通过重复对暴露的土壤芯进行X射线扫描来量化田间蚯蚓的钻洞速率

《Geoderma》：Quantification of field earthworm burrowing rates using repeated X-ray scanning of open soil cores

　　贝卡卡·娜奥米·特尔·博格 | 马茨·拉尔斯博 | 伊万·卡波维兹 | 帕斯卡尔·贝纳德 | 阿斯特丽德·泰勒 | 丹尼尔·伊塞斯科格 | 托马斯·凯勒
瑞典农业科学大学，土壤与环境系，邮编7014，乌普萨拉，瑞典

**摘要**
蚯蚓通过钻土来促进土壤功能，然而关于它们在田间条件下钻土活动的定量知识以及环境因素如何影响这些活动仍很有限。本研究的目的是测试一种量化蚯蚓钻土速率时间动态的方法，并探讨钻土速率变化与土壤湿度和温度之间的联系。在瑞典乌普萨拉的一个有已知蚯蚓群落的耕地中，安装了特制的带孔圆柱体，并在2023年5月至10月期间反复取下、进行X射线扫描后重新安装。从X射线图像中得到了蚯蚓钻洞的体积和洞穴网络的特征。这些洞穴被分为由内生蚯蚓（洞穴直径≤4毫米）和非内生蚯蚓（洞穴直径>4毫米）形成的。我们测试了两种方法：一种是在每次扫描后重新填充土壤，另一种是重复使用相同的土壤圆柱体。此外，还设置了两种土壤湿度处理条件（有和没有遮雨罩）。使用传感器监测了土壤的湿度和温度。结果显示，在新填充的土壤中，钻土速率高于相同土壤的圆柱体中的速率。根据处理方式和时间不同，平均钻土速率在0.05至0.64立方厘米/天之间变化。据估计，在该地块中，由于蚯蚓的活动，表土的更新周期约为21至42年，该地块的蚯蚓密度为每平方米81条。来自“相同土壤”处理的数据表明，五个月后蚯蚓洞穴体积达到了稳态，表现为洞穴形成和消失之间的平衡。我们的研究表明，土壤湿度比温度对蚯蚓钻土活动的影响更大。大约40%的蚯蚓洞穴位于表土层中。我们得出结论，使用带孔圆柱体和重复扫描的方法适用于季节性监测，并能量化田间条件下的蚯蚓钻土速率。

**1. 引言**
蚯蚓的生物扰动主要指的是它们在钻土过程中对土壤的移动和混合。生物扰动影响着重要的土壤过程，包括土壤形成、排水、通气性和养分循环（Lavelle, 1988; Blouin et al., 2013; Plaas et al., 2019）。长期以来人们已经认识到蚯蚓生物扰动对土壤功能的贡献（Darwin 1881）。虽然已有研究在受控条件下（如2D饲养箱、中型生态系统和土壤柱）研究了蚯蚓的钻土和生物扰动速率（Dittbrenner et al., 2011; Arrázola-Vásquez et al., 2022; Jégou et al., 1997; Francis and Fraser, 1998; Capowiez et al., 2001; 2015），但在自然条件下的田间土壤中关于蚯蚓钻土和生物扰动速率的定量数据仍然很少（参见例如Védère et al. (2025)和Leuther et al. (2023)）。因此，目前仍难以将蚯蚓生物扰动与土壤功能或土壤健康状况定量联系起来，也无法预测土地利用变化、土壤管理或气候变化对蚯蚓生物扰动的影响。

当蚯蚓钻土时，它们会创建新的（大）孔隙并改变土壤孔隙网络（Ruiz et al. 2023）。因此，蚯蚓的钻土活动会影响依赖于大孔隙网络的土壤过程和功能，例如水分和气体传输与储存、碳和养分循环以及植物根系生长。了解钻土速率（即单位时间内的钻土量）对于量化蚯蚓对这些土壤过程和功能的贡献至关重要，也有助于建立模拟模型（尽管这类模型在土壤生物学中仍较为少见，参见Barot et al. 2007）。蚯蚓的活动会因土壤质地、有机物含量、pH值（Baker and Whitby, 2003; Ruiz et al., 2015; Taylor et al., 2019）和容重（Capowiez et al., 2021）的不同而有所差异。此外，钻土速率还受到土壤环境条件（如土壤湿度和温度）的影响（Ruiz et al., 2021; Edwards and Arancon, 2022; Gergs et al., 2022），因此会受到季节性天气变化和长期气候变化的影响（Nordstr?m and Nordstrom, 1975; Potvin and Lilleskov, 2017; Singh et al., 2019）。土壤湿度影响蚯蚓的钻土行为，因为蚯蚓需要湿润的表皮进行呼吸和钻土（Edwards & Arancon 2022），同时也影响土壤的机械阻力（Ruiz and Or, 2018; Arrázola-Vásquez et al., 2022）。从长远来看，土壤条件会对蚯蚓种群产生影响（Bardgett and van der Putten, 2014; Phillips et al., 2019）。尽管蚯蚓在低温（约2°C）下仍能活动（Singh et al. 2019），但温度和湿度通常呈负相关。在温带气候下，高温度和低湿度比低温度和高湿度更限制蚯蚓的钻土活动（Nordstrom and Rundgren, 1973; Edwards and Arancon, 2022）。然而，在寒冷气候（如斯堪的纳维亚）中，低温和土壤冻结会限制冬季的蚯蚓钻土行为。不同蚯蚓物种对最佳和极限土壤湿度和温度的范围也有所不同（Edwards & Arancon 2022）。当土壤湿度或温度不适宜时，蚯蚓可能会迁移到更适宜的环境中，例如夏季较凉爽、冬季较温暖的深层土壤中（Lavelle 1988）。蚯蚓还可能进入休眠状态（称为夏眠）以应对不适宜的土壤条件（Nordstr?m and Nordstrom, 1975; Lavelle, 1988; Eggleton et al., 2009; Holmstrup et al., 2016）。要估计季节性变化并量化每年的蚯蚓钻土量，就需要理解钻土活动与环境条件之间的关系。

