将可持续的分光光度测量方法与基于人工智能的数据分析相结合，用于同时测定卡维地洛、氢氯噻嗪及一种有毒杂质

《Green Analytical Chemistry》：Integration of Sustainable Spectrophotometric Methods and AI-Driven Data Analysis for Simultaneous Determination of Carvedilol, Hydrochlorothiazide and a Toxic Impurity

　　莫娜·纳比尔 | 南希·W·纳沙特 | 霍达·M·马尔祖克 | 萨玛赫·S·阿巴斯 | 海亚姆·M·洛夫蒂
开罗大学药学院药物分析化学研究生项目，卡斯拉埃阿因街，开罗11562，埃及

**摘要**
本研究探讨了结合人工智能（AI）技术的创新光谱法，用于精确检测组合药物中的化合物卡维地洛（CAR）和氢氯噻嗪（HCT）。这种组合药物被认为是治疗伴有糖尿病的高血压患者的最有效疗法之一，同时还能检测潜在的氢氯噻嗪相关杂质——沙拉酰胺（4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺，DSA）。通过全面的验证参数评估了这些方法的适用性，并评估了AI驱动算法在数据分析方面的效率。研究表明，这些方法无需预先分离样品，即可实现可靠、可持续且环保的光谱分析。其中，分解响应谱技术是实现这一独特集成解决方案的关键，能够完全分离混合物中的目标分析物，从而在它们的最大吸收波长处测定其浓度。所开发的方法包括：同时吸光度分离（SAR）结合吸光度分离（SAR-AR-SS）和光谱减除（SAD-RE-SS）、双振幅差结合比率提取和光谱减除（DAD-RE-SS）。这些方法用于测定纯形式下CAR（285.5 nm波长，浓度范围4.0-40.0 μg/mL）、HCT（270.5 nm波长，浓度范围2.0-20.0 μg/mL）和DSA（265.7 nm波长，浓度范围2.0-16.0 μg/mL）的浓度。根据ICH标准对这些方法进行了验证。这些技术可成功应用于原材料和市售产品的质量控制检测。此外，通过多种适用性、环保性、可靠性和可持续性评估工具（如点击分析化学指数（CACI）、蓝色适用性等级指数（BAGI）、分析绿色性（AGREE）、改进绿色分析程序指数（MoGAPI）、分析绿色之星区域（AGSA）、碳足迹减少指数（CaFRI）、分析方法可靠性指数（AMRI）、红色分析性能指数（RAPI）及分析方法可持续性指数（SAMI）等，验证了所提出方法的适用性、生态可持续性及可靠性，并将其与现有技术进行了比较。

**1. 引言**
高血压是导致动脉粥样硬化性心血管疾病的主要可预防因素，对全球大量人口构成严重健康挑战。联合使用抗高血压药物可以降低血压、保护器官并减少副作用[1]。高血压与2型糖尿病常同时发生，糖尿病患者的高血压发病率是正常人的两倍。此外，高血压患者还普遍存在胰岛素抵抗，这显著增加了他们患糖尿病的风险。这两种状况都会导致微血管和宏观血管疾病[2]。卡维地洛（CAR）是一种第三代β受体阻滞剂，具有α1受体阻滞作用[3]，其优势在于优异的代谢特性，尤其适用于伴有多种疾病（如糖尿病）的患者。其降血压机制不同于传统β受体阻滞剂，主要通过降低血管阻力来实现，对心率的影响较小，且不像美托洛尔或阿替洛尔那样容易引起体重增加[4]。多项研究表明，卡维地洛在改善糖尿病患者的脂质和葡萄糖代谢以及减轻脂质氧化方面优于阿替洛尔和美托洛尔[5][6][7][8]。

**文献综述**
已有报道表明，卡维地洛的定量分析可通过滴定[9,10]、光谱[11]和色谱[12]技术进行，无论是单独使用还是与其他药物联合使用。氢氯噻嗪（HCT）是一种噻嗪类利尿剂，其作用机制是阻断远端肾小管顶膜中的Na+–Cl–转运蛋白[13]。无论是单组分还是多组分制剂，其定量均可通过滴定[14]、光谱[15]和色谱[9,16]方法实现。Co-Dilatrol?片剂同时含有HCT和卡维地洛，两者联合使用可产生显著的协同效应，快速缓解高血压症状[17]。多项研究显示，卡维地洛治疗对高血压和糖尿病患者的代谢指标有积极影响[18][19][20]。

**杂质检测**
杂质检测是药品开发中的关键环节，国际监管机构要求确保药品的安全性、有效性和质量[21][22][23][24][25][26]。根据英国药典，沙拉酰胺（DSA）被列为与HCT相关的杂质（HCT杂质B）[9]。研究表明，DSA具有致癌性[27]。文献中提到了多种同时测定CAR和HCT的方法，包括光谱[3][28][29][30][31][32]、HPLC[33][34][35]、HPTLC[36]和CE[37]技术。这些方法对于治疗药物的监测、杂质表征和产品质量评估至关重要。

