显著差异（R2 = 0.436，p = 0.001；图2d），前两个轴分别解释了总变异的72.89%和10.17%。这种明显的差异表明土壤类型对甲烷氧化菌群落具有强烈的环境筛选作用。

3.3. 不同甲烷氧化菌群落的驱动因素
Spearman相关性分析揭示了优势甲烷氧化菌属与关键环境因素之间的不同关系。II型甲烷氧化菌Methylocystis和I型Methylocaldum与气候因素（MAT和MAP）及NH4+显著正相关，而I型Methylomonas则表现出相反的趋势（p < 0.05）。相比之下，Methylobacter（I型）主要受土壤养分的影响，与TN和TP呈正相关（p < 0.01）。Crenothrix仅与pH显著相关（p < 0.05）（图3a）。随机森林建模确定MAT是甲烷氧化菌群落变化的最关键预测因子（IncMSE = 11.19%），其次是MAP（8.94%）和TP（7.46%）以及TN（6.99%）（图3b）。为了量化区域气候和土壤物理化学性质的个别和协同效应，我们进行了变异分割分析（VPA）。结果表明，气候（MAT和MAP）和土壤物理化学性质（pH、TOC、TN、TP、TK、NH4+和NO3?）分别独立解释了21.44%和15.56%的甲烷氧化菌群落变化，同时存在显著的交互效应（15.92%）（图3c）。这些发现证实了土壤类型代表了复合的生态过滤器，其中区域气候和局部土壤性质在塑造甲烷氧化菌群落中起着关键和协同作用。

3.4. 甲烷氧化菌的群落组装和相互作用
为了评估不同水稻土中甲烷氧化菌的生态作用，我们在属级别构建了微生物共现网络以识别关键分类单元。关于网络拓扑和甲烷氧化菌参与的详细信息在表S4中提供。在过滤掉稀有物种后，参与这些网络的甲烷氧化菌主要隶属于三个谱系：Methylobacter（I型）、Methylomirabilis（NC10门）和Methylocystis（II型）。其中，Methylocystis（II型）几乎存在于所有网络中。尽管NC10门的厌氧甲烷氧化菌通常在土壤中难以检测，但Methylomirabilis在黄土网络中被识别为关键物种。这一发现进一步强调了土壤类型在定义甲烷氧化菌群落整体结构中的作用。我们应用了中性群落模型（NCM）来量化决定性和随机过程对甲烷氧化菌组装的相对贡献。该模型分析了分类单元出现频率与其相对丰度之间的关系。对于所有三种土壤类型，高拟合优度（R2）表明群落组装主要由随机过程控制。从黑土到黄土再到红土，随机性的影响逐渐增加（分别为0.784、0.831和0.893）（图5a，b，c）。为了进一步提供这些组装过程的机制洞察，我们整合了βNTI和RCbray数据。一致地，零模型分析显示随机过程在所有土壤类型中都主导了甲烷氧化菌群落的组装，其相对贡献范围从90.62%到98.15%。具体来说，生态漂变（及其他）被确定为最显著的随机成分，在黑土中占86.72%，在黄土中占93.60%，在红土中占96.77%（图S4）。这些模式得到了标准化随机性比率（NST）分析的证实，红土中的NST值显著高于黑土或黄土（图5d）。总体而言，这些结果表明土壤类型显著改变了水稻土中甲烷氧化菌组装中随机和决定过程之间的平衡。