目前，关于田间条件下蚯蚓钻土速率的知识仍然有限。大多数实验研究是在半田间条件下进行的，使用含有固定数量蚯蚓的圆柱体（即蚯蚓被封闭在有限的土壤体积内）并将其放置在田间（Francis & Fraser 1998），或在12–20°C的温度范围内进行实验室研究（Jégou et al., 1997; Capowiez et al., 2011; 2015; Heinze et al. 2021）。蚯蚓生物扰动速率也是基于实地采集的蚯蚓生物量、实验室测定的排泄速率和年平均温度估算的（Taylor et al., 2019; Torppa and Taylor, 2022）。最近，Védère et al. (2025)通过将土壤芯样本在带孔圆柱体中培养来量化由土壤大型动物（包括蚯蚓）形成的生物孔隙。然而，这些研究没有关注钻土活动的时间动态，而是量化了特定时间后的洞穴体积和特征。Garbout et al., 2013, Koestel and Schlüter, 2019, 和 Leuther et al. (2023)通过对田间安装的土壤柱进行重复X射线计算机断层扫描来量化土壤结构和孔隙特征的变化。带孔圆柱体允许大型动物进入和离开土壤芯样本（Leuther et al., 2023; Schefer et al., 2025; Védère et al., 2025）。通过这种方式并使用特定标记物，Leuther et al. (2023)确定了大型动物的活动是土壤结构变化的主要驱动力。他们还发现，在干燥条件下生物扰动受到限制。不过，Leuther et al. (2023)并未量化蚯蚓的钻土速率。Védère et al. (2025)报告称，生物孔隙通常在一年内达到稳定状态。此外，他们发现蚯蚓形成的生物孔隙具有特定特征，可以与其他大型动物形成的生物孔隙区分开来。蚯蚓通常被分为三类生态类型：地表型、内生型和非内生型，尽管最近的研究认为某些物种可能同时具有多种类型的特征，并且这些物种会根据具体环境调整其钻土和取食行为（Bottinelli et al., 2020; Capowiez et al., 2024）。地表型蚯蚓主要生活在土壤表面的枯落物层中，在耕地中较为罕见或不存在。内生型蚯蚓以土壤有机物质为食，主要在表土层中创建非定向的洞穴。非内生型蚯蚓（也称为“深穴蚯蚓”）在深层永久性垂直洞穴中生活，主要以土壤表面的枯落物为食（Bouché 1977）。不同种类的蚯蚓钻土速率不同，因此土壤环境条件对这些速率的影响因物种而异。这意味着不同物种和生态类型的蚯蚓的钻土模式也会有所不同。

在这里，我们提出了一种使用重复X射线断层扫描带孔土壤圆柱体来监测田间土壤中蚯蚓洞穴网络变化的方法。我们在一块休耕田中安装了土壤圆柱体，并在五个月的时间内量化了洞穴特征和钻土速率。根据Védère et al. (2025)的建议，我们采用了相对较高的时间分辨率（大约每1.5–2个月扫描一次）来捕捉钻土速率的时间动态。鉴于这种时间分辨率的新颖性以及是否存在可靠捕捉蚯蚓钻土动态的不确定性，我们比较了两种方法：一种是每次扫描后重新使用相同的土壤圆柱体（不干扰土壤样本），另一种是每次扫描后使用重新填充的土壤圆柱体（即每次测量后安装新重塑的土壤圆柱体）。这两种方法各有优缺点。例如，重复使用相同土壤需要图像对齐，这可能具有挑战性，但可以量化洞穴的持久性。我们还期望这两种方法能够反映蚯蚓在不同“新”土壤与重复使用现有洞穴中的行为差异。我们安装了实地土壤传感器以量化土壤湿度对钻土速率的影响。最后，我们区分了非内生型和内生型洞穴，以表征洞穴系统的不同方面。

**2. 材料与方法**
**2.1. 实验设计**
本研究旨在通过1.5–2个月的间隔对土壤柱进行重复X射线断层扫描，以量化五个月（2023年5月至10月）内的蚯蚓钻土情况。借鉴先前的研究（Leuther et al., 2023），我们设计了允许蚯蚓从侧面、顶部和底部进入的带孔圆柱体（图1A和补充图S1）。这些圆柱体的设计旨在最大化蚯蚓进出土壤的面积。同时，圆柱体在田间安装、运输和重新安装时也应便于操作。此外，我们还设计了可以3D打印的圆柱体。最后，圆柱体的尺寸需要适应现有的X射线扫描仪，并保证足够的图像分辨率。圆柱体高20厘米，直径10厘米。圆柱体的侧面、顶部和底部均匀分布有244个直径为11毫米的孔（图1A）。总共制作了32个圆柱体，使用X-PLA材料3D打印（添加材料：North 3D-filament）。

**图1. 圆柱体的设计及实验设置。**
A) 高度20厘米、直径10厘米的带孔X-PLA圆柱体。
B) 田间的实验设置，显示了每个圆柱体的位置。方格尺寸为1米×1米，圆柱体放置在方格的中心，圆柱体之间相距2米。第五个圆柱体内的土壤湿度和温度传感器用于测量。
C) 从田间安装和移除圆柱体的步骤。圆柱体安装在5–25厘米深度，上方覆盖5厘米厚的土壤层。7月和9月分别重复步骤2、3和4，10月仅执行步骤2和3，之后实验终止。

田间实验于2023年在瑞典乌普萨拉以东10公里处的L?vsta（北纬59°49′49.9″，东经17°48′35.8″，WGS84）的一块休耕田（草和豆科植物的混合种植）中进行。表土的质地被分类为粉质粘土（54.1%粘土，41.7%粉砂，4.2%砂）。土壤的pH值为6.6，有机碳含量为4.1%。该田地在2022年转为有机农业，轮作休耕作物和耕地作物。2022年的前茬作物是春小麦。在该田地中发现了五种蚯蚓（详细的蚯蚓采样方法见下文，结果列于表S2）：Aporrectodea rosea、Aporrectodea caliginosa、Aporrectodea tuberculata、Aporrectodea longa和Lumbricus terrestris。