**光谱分析方法**
光谱分析是实验室中最常用和分析能力最强的技术之一，操作简便、成本低廉且易于使用。现代光谱仪配备软件控制系统，可进行光谱数据的采集和存储。内置计算机中的集成模块支持数学运算（如加减乘除和衍生化）。基于不同的数据处理步骤，光谱分析平台包括零阶光谱（I）、导数光谱（II）、比值光谱（III）以及涉及衍生化的处理后的比值光谱（IV）。这些先进方法可用于分析含有多种成分的复杂样品[38][39][40][41][42][43][44][45][46][47][48][49][50]。与化学计量方法相比，光谱分析无需购买专用软件或专业技术人员，操作更便捷，且成本效益更高。分解响应谱技术能够高效重建目标药物的光谱特征，提高选择性，并显著减少溶剂消耗，符合绿色化学原则[32][51][52][53][54][55][56][57]。

**人工智能在分析中的应用**
人工智能已成为分析方法效率评估的重要工具，能进行高级数据分析和模式识别[70][71]。通过机器学习算法，AI可快速处理大量数据，识别关键性能指标（如准确度、精度和重复性）。它自动化了方法验证过程，减少人为错误并提高分析效率。将AI集成到分析方法评估中可提升可靠性、加速开发进程，并支持各种科学和工业应用中的持续优化。免费的人工智能解决方案更具灵活性和定制性，用户可按需调整工具，同时保障数据隐私和安全性。绿色分析化学（GAC）原则强调环保和减轻分析方法对环境的影响[58][59]。专门评估工具（如CACI、BAGI、MoGAPI、AGSA、CaFRI等）用于评估分析方法的环境影响和实用性。

**方法适用性分类**
分析方法的适用性可根据所分析的活性药物成分（API）的类型和数量进行分类：
- **第一类（范围有限）**：仅适用于单一类型的基质（纯粉末形式）。
- **第二类（范围较窄）**：适用于两种类型的基质（纯粉末形式及不同比例的实验室混合物或制剂）。
- **第三类（范围适中）**：适用于多种基质（纯粉末形式及不同比例的实验室混合物或有效制剂）。
- **第四类（范围广泛）**：适用于多种类型的基质（纯粉末形式及不同比例的实验室混合物，包括含有相关物质的混合物、有效制剂及生物液体）。
- **第五类（范围极广）**：适用于多种复杂基质，具有高度多样性（包括含有不同比例的相关物质的有效制剂和生物液体）。

**结论**
人工智能在分析方法评估中发挥着重要作用，提高了分析效率、优化了数据处理流程，并促进了创新发展。免费的人工智能解决方案具有成本优势，用户可自由定制工具，同时确保数据安全和隐私。绿色分析化学原则倡导可持续和环保的分析实践，通过减少样品、试剂和有机溶剂的用量来降低环境影响。因此，本研究旨在通过最小化样品和有机溶剂的消耗来符合GAC原则。我们的主要目标是评估软件生成的因子化光谱在分析药品方面的适用性和效率。我们利用人工智能对获得的结果进行数据分析，以评估所研究方法的效率。我们研究了光谱分辨率因子如何影响配方中药物分析的准确性和可靠性，并确定了使用这些因子的优势和局限性。我们使用了多种评估工具，包括CACI、BAGI、AGREE、AGREEprep、MoGAPI、AGSA、CaFRI、AMRI、RAPI和SAMI，对所开发的分光光度方法的整体适用性、环保性、可靠性和可持续性进行了全面评估，并与先前报道的方法进行了比较。

CAR、HCT和有毒杂质DSA的紫外光谱显示出显著的光谱重叠，这使得单独准确量化每种化合物变得复杂。值得注意的是，HCT和DSA的光谱在零级光谱中有两个等吸点——即在零级光谱中两种组分的吸光度值相同的特定波长。当使用其中一种药物作为除数时，得到的比值光谱会从等吸点转移到等吸比点。这种光谱行为需要使用专门的分析技术来有效解析和解释复杂的光谱。克服这一挑战对于获得精确和可靠的分析结果至关重要。

我们开发并应用了不同的分辨率方案，包括零级光谱（窗口I）和比值光谱（窗口III），这些方案利用因子化光谱和等吸点/等吸比点来分析CAR和HCT在它们的复合降压药物中的含量，即使存在HCT杂质（即DSA）。这些方法根据国际协调会议（ICH）[74]的要求进行了优化和验证，证明了它们符合规定的接受标准。这项工作重点在于如何通过分析获得的结果将人工智能整合到分析方法的评估中，以提高其可靠性，加速方法开发，并支持分析程序的持续优化。此外，还使用了多种评估工具，如CACI [65]、BAGI [66]、AGREE [60]、AGREEprep [61]、MoGAPI [62]、AGSA [63]、CaFRI [64]、AMRI [67]、RAPI [68] 和 SAMI [69]，对这些分光光度方法的整体适用性、环境友好性、可靠性和可持续性与先前报道的方法[3,[28], [29], [30], [31], [32], [35]进行了全面评估。