3.5. 土壤类型调节CH4氧化途径和功能基因丰度
使用FAPROTAX数据库预测了不同水稻土类型中甲烷氧化菌的生态功能（图6a）。所有三种土壤类型的甲烷氧化菌群落被共同归类为六个主要功能组：甲烷氧化（21.49%）、甲基氧化（21.49%）、烃类降解（21.49%）、化能异养（21.49%）、氮固定（12.23%）和硝酸盐还原（1.81%）。黑土中甲烷氧化的相对丰度显著高于黄土和红土，表明这一关键生态功能存在土壤类型依赖的差异（图6b）。根据PICRUSt2的预测，参与好氧甲烷氧化途径的关键酶的丰度在不同土壤类型间也存在显著差异（图6c）。具体来说，颗粒状甲烷单加氧酶（pMMO，EC 1.14.18.3）和可溶性甲烷单加氧酶（sMMO，EC 1.14.13.25）在黑土中的丰度显著高于黄土和红土，这与测量的甲烷氧化速率和pmoA基因的丰度一致。相比之下，与甲烷厌氧氧化（AOM）相关的基因/酶的预测丰度，包括编码EC 2.8.4.1（mcr）、EC 1.5.98.2（mer）、EC 1.5.98.1（mtd）和EC 2.1.1.86（mtr）的基因，在红土中显著较低。甲烷氧化速率与功能性酶丰度之间的相关性分析（图S5）显示，pMMO（EC 1.14.18.3）、sMMO（EC 1.14.13.25）和甲醛激活酶（EC 4.2.1.147，fae）之间存在正相关，而与甲醇脱氢酶（EC 1.1.2.7，mdh）之间存在负相关。下载：下载高分辨率图像（453KB）下载：下载全尺寸图像。图6. 基于FAPROTAX的甲烷氧化菌的功能预测（a）以及不同土壤类型中甲烷氧化功能的百分比分布（b）。基于KEGG数据库的甲烷氧化功能基因丰度差异（c）。* 0.01 < p ≤ 0.05，** 0.001 < p ≤ 0.01，*** p ≤ 0.001。

4.1. 三种土壤类型之间甲烷氧化潜力和甲烷氧化菌的差异
土壤类型对土壤中CH4的氧化潜力有显著影响。在本研究中，黑土稻田中的CH4氧化潜力显著高于黄土或红土（图1），这一模式与森林生态系统的观察结果一致，即在较冷地区的土壤通常表现出更强的甲烷氧化能力（Jiang et al., 2025b）。黄土和红土中活性的降低可能反映了甲烷氧化菌的中温限制，这一点通过田间实验得到证实，即温度升高会减少甲烷氧化菌的数量（Zheng et al., 2024a, Hou et al., 2023）。此外，黑土通常含有更多的有机物，并具有更好的保水能力，这些都有利于甲烷氧化菌的生存和活动。相关性分析进一步表明，CH4氧化潜力与NH4+-N、NO3?-N和MAP之间存在显著正相关（表S3），这与早期研究结果一致（Martineau et al., 2014, Ding et al., 2024）。
土壤类型驱动的环境筛选最终形成了甲烷氧化菌的不同空间分布模式。与依赖于大气甲烷且通常富含高亲和力甲烷氧化菌（如USCα）的高地森林和草原土壤不同（Schmider et al., 2024），我们在黑土中观察到I型甲烷氧化菌的相对丰度较高，而在黄土和红土中则以II型甲烷氧化菌为主（图S2）。I型甲烷氧化菌利用RuMP途径进行碳同化，这比II型甲烷氧化菌使用的丝氨酸途径具有更高的碳转化效率，从而提高了它们的氧化效率。I型甲烷氧化菌（例如Methylobacter）与总碳（TOC）、总氮（TN）和总磷（TP）之间的正相关进一步支持了它们的共生生活方式。相比之下，II型甲烷氧化菌的生长策略在高温条件下具有竞争优势（Conrad, 2007, Zhu et al., 2024）。它们也被认为是耐压类群，能够在不利条件下存活，并在低pH环境中超过I型甲烷氧化菌（Ho et al., 2013, Kou et al., 2020, Zhao et al., 2020）。
随机森林分析确定MAT（11.19%）和土壤养分（TP: 7.46%；TN: 6.99%）是社区变异的最重要预测因子（图3），而土壤pH值通常被认为是甲烷氧化菌的关键筛选因素（Ho et al., 2013, Knief, 2015, Kou et al., 2020）。Zheng et al (2024b)发现土壤pH值和养分可用性显著影响甲烷氧化菌的社区结构。然而，尽管MAT影响甲烷氧化过程，但它并不显著改变甲烷氧化菌社区。这种差异突显了不同土壤类型特有的气候-养分条件下微生物动态的复杂相互作用（Ding et al., 2020）。重要的是，VPA结果稳健地显示了气候和土壤因素之间明显的交互效应（15.92%），强调了它们在塑造甲烷氧化菌社区中的协同作用。气候变暖可能不仅会导致从I型甲烷氧化菌向II型甲烷氧化菌的转变，还会与土壤养分制度深度互动，共同决定功能结果。我们还发现地理距离显著影响甲烷氧化菌的社区结构（图S3；R2 = 0.42, p < 0.001），这可能反映了三种土壤类型所代表的宏观生态系统梯度。由于每种土壤类型占据具有独特气候-养分组合的不同气候带，地理距离成为这些不连续环境筛选的复合因素，最终驱动社区在空间上的分化。