2023年4月，我们从土壤表层30厘米处采集了土壤样本。土壤经过风干后，通过2毫米的筛网过滤以去除大块的植物残渣、大型动物以及少量的砾石。在将土壤装入圆柱体之前，将其重量含水量调整为0.3 kg kg?1（与田间条件相似），并让其平衡约48小时。每个圆柱体逐层小心填充，直到达到1,100 kg m?3的土壤容重，这与田间观察结果一致。每层的厚度约为2厘米，共填充了十层。为了确保条件与周围土壤相似，没有向土壤中添加蚯蚓或其他有机物质。

2023年5月25日，这些土壤圆柱体被安装在田间，深度为5–25厘米。首先移除了表层5厘米的土壤和植被，然后为每个圆柱体钻一个直径约为14厘米的孔。将土壤圆柱体放入孔中后，将土壤填充到孔壁与圆柱体之间的空隙中，并压缩至与周围土壤相似的容重。随后再将那5厘米的土壤和植被重新盖上。

该田间实验设计了两种土壤环境处理方法和两种方法处理方式。两种环境处理旨在创建“干燥”和“湿润”的土壤条件。在干燥处理中，当预测的降水量超过每天5毫米时（从8月1日到10月30日），在土壤圆柱体上安装了避雨棚。在湿润处理中，土壤圆柱体保持不加遮盖。这两种环境处理方法分别称为“有避雨棚”和“无避雨棚”。正如我们稍后将看到的，避雨棚并没有达到预期的影响土壤湿度的作用。为了测试这种方法的有效性，实施了两种处理方式：一种是在每次扫描后重新安装具有完整洞穴网络的相同土壤圆柱体（以下简称“相同土壤”；32个圆柱体中的16个）；另一种是在每次扫描后安装重新重塑、重新填充的土壤（以下简称“新土壤”；剩余的16个圆柱体）。因此，每种处理组合（即“有避雨棚的相同土壤”、“无避雨棚的相同土壤”、“有避雨棚的新土壤”和“无避雨棚的新土壤”）都有八个重复样本，这些样本分布在八个区块中（图1B）。其中一个“有避雨棚的相同土壤”处理组合的圆柱体在田间损坏，导致该处理组合仅有七个重复样本。

使用四个“GS3传感器”（METER Group，慕尼黑，德国）监测原位土壤含水量（体积含水量，单位：m3 m?3）和土壤温度（°C），这些传感器被插入每个处理组的土壤圆柱体中心（图1B）。土壤湿度读数的校准基于METER Group提供的协议（慕尼黑，德国），校准结果见补充材料：《原位土壤湿度传感器的校准及整个季节的传感器数据》（补充图S4）。

在2023年的生长季节中，土壤圆柱体被从田间取出、进行X射线扫描，并在三个时间点重新安装（图1C）：7月24日（初次安装后的第60天）、9月11日和10月30日（第109天）。为了避免运输过程中的干扰，土壤圆柱体被放置在装有填充材料的衬垫箱中。第一阶段（5月25日至7月24日）的降水较少（5月至6月：3毫米；7月：69毫米），平均气温为16.6°C；第二阶段（7月24日至9月11日）的降水量正常（即与长期平均值相当，137毫米），平均气温为15.9°C；第三阶段（9月11日至10月30日）的降水也正常（57毫米），平均气温为8.1°C（见补充表S1和补充图S2）。7月份，实验区域用割草机修剪了草地，并清除了草类。

2023年11月3日，即土壤圆柱体被取出四天后，收集了蚯蚓以确定其数量、新鲜生物量和种类。我们沿着安装圆柱体的外缘进行采样，并从四个尺寸为40厘米×40厘米×40厘米的挖掘孔中手动分类蚯蚓。2024年10月再次重复了这一采样过程。

2.2. X射线计算机断层扫描、图像处理和图像分析
2.2.1. 使用ImageJ进行X射线断层扫描和图像处理
土壤圆柱体在瑞典乌普萨拉农业科学大学的土壤与环境系使用GE Phoenix (V|tome|x 240) X射线断层扫描仪进行了扫描。每个圆柱体拍摄了2000张辐射图像，电压为170 kV，电流为630 μA，曝光时间为200 ms。使用Dragonfly 3D World 2024.1.0.1601版本重建了三维图像。最终的体素边长为120 μm。图像处理使用了Image J及其Fiji发行版中的插件（Schindelin et al. 2012）。图2展示了获取洞穴网络图像的步骤。作为预处理的一部分，对每个圆柱体的灰度值进行了校准，以标准化图像中的灰度分布。为了减少噪声，应用了半径为三个体素的3D中值滤波器。从每个圆柱体中心提取了一个代表性体积（1550层）以便比较不同样本之间的洞穴网络。图像采用Otsu方法进行分割。分割后的图像通过三个步骤进行处理：填充孔洞、合并相邻的体素群以及去除噪声，使用的命令包括：3D填充孔洞（Ollion et al. 2013）；侵蚀和膨胀；以及2D/3D尺寸 opening（Legland et al. 2016）。使用Local Thickness命令（Dougherty & Kunzelmann 2007）计算孔径，移除了直径小于2毫米的孔隙。蚯蚓洞穴的直径因种类和发育阶段而异，通常在1-12毫米之间（Edwards & Arancon 2022）。我们使用2毫米作为阈值，以排除由根系和其他小型动物创造的生物孔隙（但这可能会遗漏小型蚯蚓建造的洞穴）。最后，在对原始X射线图像进行视觉检查后，使用2D/3D尺寸 opening（Ollion et al. 2013）移除了可能不是蚯蚓洞穴的孤立孔隙，最小体素计数为50000。

在2023年的生长季节中，土壤圆柱体被从田间取出、进行X射线扫描，并在三个时间点重新安装（图1C）：7月24日（初次安装后的第60天）、9月11日和10月30日（第158天）。为了避免运输过程中的损坏，土壤圆柱体被放置在装有填充材料的箱子里。第一阶段（5月25日至7月24日）降水量较少（5月至6月：3毫米；7月：69毫米），平均气温为16.6°C；第二阶段（7月24日至9月11日）降水量正常（与长期平均值相当，137毫米），平均气温为15.9°C；第三阶段（9月11日至10月30日）降水量也正常（57毫米），平均气温为8.1°C（见补充表S1和补充图S2）。7月份，实验区域用割草机修剪了草地。