2. 背景
2.1. 使用分光光度平台各种窗口的分辨率模式
这种分辨率方法处理混合物的吸收光谱，使用原始或经过数学处理的吸光度值。目标是通过应用因子化光谱，在窗口I和III内同时实现组分分离和鉴定，并遵守选定波长下药物的既定线性范围。方法开发需要扫描各个分析物的光谱，以仔细评估它们的独特轮廓、光谱重叠程度（部分或完全）以及临界点的存在，如等吸点（对于零级光谱）或等吸比点（对于比值光谱）。为了分析三元混合物并获得可信和精确的数据，仔细优化分光光度仪的参数是必不可少的步骤。基于调整后的吸光度数据（?A）或振幅差异（ΔP）[ [52], [53], [54], [57], [75], [76], [77], [78]）的分辨率方案被应用于记录或调整后的吸光度数据中，结合吸光度分辨率和光谱减法方法（SAR – AR-SS）、同时振幅差异结合比值提取和光谱减法方法（SAD-RE-SS）以及双振幅差异结合RE和SS方法（DAD-RE-SS）。在获得分析物的原始光谱后，使用它们的回归模型来确定X和Y在其相关吸光度最大值处的浓度。

2.1.1. 窗口I：利用混合物零级光谱的方法
2.1.1.1. 同时吸光度分辨率结合吸光度分辨率和光谱减法方法（SAR-AR-SS）
- 同时吸光度分辨率：这种新方法被认为是应用因子化光谱来确定三元组合X、Y和Z，其中X和Y的光谱有两个等吸点（λiso1和λiso2）（可以通过将相同浓度的X和Y的光谱与实验室制备的混合物的光谱（其中每种化合物的浓度减半）进行重叠来验证这两个等吸点）。混合物在这两个等吸点的吸光度分别为：
(1)[A]iso1=[ax1Cx]+[ay1Cy]+[az1CZ]
(2)[A]iso2=[ax2Cx]+[ay2Cy]+[az2CZ]
其中，A iso1和Aiso2分别是X+Y+Z混合物在两个等吸点处的吸光度，(aX1, aY1, aZ1)和(aX2, aY2, aZ2)分别是X和Y在两个等吸点处的吸光度；CX、CY、CZ是它们的相应浓度。如果这两个等吸点的吸光度值不相等，则计算等吸度因子（IF），该因子等于不同浓度纯X或Y在Aiso1和Aiso2处的吸光度值的平均值：
(3)[ax1Cx]+[ay1Cy]≠[ax2Cx]+[ay2Cy]
(4)IF=Aiso1/Aiso2
(5)[ax1Cx]+[ay1Cy]=IF[ax2Cx]+[ay2Cy]
通过计算这些选定波长下的吸光度差异（方程1和2）并乘以等吸度因子IF（IF≥1或IF≤1），可以在这些选定波长下消除X和Y的贡献，仅显示Z的吸光度差异：
(6)[A]iso1?IF[A]iso2=[aZCZ]
1?IF[aZCZ]
2
使用分光光度仪的集成软件，按照以下步骤高效生成纯Z的FS：
步骤1：使用线性范围内的任何浓度获取Z的吸光光谱
步骤2：通过计算在不同纯X或Y浓度下在Aiso1到Aiso2处的平均吸光度比值来确定IF
步骤3：计算两个精心选定的波长（λiso1和λiso2）之间的吸光度差异（不论符号）（ΔA=A1?IFA2）
步骤4：用步骤2中计算出的吸光度差异除以步骤1中的吸光度，得到Z在这些波长下的FS，从而产生单位吸光度差异的光谱：
(7)Z=Z′(A1?IFA2)
其中记录了混合物在（λiso1和λiso2）处的吸光度，并计算了吸光度差异。然后将这个值乘以存储的Z的FS，得到原始的比值光谱Z，随后可用于解析Z的D0。