4.2. 稻田土壤中的甲烷氧化菌作为关键物种
本研究使用微生物共现网络分析来识别稻田土壤中的关键物种。甲烷氧化菌Methylobacter（I型）、Methylomirabilis（NC10门）和Methylocystis（II型）在跨越不同土壤类型的分子网络中的参与表明，环境条件重新配置了功能社区的生态角色。虽然之前的研究强调了I型甲烷氧化菌在永久冻土湿地中的普遍性及其在低亲和力CH4氧化中的作用（Yun et al., 2014, Christiansen et al., 2015），但我们的结果揭示了不同的模式。具体来说，Methylocystis在几乎所有网络中都被普遍识别为关键物种，包括以I型甲烷氧化菌为主的黑土，这与其在富含甲烷的栖息地（如垃圾填埋场覆盖层（Cébron et al., 2007）和各种湿地（Knief, 2015）中的重要性相符。Methylocystis拥有广谱底物亲和力的pMMO，使其能够在广泛的甲烷浓度范围内利用甲烷（Kolb et al., 2003, Baani and Liesack, 2008）。这种生理灵活性可能解释了II型甲烷氧化菌即使在相对丰度较低的情况下也能作为不同土壤类型中的关键物种的原因。
值得注意的是，厌氧甲烷氧化菌属Methylomirabilis（NC10）仅在黄土网络中被识别为独特的关键物种（图4b），这可能是由于其专门的依赖亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化（N-DAMO）途径（Raghoebarsing et al., 2006）和特定的土壤微环境所致。有几个因素将这种独特生态位与其他土壤类型区分开来。首先，黄土中的高湿度由于氧气扩散受限而促进局部缺氧。与大多数甲烷氧化菌不同，Methylomirabilis利用一种独特的需氧途径从亚硝酸盐中生成内源性氧气（Ettwig et al., 2010），这在缺氧的黄土环境中提供了竞争优势。其次，黄土中的氮素可用性进一步支持了Methylomirabilis。高NH4+和适中的NO3?浓度有助于有氧-厌氧界面上的硝化–反硝化耦合（表S2），为N-DAMO提供了连续的亚硝酸盐供应（Kojima et al., 2012, Keiluweit et al., 2017）。最后，NC10细菌通常适应中温条件。黑土地区的低温可能会限制它们的代谢活动，阻止它们在微生物网络中建立关键地位。作为连接碳循环（甲烷氧化）和氮循环（亚硝酸盐还原）的关键生物地球化学桥梁（Yao et al., 2024），Methylomirabilis有效地支撑了复杂的相互作用网络，因此在黄土甲烷氧化网络中起到核心作用。将网络模块性与土壤总碳（TOC）和总氮（TN）整合起来显示，更高的养分水平与较低的模块性相关（表S2和S4），反映了社区层面通过分割相互作用来缓冲环境波动的策略。同时，更高的养分可用性似乎增强了网络连通性，因为资源丰富可能减少竞争并促进更广泛的微生物相互作用（Niehaus et al., 2019）。