2023年11月3日，即在土壤圆柱体被取出四天后，收集了蚯蚓以确定其数量、新鲜生物量和种类。我们在安装圆柱体的外围沿着一条样带采集蚯蚓，并从四个挖掘的40厘米×40厘米×40厘米的孔中手动分类蚯蚓。2024年10月再次进行了采样。

2.2.2. X射线计算机断层扫描、图像处理和图像分析
2.2.1. 使用ImageJ进行X射线断层扫描和图像处理
土壤圆柱体在瑞典乌普萨拉农业科学大学的土壤与环境系使用GE Phoenix (V|tome|x 240) X射线断层扫描仪进行了扫描。每个圆柱体拍摄了2000张辐射图像，电压为170 kV，电流为630 μA，曝光时间为200 ms。使用Dragonfly 3D World 2024.1.0.1601版本重建了三维图像。 resulting voxel的边缘长度为120 μm。图像处理使用了Image J及其Fiji发行版中的插件（Schindelin et al. 2012）。图2展示了获取洞穴网络图像的步骤。作为预处理的一部分，对每个圆柱体的灰度值进行了校准，以标准化图像中的灰度分布。为了减少噪声，应用了半径为三个体素的3D中值滤波器。从每个圆柱体中心提取了一个代表性体积（1550层）以便比较不同样本之间的洞穴网络。图像使用Otsu方法进行分割。分割后的图像经过三个步骤的处理：填充孔洞、合并相邻的体素群以及去除噪声，使用的命令包括：3D填充孔洞（Ollion et al. 2013）；侵蚀和膨胀；以及2D/3D尺寸 opening（Legland et al. 2016）。使用Local Thickness命令（Dougherty & Kunzelmann 2007）计算孔径，并移除了直径小于2毫米的孔隙。蚯蚓洞穴的直径因种类和发育阶段而异，通常在1-12毫米之间（Edwards & Arancon 2022）。我们使用2毫米作为阈值，以排除由根系和其他小型动物创造的生物孔隙（但这可能会遗漏小型蚯蚓建造的洞穴）。最后，在对原始X射线图像进行视觉检查后，使用2D/3D尺寸 opening（Ollion et al. 2013）移除了几乎可以确定不是蚯蚓洞穴的孤立孔隙，最小体素计数为50000。

由于X射线图像中的灰度值与土壤相似，无法直接从图像中提取蚯蚓粪便。在某些圆柱体扫描时发现有蚯蚓存在。我们使用MorphoLibJ（Legland et al. 2016）插件中的形态学分割方法将它们从图像中数字去除。容忍强度参数设置为1500（?），但在某些情况下使用了1800或2000的容忍值以获得更好的分割效果。最终得到的分割图像包含不同灰度值的“流域”。在标签编辑中手动标记并移除了含有蚯蚓的流域。为了将标签编辑图像转换为二值图像，首先对流域图像进行了膨胀操作，以连接各个流域，然后将其转换为二值图像。接着使用与处理孔隙相同的后处理步骤（见补充图S4）。随后将孔隙图像和蚯蚓图像合并，生成了由蚯蚓创建的洞穴网络的最终图像。

2.2.2. 使用Matlab进行图像处理
使用MATLAB（The MathWorks Inc. 2024）对“相同土壤”圆柱体的分段大孔图像进行了对齐处理。首先，使用内置函数‘imrotate’和‘imrotate3’旋转初始的二值化体积，以最小化其与后续扫描的结果之间的差异。然后，通过移动初始体积在x、y和z方向上的位置来进一步减少初始旋转体积与后续二值化原始体积之间的差异，即使用内置函数‘imregtform’和‘imwarp’执行平移变换。接下来，为了考虑由于轻微样本倾斜、空间分辨率限制造成的洞穴对齐差异以及土壤和洞穴因土壤湿度变化而产生的膨胀和收缩，从上到下对图像切片进行了弹性对齐。在这个过程中，使用了内置函数‘imregtform’和‘imwarp’调整了初始旋转和移动后的二值化体积之间发生孔洞重叠的第一层在x和y方向上的位置，以最小化二值图像之间的差异，并为后续对齐创建一个起点。在z方向上，后续切片的位置移动限制在一个像素以内，以减少二值化体积之间的差异。视觉检查显示洞穴排列得非常整齐。

2.2.3. 洞穴体积和洞穴的形成与消失速率
对于重新填充了新土壤的圆柱体，使用ImageJ中的SoilJ插件（Koestel 2018）的Pore Space Analyzer提取了洞穴体积和平均洞穴厚度，并创建了局部厚度图像。提取了每个切片的孔隙度，以确定洞穴的深度分布。在Matlab中，从“相同土壤”圆柱体的对齐图像中计算了每次扫描时的总洞穴体积，以及第一次扫描和第二次扫描之间、第二次扫描和第三次扫描之间维持的、新形成的和消失的洞穴体积。洞穴形成速率（cm3 day?1）和洞穴消失速率（cm3 day?1）分别通过计算每次扫描期间形成的孔隙体积和消失的孔隙体积，再除以扫描间隔的天数得出。消失速率和维持的洞穴基于单个圆柱体内的洞穴，即分别考虑了在扫描期间消失或仍然存在的特定洞穴。我们还计算了每单位土壤体积每天的洞穴形成速率（cm3 cm?3 day?1）（见补充表S5和S6）。通过从形成的洞穴体积中减去消失的洞穴体积，得到了“相同土壤”圆柱体的净洞穴形成速率。