2.1.2. 窗口III：利用混合物比值光谱的方法
2.1.2.1. 同时振幅差异结合比值提取和光谱减法（SAD-RE-SS）
- 同时振幅差异
这种方法代表了二元混合物[53]的比值差异技术的改进，适用于三元组合X、Y和Z的同时定量。成功应用此技术的主要要求是在零级光谱中存在具有不同吸光度值的等吸点，这些等吸点在比值光谱中变为两个等吸比点（λ1和λ2），并且使用X'或Y'作为除数时振幅相等。例如，对于X、Y和Z的三元混合物，如果X和Y有两个等吸点，则可以根据以下表达式量化Z：
(11)[A]iso1=[ax1Cx]+[ay1Cy]+[az1CZ]
(12)[A]iso2=[ax2Cx]+[ay2Cy]+[aZ2CZ]
其中，A iso1和Aiso2分别是X+Y+Z混合物在两个等吸点处的吸光度，(aX1, aY1, az1)和(aX2, aY2, az2)分别是X和Y在两个等吸点处的吸光度；CX、CY和CZ是它们的相应浓度。当使用纯X的光谱（X′）作为除数生成比值光谱时，结果值反映了X在整个光谱中的恒定贡献：
(13)Pm=PX+PY+PZ
这里，(Pm)表示混合物比值光谱的振幅，PX、PY和PZ分别对应于组分X、Y和Z在等吸比点处的贡献，其中aX = aY。
2.1.2.2. 双振幅差异结合比值提取（DAD-RE-SS）
- 双振幅差异
聪明的DAD [55]方法用于三元混合物的解析，表现出高选择性和灵敏度。这种方法有效地消除了基质干扰，并通过使用一个组分作为除数来解析重叠的光谱。这种创新方法可以通过内置的分光光度仪软件方便地实现，应用Z的因子化比值光谱（FS?P）。
(28)X=Z/X′ΔP
通过以下顺序步骤生成Z的因子化比值光谱：
步骤1：在线性范围内，将纯Z的D0光谱除以纯X的光谱（X′）作为除数来生成Z的比值光谱。
步骤2：计算指定波长（λ1和λ2）之间的ΔP，此时X和Y的振幅差异相等。
步骤3：将步骤1中的比值光谱除以步骤2中计算出的振幅差异ΔP，以获得Z在比值中的FS：
(29)Z=Z/X′ΔP
对于解析后的比值光谱ZX′，将存储的Z的FS（方程19）乘以指定波长下混合物的ΔP，然后通过乘以除数得到Z的解析D0：
(30)ΔP.ZX′ΔP=ZX′
(31)ZX′*X′=z
最后，通过从具有振幅[Pr]的三元混合物的比值光谱中减去解析后的ZX′光谱，得到二元混合物X+Y的比值光谱：
(32)P(m)?ZX′={XX′+YX′+ZX′}?ZX′
(33)[Pr]=XX′+YX′
2.3. 比值提取（RE）
RE方法用于解析二元混合物X+Y。该方法[54]利用组分Y作为除数来解析X和Y的比值光谱。通过计算两种特定波长下的吸光度差异（ΔA = A1 - A2）（与Y的浓度成正比，而X的吸光度为零）来消除干扰。通过将纯Y的零级光谱（D0）除以选定波长下的ΔA来创建Y的因子化比值光谱（FS?P），其中消除了X的贡献。该方法的分析灵敏度取决于选定波长下的绝对吸光度差异。对于解析后的二元混合物（X+Y），在两个预定波长下测量吸光度。然后将得到的ΔA乘以纯Y的相应因子化光谱。
(34)ΔA.Y
(35)ΔA.Y(D°)
(36)YX′=Y
2.4. 光谱减法（SS）
- 光谱减法
(37)Am?(Y+Z)={X+Y+Z}?(Y+Z)=X
然后可以使用其最大值处的吸光度值（A）与Z、Y和X的浓度对应的回归方程来计算Z（CZ）或Y（CY）或X（CX）的浓度。