4.3. 土壤类型调节甲烷氧化菌社区的随机性
在我们的研究中，不同土壤类型之间的气候和土壤养分性质的变化与不同的甲烷氧化菌社区组成模式相对应。多项证据（包括NCM、βNTI / RCbray和NST）一致表明，随机过程在稻田土壤中主导了甲烷氧化菌的组装。有趣的是，我们在大规模农业系统中观察到的这种随机优势与青藏高原自然栖息地的报告相符，在那里随机过程（占67.6%至98.2%）主要控制了高山草甸、沼泽草甸和沼泽中的甲烷氧化菌社区组装（Zhang et al., 2019）。相比之下，Kou et al.（2020）报告在未受干扰的草原土壤中，确定性选择占甲烷氧化菌组装的70%以上。具体来说，随机性的相对影响沿着土壤类型梯度系统性地增加，基于NCM的随机性比率从黑土的0.784上升到红土的0.893，这一模式得到了红土中NST值显著更高的验证（图5）。这种梯度与MAT强烈相关，与先前的观察一致，即温度与社区组装的确定性-随机平衡的变化有关（Huang et al., 2024）。在黑土中，低温加上高养分可用性形成了一个强有力的环境筛选机制，决定了高效I型甲烷氧化菌的优势。相比之下，红土中的资源条件可能不会产生强烈的竞争排斥，允许甲烷氧化菌之间有更大的生态位重叠，增加了随机性在定殖成功中的作用。此外，黄土和红土地区较温暖和湿润的条件通常与微生物活动增强和水文连通性相关（Or et al., 2007, Zhao et al., 2015），这可能有助于微生物的扩散，包括甲烷氧化菌，从而增加了随机过程的作用（图S4）。先前的研究表明，甲烷氧化细菌的社区组装过程根据栖息地和空间尺度而变化（Zhang et al., 2019, Kou et al., 2020, Li et al., 2021, Ding et al., 2024）。此外，除了气候梯度（MAT）之外，农业管理强度和种植频率的纬度变化也可能导致从黑土到红土的随机性增加（Santillan et al., 2019, Long et al., 2026）。在中国，种植系统从北方的单季种植制度（黑土）转变为南方亚热带和热带的双季或三季种植制度（黄土和红土）。更高的种植频率带来了更多的人为干扰，如强化耕作、施肥和灌溉期间的交替湿润-干燥循环。这些反复的干扰可能重新设置微生物社区，从而削弱了确定性生态位筛选，并放大了生态漂移的影响（Zhang et al., 2023）。与自然陆地生态系统中随机性随资源可用性增加的模式相反（Chase, 2003, Chase, 2010），我们发现最富养分的黑土表现出最低的随机性。稻田生态系统中的定期管理实践（如淹水和排水）可能本质上提高了社区重组的随机性（Marasco et al., 2018, Gao et al., 2019, Cheng et al., 2022）。这强调了在管理稻田系统中，气候和养分梯度之间的相互作用，而不仅仅是资源数量本身，强烈影响了社区组装的平衡。重要的是，我们的结果表明，沿着自然环境梯度，当物理栖息地条件的改善超过资源减少的影响时，确定性筛选作用可能会减弱。