尽管我们无法将单个蚯蚓洞穴归因于特定种类，但可以根据洞穴直径区分可能是内生蚯蚓和外生蚯蚓建造的洞穴。基于关于内生蚯蚓和外生蚯蚓直径的文献数据（Sherlock, 2012, Edwards and Arancon, 2022）以及野外观察到的外生蚯蚓，我们选择了4毫米作为阈值来区分这两种类型的洞穴。我们还计算了“相同土壤”圆柱体中外生和内生洞穴消失的比例，并确定了洞穴的持久性，即第一次扫描和第二次扫描之间、第二次扫描和第三次扫描之间消失的洞穴比例。最后，我们量化了“外生洞穴”和“内生洞穴”的方向性、分支性和迂曲度。为此，使用Matlab获取了孔隙网络的骨架。所有长度小于1毫米的死胡同分支都被移除。二值化图像首先缩小到0.125，以减少结果骨架和分析过程中的伪影。使用ImageJ插件Analyze Skeleton（Arganda‐Carreras et al. 2010）分析了这些骨架。从中获得了每个孔隙簇的簇数量、分支数量、连接点和端点数量。由于包含骨架伪影，总分支长度小于40毫米的簇未被纳入分析。我们还获取了每个分支的长度和每个分支的端点坐标。根据这些参数，通过将分支长度除以端点之间的欧几里得距离来计算迂曲度。通过计算分支与垂直方向的夹角偏差来估计洞穴的首选方向（Capowiez et al., 2015）。对于洞穴群，我们计算了两个复杂度指标：分支强度（Capowiez等人，2015年），即每个分支长度单位上的连接点数量；以及协调数。协调数反映了洞穴网络的连通性。对于所有这些指标，我们首先计算了每张图片中包含的参数之和，然后根据每个分支的长度或每个群的大小来计算这些指标的最终值。这些指标是针对所有“新土壤”图片以及“相同土壤”图片的最后一段时期进行计算的。

2.3 统计分析
所有的统计分析都使用了R软件4.4.2版本（R核心团队2024年）。图表是使用R软件中的基础绘图命令以及R包ggplot2（Wickham 2016）和ggpubr（Kassambara 2023）创建的。为了分析结果，我们采用了基于Tweedie分布的广义线性模型（Dunn 2022）。响应变量是蚯蚓的掘洞率，而自变量包括处理条件（如“新土壤”、“相同土壤”、“有遮雨棚”和“无遮雨棚”）、实验批次以及扫描时间。蚯蚓洞穴的曲率、角度、方向、群落数量、协调数以及外孔型（anecic）和内孔型（endogeic）洞穴网络之间的分支强度，都通过包含实验批次的线性回归模型进行了统计测试。

3. 结果
图3展示了蚯蚓洞穴网络的示意图。蚯蚓从各个侧面通过穿孔的圆柱壁进入和离开土壤柱。重复的X射线成像使我们能够监测两种不同处理条件下的蚯蚓洞穴网络随时间的变化（分别为图3的上半部分和下半部分），并比较“重新压实”圆柱中的洞穴与“相同土壤”中形成的洞穴。每次X射线扫描后重新安装含有完整洞穴网络的相同土壤，使我们能够分析洞穴在扫描之间的出现和消失情况，即新形成的洞穴和塌陷/重新填充的洞穴（见图2下半部分）。使用每次X射线扫描后重新压实的新鲜土壤圆柱（见图2上半部分）有助于量化扫描时间点之间的新洞穴体积，因为初始条件（即将土壤柱安装在田地时）被标准化为没有洞穴的“新土壤”核心样本。

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图3. 从X射线成像中得出的蚯蚓洞穴网络随时间变化的示例：（上）装有新压实土壤的圆柱，（下）重新安装了具有完整洞穴网络的相同土壤的圆柱。图片中的颜色表示洞穴直径，白色代表最大直径，橙色代表最小直径；请注意，颜色刻度是相对于每张图片而言的。

3.1 蚯蚓洞穴体积和掘洞率的时间变化
所有土壤柱中蚯蚓洞穴网络的时间变化情况展示在补充图S5中，而洞穴体积的创建和消失情况以及扫描之间洞穴体积的（净）变化数据分别记录在补充表S3和S4中。相同处理条件下的土壤柱中洞穴体积存在差异，这在洞穴网络的图像（补充图S5）和提取的洞穴体积数据（补充表S3-S6）中均有体现。图4显示了计算的洞穴体积变化率以及洞穴创建和消失的速率。需要注意的是，对于“新土壤”圆柱（图4A），新洞穴体积等于扫描之间洞穴体积的净变化，因为这些圆柱在每个时间段开始时都没有洞穴；对于“相同土壤”圆柱（图4B），情况也是如此（这些圆柱在开始时使用了重新压实的土壤）。

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图4. 土壤柱中洞穴体积变化率：A）每次X射线扫描后重新压实的土壤圆柱；B）每次X射线扫描后重新安装了具有完整洞穴网络的相同土壤的圆柱。符号分别代表掘洞（圆圈）、洞穴消失（以负值表示）和净变化（方块）。数据显示了平均值和标准误差（n = 8）。三个时间段分别为：第1阶段：2023年5月25日至7月24日；第2阶段：2023年7月25日至9月11日；第3阶段：2023年9月12日至10月30日。注意A）和B）中垂直轴的比例尺不同。
“相同土壤”圆柱的掘洞率介于0.05至0.2立方厘米/天之间，“新土壤”圆柱的掘洞率介于0.05至0.7立方厘米/天之间（见图4）。在“新土壤”圆柱中，掘洞率在第2阶段（7月25日至9月11日）最高，而“相同土壤”圆柱的掘洞率随时间略有下降（见图4）。在第3阶段，“相同土壤”圆柱的洞穴体积净变化率（即创建的洞穴和消失的洞穴之间的差异）接近于零，这可能表明洞穴体积达到了一个稳定状态（即创建的洞穴和消失的洞穴数量达到了平衡）。与“新土壤”处理相比，“相同土壤”处理下的平均掘洞率显著较低（p < 0.001）。详细关系见补充图6。

整个研究期间（2023年5月25日至10月30日），“相同土壤”圆柱的平均掘洞率约为1×10^-4立方厘米/厘米·天，“新土壤”圆柱的平均掘洞率约为2×10^-4立方厘米/厘米·天。为了便于理解，这些掘洞率对应的土壤周转时间（即蚯蚓掘穿全部表土所需的时间）分别约为42年和21年，假设蚯蚓群落的活动期为4月中旬至11月中旬（其余时间由于低温而不活跃）。