2.2. 背景
2.2.1. 使用分光光度平台各种窗口的分辨率模式
这种分辨率方法处理混合物的吸收光谱，使用其原始或经过数学处理的吸光度值。目标是通过应用因子化光谱，在窗口I和III内实现组分的同步分离和鉴定，并遵守选定波长下药物的既定线性范围。方法开发需要扫描各个分析物的光谱，以仔细评估它们的独特轮廓、光谱重叠程度（部分或完全）以及临界点的存在，如等吸点（对于零级光谱）或等吸比点（对于比值光谱）。对于分析三元混合物以获得可靠和精确的数据，仔细优化分光光度仪的参数是必不可少的一步。组件X由于遵循直线行为X/X′而被有效排除，而组件Y在这些波长下显示出零振幅差异。该过程表示如下：
(29)P1=(ZX′)1+(YX′)1+(XX′)1
(30)P2=(ZX′)2+(YX′)2+(XX′)2
(31)ΔP=(ZX′)1?(ZX′)2
Pm1和Pm2分别代表指定波长λ1和λ2处的振幅，ΔP表示所选波长之间的振幅差异。
将数值ΔP乘以存储的Z的因子分解比值光谱，可以得到Z的原始比值光谱(ZX′)，这可以用于解析X。
(32)ΔP.ZX′
ΔP=ZX′
将得到的比值光谱ZX′与除数X′相乘，可以恢复Z的原始光谱(D0)。随后，从混合物的总体比值光谱中减去这个重建的ZX′光谱，可以得到Y和Z的二元组合的比值光谱。
该过程由以下方程描述：
(33)P(m)?ZX′={XX′+YX′+ZX′}
(34)[Pr]=XX′+YX′
3.3. 比值提取与光谱减法（SS）：详见SAD-RE-SS
3.3.1. 仪器和软件
使用了一台岛津双光束分光光度计（Shimadzu Corporation，日本京都），配备尺寸匹配的1.00厘米石英cell进行分光光度分析。光谱扫描范围从200.0到400.0纳米，间隔为0.1纳米，使用相同的1厘米光程石英cell。光谱数据通过岛津UV-Probe 2.43系统软件自动获取。Microsoft Copilot（http://copilot.microsoft.com）是一个基于AI的平台，用于辅助优化分析过程。
3.3. 样品和溶剂
CAR和HCT纯样品由位于埃及开罗的Global Napi Pharmaceutical Industries提供。根据其推荐的官方方法，这些化合物的纯度分别为99.93% ± 0.62%和99.88% ± 0.52%。HCT的相关杂质DSA从德国Sigma Aldrich Chemie获得，纯度为99.80%。Co-Dilatrol?片剂制剂由Chemipharm合成（批号070140 A）。每个剂量包含12.5毫克HCT和25.0毫克CAR。作为溶剂使用了来自德国达姆施塔特的E. Merck的分析级乙醇。
3.3. 标准溶液
通过将适量的每种成分转移到100毫升容量瓶中，并使用乙醇溶剂，分别制备了浓度为1.0毫克/毫升的CAR、HCT和DSA的标准溶液。当保持在4°C时，这些标准溶液的稳定性至少为30天。通过用乙醇稀释相应的标准溶液，制备了含有100微克/毫升的CAR、HCT和DSA的工作标准溶液。
3.4. 程序
3.4.1. 光谱特性
分别记录了CAR、HCT和DSA在200.0-400.0纳米波长范围内的D0光谱，以乙醇作为空白。
3.4.2. 线性与校准曲线构建
在每种分析物的最大浓度范围内建立了校准溶液。测量了CAR在285.5纳米处4.0-40.0微克/毫升、HCT在270.5纳米处2.0-20.0微克/毫升以及DSA在265.7纳米处2.0-16.0微克/毫升的(D0)光谱吸收值，并据此计算了回归方程。
3.4.3. 分析光谱的制备
3.4.3.1 CAR的等因子分解诱导光谱（FSISΔA）
通过将任何CAR浓度的D0光谱在其线性范围内除以267.2纳米和290.1纳米处的吸收值，得到了CAR的等因子分解诱导光谱（FSISΔA）。290.1纳米处的值乘以HCT和DSA的等因子F（?A = A267.2/FA290.1）。HCT和DSA的等因子是它们线性范围内不同浓度下的平均吸收值比（A267.2纳米/A290.1纳米），用于将267.2纳米处的吸收值(A267.2纳米)与290.1纳米处的吸收值(A290.1纳米)相关联。
3.4.3.2 HCT的因子分解吸收差异光谱（FSΔA）
通过将(D0)光谱与任何纯HCT浓度在其线性范围内的值除以270.5纳米和259.4纳米处的吸收值，得到了HCT的因子分解光谱（FSΔA）（?A = A270.5 - A259.4）。
3.4.3.3 CAR的因子分解比值光谱
通过取CAR样本在其线性范围内的比值光谱，并以DSA的D0光谱作为参考，然后除以在267.2纳米和290.1纳米处测量的振幅差异（P267.2纳米 – P290.1纳米），生成了CAR的因子分解比值光谱。
3.4.3.4 HCT的因子分解比值光谱
通过取任何HCT浓度在其线性范围内与DSA的D0光谱的比值光谱，并将其除以279.4纳米和305.2纳米处的振幅差异（P279.4纳米 – P305.2纳米），得到了HCT的因子分解比值光谱。
3.4.4. 应用于实验室制备的混合物
为了制备不同浓度比值的校准混合物，将每种分析物的工作溶液的精确量转移到不同的10.0毫升容量瓶中。然后每个瓶子用乙醇稀释到刻度线。记录每个所得混合物在200.0纳米到400.0纳米范围内的吸收光谱并保存为数字形式。接着应用每种分析方法特有的数据处理步骤，并使用相应的因子分解光谱。
3.4.4.1 窗口I
3.4.4.1.1 CAR的SAR与AR和DSA方法的HCT和DSA的SS