4.4. 土壤类型对甲烷氧化菌功能基因和酶的调节
微生物社区介导的生态系统功能最终通过其代谢活动实现。功能预测表明，土壤类型深刻调节参与甲烷氧化途径的功能酶和基因，从而调节整体甲烷氧化能力。首先，土壤类型作为环境筛选因素，直接塑造了甲烷氧化菌社区的组成及其相关的功能基因库。在以I型甲烷氧化菌为主的黑土中，预测pmoA基因的丰度最高。这一发现得到了黑土中pmoA基因最高绝对丰度（图1b）和最高甲烷氧化潜力（图1a）的证实。值得注意的是，编码sMMO（mmoXYZ）的基因在黑土中也富集，后者表现出更广泛的底物特异性（Dedysh and Dunfield, 2014），可能增强了在不同碳可用性下的功能韧性。其次，土壤类型可能通过改变局部栖息地条件间接影响碳分配和代谢效率（Frenzel et al., 1992）。我们观察到甲烷氧化速率不仅与pMMO/sMMO正相关，还与编码甲醛激活酶（EC 4.2.1.147，fae）的基因正相关（图S5），后者将甲醛引入中央碳代谢（Chen et al., 2024）。这表明高效的甲烷氧化依赖于初始氧化能力和下游碳同化。有趣的是，与黑土相比，黄土和红土中mxaF和fdh的预测基因丰度显著更高，一种可能的解释是II型甲烷氧化菌社区在甲醇/甲醛氧化阶段遇到代谢瓶颈，这可能与丝氨酸途径较低的甲醛同化效率有关（Trotsenko and Murrell, 2008, Klein et al., 2022）。这种代谢分化反映了在寡营养草原或泥炭地中常见的策略，在这些环境中，II型甲烷氧化菌通过优先考虑生存能力和抗逆性来胜过I型甲烷氧化菌，而不是选择在营养丰富的湿地中更为有效的RuMP代谢途径所带来的快速生长（Knief 2015）。最后，与厌氧氧化（AOM）相关的基因丰度预测为理解稻田系统中的甲烷汇复杂性提供了新的见解。这些基因的丰度明显低于与好氧代谢途径相关的基因，而在红土中，相关基因（如mcr、mer）的丰度最低。这可能是由于红土具有更好的排水性和通气性，这是由于铁铝氧化物凝结形成的稳定团聚体所致（K?gel-Knabner等人，2010），这可能会抑制厌氧过程。在这方面，红土稻田在功能上类似于未受干扰的高地森林土壤，在那里高氧化还原电位有效地阻止了厌氧甲烷氧化菌群落的建立（Jiang等人，2025b）。尽管如此，在黄土中发现的关键物种Methylomirabilis（NC10）（图4）强烈表明，依赖于亚硝酸盐/硝酸盐的AOM可能在特定生境中发挥至关重要的生态作用。这一发现使黄土稻田与富氮河岸带更加相似，在这些区域，CH4和N循环的耦合提供了重要的次级甲烷汇（Shen等人，2016）。这些结果强调了在评估不同类型稻田土壤的甲烷汇能力时，需要同时考虑好氧和厌氧甲烷氧化过程。

需要注意的是，虽然我们使用PICRUSt2和FAPROTAX进行的功能预测提供了有关甲烷氧化菌群代谢潜力的宝贵见解，但这些工具依赖于16S rRNA基因扩增子，代表的是间接推断而不是直接测量酶活性或基因表达。尽管通过qPCR直接定量pmoA基因的结果强烈支持了我们关于不同土壤类型中甲烷氧化潜力的初步结论，但关于完整甲烷氧化途径（例如下游甲醛同化或特定AOM途径）的更广泛推断应谨慎解释。这些生物信息学预测本质上是对由土壤类型驱动的甲烷氧化菌功能差异的稳健假设。未来研究应采用宏基因组学、宏转录组学和直接酶活性测定等方法来验证这些功能途径预测，并揭示这些复杂土壤生态系统中的活跃代谢耦合。

**5. 结论**
我们的研究表明，土壤类型作为宏观气候和营养梯度之间的纽带，通过环境筛选来影响甲烷氧化菌群落的组成，调整随机过程与确定性过程在群落构建中的相对重要性，并重塑关键物种在微生物相互作用网络中的角色，最终决定了稻田土壤的甲烷氧化功能。这项研究的结果不仅为理解稻田中甲烷汇的微生物调节机制提供了新的生态视角，还为基于土壤微生物管理的甲烷排放减少策略提供了理论基础。未来的研究可以关注多因素相互作用对甲烷氧化菌功能的影响，以实现不同土壤类型中甲烷排放的精准调控。

**作者贡献声明**
Yalin Yin：撰写——初稿、软件开发、方法论设计、实验设计、数据分析、数据管理。
Gengbo Jiang：软件开发、实验设计、数据分析、数据管理。
Wanyi Jin：方法论设计、实验设计、数据分析、数据管理。
Li Tian：方法论设计、实验设计、数据分析、数据管理。
Jia-nan Lu：研究指导、实验设计、数据分析、数据管理。
Hanpu Yu：实验设计、数据分析。
Jinghui Ma：方法论设计、实验设计。
Shiting Zheng：方法论设计、数据分析。
Tanfei Wang：资源获取、方法论设计、数据分析。
Shizhong Wang：验证工作、研究指导、概念构建。
Yetao Tang：撰写——审稿与编辑、方法论设计、数据分析。
Rongliang Qiu：撰写——审稿与编辑、资源获取、概念构建。
Yuanqing Chao：撰写——审稿与编辑、方法论设计、实验设计、资金筹集、概念构建。