我们原本计划设置两种土壤湿度处理条件（有遮雨棚和没有遮雨棚），然而根据土壤湿度传感器数据（补充图S3），除了第3阶段（9月11日至10月30日）外，我们并未观察到处理条件之间的土壤含水量差异——该阶段的无遮雨棚处理组的平均土壤含水量为0.44立方米/立方米，而有遮雨棚处理组的土壤含水量为0.38立方米/立方米。尽管如此，不同时间段的土壤含水量和土壤温度仍存在差异，因此我们可以将土壤条件与掘洞率联系起来。掘洞率随着土壤含水量的增加而显著增加（p < 0.001，见图5a），而掘洞率与土壤温度之间没有显著关系（p = 0.82，见图5b）。由于数据点数量有限，我们承认掘洞率与土壤含水量和温度之间的关系尚不明确。

图5. 挖洞率作为A）土壤含水量和B）土壤温度的函数，分别针对每次扫描后重新压实的新鲜土壤圆柱（橙色）和每次扫描后重新安装了具有完整洞穴网络的相同土壤的圆柱（蓝色）。注意：由于所有圆柱在初次安装时的初始条件相同，因此“新土壤”有八个数据点（对应于所有处理的第一阶段以及“新土壤处理”的第二和第三阶段），而“相同土壤处理”只有四个数据点（分别对应于第二和第三阶段）。

洞穴体积随着深度的增加而略有减小（见图6）。位于总洞穴体积50%以上的深度范围为4.5至8.5厘米，对应于土壤深度9.5至13.5厘米（圆柱安装在土壤表面下5厘米处），这一深度范围在不同处理组之间没有明显的时间规律性（见补充图S7）。蚯蚓洞穴的大小分布也没有明显的时间规律性（见图6D）。直径超过6毫米的洞穴非常少。

图6. 不同处理条件下洞穴体积的深度分布：A）“有遮雨棚的相同土壤”，B）第1阶段（A），C）第2阶段（B）和D）第3阶段（C）。蓝线表示洞穴体积50%以上和以下的深度位置。线条周围的灰色区域表示标准误差。其他处理组的深度分布趋势类似（见补充图S10）。每个时间段内各类别洞穴的直径分布见图D。三个时间段分别为：第1阶段：2023年5月25日至7月24日；第2阶段：2023年7月25日至9月11日；第3阶段：2023年9月12日至10月30日。

3.2 外孔型（anecic）和内孔型（endogeic）蚯蚓创建的洞穴网络
根据两次采样，我们测量到每平方米蚯蚓生物量为35克，蚯蚓丰度为每平方米81个个体，并鉴定出五种不同的蚯蚓物种（见补充表S2）：Aporrectodea rosea、Aporrectodea caliginosa、Aporrectodea tuberculata、Aporrectodea longa和Lumbricus terrestris。A. rosea、A. caliginosa和A. tuberculata主要是内孔型物种（Bottinelli等人，2020年），而A. longa和L. terrestris主要是外孔型物种（Bottinelli等人，2020年）。A. rosea、A. caliginosa和A. tuberculata的个体重量约为0.3克，而A. longa和L. terrestris的个体新鲜体重为1.5至3克（见补充表S2）。

图7展示了一个蚯蚓洞穴网络（图7C），并区分了可能由外孔型蚯蚓（>4毫米）和内孔型蚯蚓（≤4毫米）创建的洞穴（图7B和图7A）。所有土壤圆柱中内孔型洞穴的体积比例在0.4到0.8之间，且在2023年5月至10月这三个月份内没有明显的时间规律性。平均而言，所有圆柱和时间段中，总洞穴体积大约由60%的内孔型洞穴和40%的外孔型洞穴组成。

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图7. 土壤柱中洞穴的示例：A）可能由内孔型蚯蚓创建的洞穴；B）可能由外孔型蚯蚓创建的洞穴；C）总的蚯蚓洞穴网络。直径≤4毫米的洞穴被分类为“内孔型洞穴”，直径>4毫米的洞穴被分类为“外孔型洞穴”。洞穴的颜色刻度表示洞穴的相对直径，白色代表最大直径，紫色代表最小直径。请注意，这是相对于每张图片而言的相对刻度。

内孔型洞穴的持久性显著低于外孔型洞穴（p < 0.001）。平均而言，所有内孔型洞穴中有52%在扫描之间消失了。对于外孔型洞穴，有28%的洞穴体积消失了（详见补充图S8）。内孔型洞穴（方向角：52°）与外孔型洞穴（方向角：51°）之间的方向没有显著差异（p = 0.74）。内孔型洞穴的平均曲率为1.52，显著高于外孔型洞穴（平均曲率：1.37，p = 0.032）。内孔型洞穴群的数量也显著更多（每根圆柱中的洞穴群数量：23.4个，对比外孔型洞穴群：7.8个）。内孔型洞穴与外孔型洞穴在协调数（p = 0.06）和分支强度（p = 0.62）方面也没有显著差异。