对于每个记录的实验室制备的混合物的D0光谱，计算267.2纳米和290.1纳米之间的ΔA，其中290.1纳米处的吸收值首先乘以HCT和DSA的等因子（ΔA = A???.? - F·A???.?）。然后将这个ΔA值乘以CAR的因子分解光谱来重建CAR的原始D0光谱。之后，从总混合物光谱中减去每个获得的CAR光谱，从而分离出剩余的HCT和DSA的二元组合的D0。
进一步通过计算270.5纳米和259.4纳米之间的吸收差异（A270.5纳米 - A259.4纳米）来解析二元HCT-DSA混合物。将这个ΔA乘以HCT的因子分解ΔA光谱（FSΔA）来恢复HCT的D0光谱。最后，从二元混合物光谱中减去这个HCT光谱，得到DSA的D0光谱。
3.4.4.2 窗口III
3.4.2.1 CAR的SAD与RE和DSA方法的HCT和DSA
将每个报告的实验室制备的混合物的D0光谱除以DSA的D0光谱（6.0 μg/mL）。记录CAR在[267.2纳米和290.1纳米]处的比值光谱的振幅。将这些振幅差异乘以预先构建的CAR的FSΔP，得到混合物中CAR/DSA的比值光谱。将这个比值光谱乘以除数光谱DSA'（6.0 μg/mL），重建CAR的原始D0光谱。然后从总混合物光谱中减去这个CAR光谱，得到HCT和DSA的D0，从而恢复二元混合物。
之后，将每个获得的二元混合物除以DSA的吸收光谱（6.0 μg/mL）。记录CAR在[279.4纳米和305.2纳米]处的比值光谱的振幅。将特定波长处的ΔP乘以预先构建的HCT的因子分解比值光谱（FSΔP），得到HCT/DSA的比值光谱。随后，将获得的HCT比值光谱乘以除数光谱DSA'（6.0 μg/mL），从而恢复HCT的原始D0，再从二元混合物光谱中减去这个HCT光谱，得到DSA的D0。
3.4.4.2.2 CAR的DAD与RE和DSA方法的HCT和DSA
将每个记录的实验室制备的混合物的D0光谱除以DSA的吸收光谱（6.0 μg/mL）。记录CAR在[285.8纳米和272.9纳米]处的比值光谱的振幅。将特定波长处的ΔP乘以预先构建的CAR的FSΔP，得到混合物中CAR/DSA的比值光谱。然后将这个比值光谱乘以除数光谱DSA'（6.0 μg/mL），恢复CAR的原始D0光谱。最后，从混合物光谱中减去这个CAR光谱，得到HCT和DSA的D0。
通常，每个获得的二元混合物都除以DSA的吸收光谱（6.0 μg/mL）。如上述方法，记录[279.4纳米和305.2纳米]处的振幅，并计算它们的差异（ΔP）。将这个ΔP乘以HCT的FSΔP，得到HCT/DSA的比值光谱。随后，将获得的HCT比值光谱乘以DSA光谱（6.0 μg/mL），恢复HCT的原始D0。最后，从二元混合物光谱中减去这个HCT光谱，得到DSA的D0。
4.5. 应用于药物制备
4.5.1. 在有效的药物制剂中的应用
分别称量了10片Co-Dilatrol?片剂，研磨并彻底混合。从一片片中准确转移适量物质到100.0毫升烧杯中，然后加入50.0毫升乙醇，然后将此混合物进行30分钟的超声处理。将所得混合物通过Whatman 4滤纸过滤到100.0毫升容量瓶中，并用乙醇调整体积至刻度线，制备成标准溶液。进一步稀释这个标准溶液，得到CAR浓度为10.0微克/毫升和HCT浓度为5.0微克/毫升的两种独立溶液。对这些样品溶液应用之前描述的实验室制备混合物的程序。使用相应的回归方程计算CAR和HCT的浓度。
此外，通过向药物样品中加入已知量的纯标准品，然后按照相同的实验步骤进行标准添加方法。
4.5.2. 应用于含有杂质的复杂药物制剂
为了制备含有杂质的药物制剂，准确称量一定量的salamide（DSA）并溶解在适当的溶剂中，制备标准溶液。然后将这个标准溶液的一份加入到药物基质中，以达到所需的添加浓度，并通过轻轻混合确保均匀分布。对制备的制剂进行与有效样本相同的提取和分析步骤，包括样品制备、过滤和分光光度分析。应用相应的回归公式来确定每种方法中CAR、HCT和DSA的浓度。
4.5. 结果与讨论
重点研究了第三代β-阻滞剂（如卡维地洛），它们具有代谢和心血管效应。随着对开发快速、廉价、简单的分析方法以满足药品质量控制实验室需求的需求增加，分光光度方法得到了推广和发展[[38], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49], [50]]。
与色谱方法[21,79]相比，上述紫外方法具有优势，因为它们不需要复杂的处理和程序，只需要较少的努力和时间，并且溶剂使用量较少，同时提供了高的效率和灵敏度。
考虑到上述论点以及对CAR、HCT和DSA的零阶吸收光谱（图2b）的分析，观察到这些分析物的光谱之间存在重叠。这种重叠阻碍了同时估计这些组合中的分析物，使得分析特别具有挑战性。此外，即使少量的不需要的杂质也会影响药物制剂的安全性和有效性。因此，主要目标是建立能够解析这些组合混合物的智能分光光度方法，同时注重通过简化操作步骤来实现简便性，并确保能够准确地产生各自的吸收光谱。具体来说，CAR在λ max 285.5 nm处显示出峰值，而HCT在λ max 270.5 nm处显示出峰值，DSA在λ max 265.7 nm处显示出峰值。所提到的方法，即SAR-AR-SS、SAD-RE-SS和DAD-RE-SS，利用FS技术，被用来同时量化其药物组合制剂中的HCT和CAR，以及存在HCT相关杂质DSA的情况。此外，还成功比较了新方法和传统方法的优缺点。通过使用各种分解光谱获得的结果进行了统计比较，以确认它们估计研究分析物的能力。

5.1 方法优化与开发
所研究的方法有效地应用于记录的实验室制备的混合物中，这些混合物包含不同比例的CAR、HCT和DSA，并使用了不同的窗口。

5.1.1 窗口I
5.1.1.1 同时吸收度分辨率结合吸收度分辨率和光谱减法（SAR-AR-SS）
通过将10.0 μg/mL CAR的Do光谱除以267.2 nm和290.1 nm处的吸光度值，并将后者乘以HCT和DSA的等比因子F来获得CAR的等比分解诱导光谱（FSISΔA）；(ΔA = A267.2 - FA290.1)。在选定的波长下，CAR的等比分解光谱中的吸光度值应等于1，以确认获得的分解光谱的准确性，见图3。HCT和DSA的等比因子是它们在线性范围内的平均浓度（A267.2 nm / A290.1 nm），将267.2 nm处的吸光度（A267.2 nm）与290.1 nm处的吸光度（A290.1 nm）相关联，得出值为8.56。这个因子证实了干扰分析物（HCT和DSA）在指定波长下的吸光度平衡，而CAR表现出吸光度差异，因为这些选定的波长代表了HCT和DSA的等吸点，而HCT和DSA都表现出相等的吸收率。对于每个记录的实验室制备的混合物，267.2 nm和290.1 nm之间的ΔA值首先乘以因子F。然后，得到的(ΔA = A267.2 nm – FA290.1 nm)乘以CAR的等比分解诱导ΔA光谱（FSISΔA），以得到CAR的D0光谱；见图3。之后，从混合物的总光谱中减去这个得到的CAR光谱，从而得到HCT和DSA的D0光谱。

另外，通过将10.0 μg/mL HCT的Do光谱除以270.5 nm和259.4 nm处的吸光度值来获得HCT的分解光谱（FSΔA）；(ΔA = A270.5 - A259.4)。在这些指定的波长下，HCT显示出吸光度差异，而DSA显示出零吸光度差异。之后，对于每个得到的二元混合物，270.5 nm和259.4 nm之间的ΔA（A270.5 nm - A259.4 nm）乘以相应的HCT的FSΔA，从而恢复HCT的D0光谱。因此，每个得到的光谱从相应的二元混合物的光谱中减去，得到DSA的D0光谱。

5.1.2 窗口III
5.1.2.1 同时振幅差异结合比率提取和光谱减法（SAD-RE-SS）
通过使用标准DSA'（6.0 μg/mL）作为除数，将10.0 μg/mL CAR的比率光谱除以267.2 nm和290.1 nm之间的振幅差异（P267.2 nm – P290.1 nm）来生成CAR的分解比率光谱。在这些指定的波长下，HCT和DSA的比率光谱显示出零振幅差异，因为如前所述，这些选定的波长代表HCT和DSA的等吸点，HCT和DSA都表现出相等的吸收率，而CAR的比率光谱显示出振幅差异。每个测量的实验室制备的混合物都除以标准DSA'（6.0 μg/mL）。然后，测量每个实验室制备的混合物在(P267.2 nm – P290.1 nm)处的比率光谱的振幅差异，并将其乘以CAR的分解比率光谱，得到混合物中的CAR/DSA'比率光谱。然后将得到的比率光谱乘以除数DSA'（6.0 mg/mL）的光谱，以恢复CAR的原始D0光谱；见图4。之后，从相应的三元混合物的总光谱中减去得到的CAR原始D0光谱，以恢复HCT和DSA的D0光谱。