4. 讨论
4.1 每两个月扫描一次土壤柱以监测蚯蚓洞穴网络
我们的一个目标是开发并测试一种监测田间蚯蚓掘洞率的方法。我们的研究表明，使用暂时从田间取出的穿孔圆柱进行X射线成像是可以实现的。直径为11毫米的孔允许蚯蚓（即使是大型的外孔型个体）从各个侧面进入和离开土壤核心。虽然早期研究已经通过在田间条件下安装的土壤柱进行重复X射线扫描来监测土壤结构的变化（Koestel & Schlüter 2019），但只有少数研究（Leuther等人，2023年；Schefer等人，2025年；Védère等人，2025年）利用了穿孔的墙壁来允许大型动物和根系自由进入和离开土壤柱。据我们所知，我们是第一个每隔大约两个月量化蚯蚓掘洞率的研究。Védère等人（2025年）将土壤核心在穿孔圆柱中培养了一年，然后量化了大型动物的孔隙网络。他们的研究在世界各地的多个地点进行，并将生物孔特性与特定的大型动物（如蚯蚓）联系起来。Schefer等人（2025年）和Leuther等人（2023年）的研究都显示了土壤结构在6至24个月长期内的发展变化。为了更好地捕捉生物孔隙中的时间动态变化，Védère等人（2025年）建议使用更短的时间间隔进行扫描，这也是我们在研究中采用的方法。Leuther等人（2023年）估计了土壤结构更新率，并得出结论认为大型动物的活动是土壤结构动态变化的主要驱动力，但他们没有明确量化蚯蚓的掘洞速率。Koestel和Schlüter（2019年）使用了一种上下开口但侧壁坚固、不允许大型动物横向移动的土壤柱。他们提到蚯蚓形成的生物孔隙是土壤结构动态变化的重要因素，但没有量化蚯蚓对大孔隙度变化的相对贡献。Leuther等人（2023年）每六个月扫描一次他们的土壤柱，而我们则是大约每两个月扫描一次。更短的时间间隔有助于更好地将土壤环境条件与土壤大孔隙结构的变化联系起来。

我们比较了两种方法：一种是在每次扫描后重新安装相同的土壤柱；另一种是在每次扫描后用新土壤重新填充土壤柱。使用相同的土壤可能更接近“自然”条件，可以识别新形成的洞穴和洞穴的破坏情况，并量化蚯蚓洞穴的持久性，但这需要每次扫描时对图像进行对齐，且这些量化结果受土壤圆柱体变形或收缩/膨胀的影响。而使用每次扫描后用新土壤重新填充的土壤柱则便于量化新形成的洞穴，且不需要图像对齐，但不利于量化洞穴的“更新”或持久性。根据我们的研究，使用相同的土壤柱似乎更有优势，因为图像对齐不是主要问题；而且从土壤柱的对齐情况来看，土壤芯样本没有明显变形（例如由于收缩-膨胀现象）。不过，这一经验可能不适用于其他类型的土壤或气候条件。在未来的研究中，我们建议使用标记来辅助对齐过程。

在新填充的土壤中，蚯蚓的掘洞速率高于使用“相同”土壤的情况。目前尚不清楚这是由于新土壤中的未占据区域提供了吸引蚯蚓的有利条件，还是因为蚯蚓不愿意进入已经有人类洞穴的“相同”土壤中。Capowiez和Belzunces（2001年）通过2D实验室实验表明，外栖性蚯蚓会避开已有的洞穴，而内栖性蚯蚓则不会这样做。用新土壤重新填充的土壤柱可能类似于土壤耕作后的情况，之后蚯蚓可以重新塑造土壤结构。我们推测，在给定的土壤湿度和温度条件下，新重塑的“新鲜”土壤可能表示潜在的最大掘洞速率，但这需要在未来的研究中进行验证。相比之下，重复扫描相同土壤可以提供关于达到稳定洞穴结构所需时间的信息（例如在某种干扰后）。我们的数据显示，在五个月的研究期末，可能达到了一个稳定状态（即新形成的洞穴与消失的洞穴达到平衡，见图4b）。Védère等人（2025年）将土壤芯样本培养了一年，发现在大多数地点生物孔隙在一年内会再生。

如果进行更频繁的扫描或延长总的观测期，将有助于建立掘洞速率与土壤环境条件之间的稳健关系。量化土壤圆柱体内的蚯蚓排泄物也会很有意义，因为这可以与Capowiez等人（2014年）的发现进行比较，他们报告称内栖性蚯蚓形成的洞穴中有40-50%被排泄物填充，而外栖性蚯蚓形成的洞穴中这一比例仅为约20%。然而，由于无法区分蚯蚓排泄物与周围土壤基质之间的密度差异，因此无法在图像中识别出排泄物，这也可能导致洞穴体积被低估。因此，尽管我们量化了两次扫描之间消失的洞穴体积，但我们无法确定其消失的机制，即洞穴是由于坍塌还是被排泄物填满。

4.2 蚯蚓洞穴系统的时间动态和掘洞速率

在新填充的土壤中，从7月到9月掘洞速率增加，而在9月中旬到10月的最后阶段略有下降。在使用相同土壤的土壤柱中，从5月到10月掘洞速率逐渐下降。根据深度分布的分析，在第一个研究阶段，50%的洞穴体积位于土壤较深的部位。这种差异可能是由于第一个研究阶段的土壤较为干燥所致。我们发现掘洞速率随着土壤湿度的增加而增加，而土壤温度的影响较弱。Gergs等人（2022年）也得出了类似的结果，即当土壤湿度增加时蚯蚓活动增加。受控条件下的研究表明，土壤湿度和温度会影响蚯蚓的活动和发育。较高的土壤湿度和温度可以促进蚯蚓的生长和发育（Wever等人，2001年；Taylor等人，2019年），从而增加蚯蚓的生物扰动作用（Taylor等人，2019年；Torppa和Taylor，2022年）。研究表明，温度升高会增加蚯蚓的掘洞活动和地表排泄物的产生。例如，Perreault和Whalen（2006年）发现，在5℃时洞穴长度比15℃时短40-80%。土壤湿度和温度决定了蚯蚓是否活跃或进入夏眠状态，这种反应因物种而异。例如，Aporrectodea caliginosa在冬季由于低温进入夏眠状态，而在夏季由于土壤干燥进入夏眠状态；而Lumbricus terrestris对温度的敏感性较低，其活动主要由土壤湿度控制（Nordstr?m和Nordstrom，1975年；Andriuzzi等人，2015年；Potvin和Lilleskov，2017年）。在干旱期结束时进行的首次扫描中，我们在一些土壤柱中发现了处于夏眠状态的蚯蚓（见补充图S2），这可以解释第一个研究阶段掘洞速率下降的原因。在第二和第三阶段没有发现处于夏眠状态的蚯蚓。

关于野外条件下蚯蚓生物扰动和掘洞速率的知识仍然有限。Leuther等人（2023年）采用了与我们研究类似的方法，证明大型动物尤其是蚯蚓的掘洞是表土结构更新的重要驱动力。他们在Luvisol（年平均降水量约500毫米）和中壤土（年平均降水量约900毫米）中分别估计了表土结构更新时间为16年和33年（假设土壤生物可以接触到样本），并认为地点之间的差异可能是由于土壤湿度的不同。根据我们覆盖从5月底到10月底的数据，估计的平均蚯蚓掘洞速率表明整个表土体积大约在12-24年内被挖空（取决于处理方式），即表土的“更新时间”为一到二十年。这些估计没有考虑蚯蚓在冬季的潜在不活跃期或春季的活动模式——因此需要涵盖全年（或更长时间）的进一步研究。如果我们假设蚯蚓仅在4月中旬到11月中旬活跃（此时土壤温度足够高），那么估计的“掘洞更新时间”将为21-42年。这些数字虽然不确定，但可以大致说明蚯蚓处理整个表土所需的时间。值得注意的是，在2D实验室实验中获得的掘洞速率更高（例如Arrázola-Vásquez等人，2022年），这可能是因为这些实验中的土壤条件更有利于蚯蚓掘洞。

4.3 由外栖性和内栖性蚯蚓创建的蚯蚓洞穴系统的识别

在这项研究中，我们发现4毫米的直径阈值可以区分“外栖性”洞穴（直径>4毫米）和“内栖性”洞穴（直径<4毫米）。这种基于直径的分类方法适用于成年蚯蚓。已知外栖性种类的幼体行为更接近内栖性种类。因此，用我们的方法，直径小于4毫米的年轻蚯蚓会被归类为内栖性，但这种方法实际上反映了它们的掘洞行为。视觉检查（例如图6）和3D洞穴网络的量化显示，由外栖性蚯蚓创建的洞穴相对较直（即弯曲度较低），其他研究也发现了这一点（Capowiez等人，2001年；2011年；2015年）。由于排泄物和洞穴坍塌的影响，我们研究中计算的弯曲度可能低估了洞穴的实际弯曲度（见补充图S9）。由于外栖性洞穴更稳定，内栖性洞穴的弯曲度应该更大。内栖性蚯蚓更倾向于形成簇状或单独的洞穴，这与早期研究结果一致（Capowiez等人，2015年）。尽管我们的野外站点中的蚯蚓群落中内栖性个体远多于外栖性个体（见补充表S2），并且“内栖性洞穴”的数量也更多，但外栖性洞穴的体积比例平均约为40%。使用我们的方法，我们无法在物种层面将洞穴归因于特定的蚯蚓种类，也无法确定洞穴内的物种组成是否与周围土壤的物种组成一致。根据我们的分析，外栖性蚯蚓创建的洞穴具有更高的持久性（两次扫描之间消失的洞穴比例=0.28），而内栖性蚯蚓的这一比例为0.52。如果一年内更频繁地量化洞穴，可以提供关于洞穴持久性的额外信息。“外栖性洞穴”的特征（即低弯曲度、尽管数量少但体积大、时间稳定性高）对土壤功能有重大影响。垂直稳定的大孔隙与土壤表面的连接有助于水分渗透、土壤通气和土壤与大气之间的气体交换。特别是在饱和条件下，水分主要通过蚯蚓洞穴流动，洞穴与土壤表面的连通性和连续性对这一过程影响显著（Francis和Fraser，1998年）。此外，植物根系可以利用这些洞穴到达更深层的土壤或绕过压实层（例如犁层）。

未来的研究可以评估实现最佳土壤功能所需的“外栖性洞穴”数量和外栖性蚯蚓的数量，或者“外栖性洞穴”与“内栖性洞穴”的最佳比例。能够识别出由外栖性和内栖性蚯蚓创建的洞穴并监测各自洞穴系统的时间动态，可以为了解外栖性和内栖性蚯蚓的生态学及其作为土壤生态系统工程师的作用提供新的见解。

5. 结论

使用穿孔圆柱体监测蚯蚓的掘洞速率是一种可行的方法，因为蚯蚓可以进出这些圆柱体，并定期对土壤柱进行X射线扫描。使用“相同”土壤的土壤柱提供了更多关于孔隙网络系统发展的信息，因为可以量化新形成的洞穴和消失的洞穴。每次扫描后用新土壤重新填充的土壤柱可能更适合测量田间土壤的最大掘洞速率。“相同土壤”处理的数据表明，五个月后蚯蚓洞穴体积达到了稳定状态，表现为洞穴形成与消失之间的平衡。根据洞穴直径，我们可以区分可能由内栖性蚯蚓（洞穴直径≤4毫米）和外栖性蚯蚓（洞穴直径>4毫米）创建的洞穴，这可以为这些蚯蚓类的掘洞行为提供新的见解。内栖性蚯蚓创建的洞穴体积占比约为60%，外栖性蚯蚓则约为40%。与内栖性洞穴相比，外栖性洞穴在时间上的持久性更强。通过蚯蚓群落对洞穴的量化研究有助于更好地理解和模拟它们在土壤生态系统中的功能。本研究提出的方法用于评估野外蚯蚓群落的挖掘速率，而非仅针对特定物种或单个蚯蚓在封闭容器中的行为，这使我们能够更深入地了解实地条件下的蚯蚓挖掘活动。进一步的研究可以帮助将挖掘活动与土壤功能联系起来。更高的时间分辨率有助于将环境条件与挖掘速率相关联。为了明确限制蚯蚓挖掘活动的因素，需要对其进行全年（包括冬季）的监测。

**作者贡献声明：**

- **Rebecca Naomi ter Borg**：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验实施、数据分析、数据整理及概念构建。
- **Mats Larsbo**：撰写审核稿、项目监督、方法设计、资金筹措、数据分析及概念构建。
- **Yvan Capowiez**：撰写审核稿及概念构建。
- **Pascal Benard**：撰写审核稿及数据分析。
- **Astrid Taylor**：撰写审核稿。
- **Daniel Iseskog**：方法设计。
- **Thomas Keller**：撰写审核稿、项目管理工作、方法设计、资金筹措及概念构建。