5.1.2.2 双振幅差异结合比率提取和光谱减法（DAD-RE-SS）
DAD方法允许使用DSA作为除数完全去除干扰分析物。通过计算两个选定波长之间的振幅差异，消除了来自DSA的恒定信号。这使得可以直接确定CAR，因为HCT/DSA比率显示出相等的振幅。使用含有不同比例HCT和DSA的实验室制备的混合物验证了该方法的有效性。在建议的方法中，通过使用标准DSA'（6.0 μg/mL）作为除数，将10.0 μg/mL CAR的比率光谱除以285.8 nm和272.9 nm之间的数值振幅差异（P285.8 nm – P272.9 nm）来生成CAR的FSΔP。在这些选定的波长下，CAR的比率光谱显示出振幅差异，而HCT和DSA的比率光谱显示出零振幅差异。每个测量的实验室制备的混合物都除以DSA的吸收光谱（6.0 μg/mL）。然后，在[P279.4 nm - P305.2 nm]处记录CAR的比率光谱的振幅差异，并将其乘以准备好的CAR的分解比率光谱（FSΔP），以得到混合物中的CAR/DSA'比率光谱。之后，将得到的CAR比率光谱乘以除数DSA'（6.0 μg/mL）的光谱，以恢复CAR的原始D0光谱。最后，从相应二元混合物的总光谱中减去每个得到的CAR光谱，以得到DSA的D0光谱。

5.2 在药物制剂中的应用
对包含CAR和HCT的有效药物制剂以及含有CAR、HCT和DSA的复杂制剂的分析显示，回收率超过99.0%，表明分析方法的准确性很高，且基质干扰最小。该方法显示出高精度，重复测量中的相对标准偏差低于2%。这些结果表明，开发的分析程序是可靠的、灵敏的，适用于量化有效药物制剂（清洁基质）中的CAR和HCT成分，以及它们在含有DSA的复杂基质中目标药物和有毒杂质的常规质量控制分析中的潜在应用。

5.3 方法验证
上述光谱方法的有效性是根据ICH [74]规定的指南进行的。该验证涵盖了方法的线性范围、灵敏度、精度、准确性、LOD（检测限）、LOQ（定量限）和稳健性等参数，同时考虑了扫描波长的最小变化（± 0.1 nm），如表1所示。定量限（LOQ）是方法验证中的一个关键参数，因为它定义了可以以可接受的精度和准确度可靠测量的分析物的最低浓度。确定LOQ可以评估方法的灵敏度，确保其能够准确量化低水平的分析物。此外，在LOQ水平上评估精度（重复性）和准确性（准确性），并确认接受的值，验证了该方法在检测和量化低浓度方面的可靠性。这对于确保方法的稳健性和适用性至关重要。

表2展示了使用窗口I和窗口III通过提出的光谱方法分析实验室制备的混合物时获得的特异性结果，验证了所研究方法的特异性，并且在校准范围内获得了合理的结果。

表2. 使用提出的光谱方法通过窗口I和窗口III分析实验室制备的CAR、HCT和DSA混合物的结果

结论：应用这些方法分析了不同分析物比例的混合物，验证了所研究方法的特异性。此外，上述方法的评估是通过标准加入技术（表3）完成的。表3. 通过应用情景确定Co-Dilatrol?片剂中的CAR和HCT，并应用标准加入技术得到的结果。

空单元格
窗口I
窗口III
SAR-AR-SSSAD-RE-SSDAD-RE-SS
发现百分比a ± 标准偏差
发现百分比a ± 标准偏差
发现百分比a ± 标准偏差

有效的Co-Dilatrol?片剂 B
编号 070140 A；标记含有25.0毫克卡维地洛和12.5毫克氢氯噻嗪
CAR(SAR)
HCT (AR)
DSA(SS)
CAR(SAD)
HCT (RE)
DSA(SS)
CAR(DAD)
HCT (RE)
DSA(SS)
ΔA 267.2 nm -290.1 nm
ΔA 270.5 nm -259.4 nm
ΔP 267.2 nm -290.1 nm
ΔP 279.4 nm - 305.2 nm
ΔP 285.8 nm -272.9 nm
ΔP 279.4 nm - 305.2 nm
D0 (285.5 nm)
D0(270.5 nm)
D0(265.7 nm)
D0(285.5 nm)
D0(270.5 nm)
Do (265.7 nm)
D0(285.5 nm)
D0(270.5 nm)
D0(265.7 nm)

102.37 ± 0.85
102.60± 0.72
ND
100.67 ± 0.71
101.87 ± 0.50
ND
99.83 ± 0.36
101.62 ± 0.45

添加了药物成分的Co-Dilatrol?片剂 B
编号 070140 A；标记含有25.0毫克卡维地洛和12.5毫克氢氯噻嗪
102.16 ± 0.35
101.75 ± 0.58
100.76 ± 0.21
101.02 ± 0.45
100.22 ± 0.30
99.26 ± 0.51
99.84 ± 0.36
100.17 ± 0.32
100.36 ± 0.14

声明的标准加入
回收百分比
CAR
HCT
CAR (SAR)
HCT (AR)
CAR (SAD)
HCT (RE)
CAR (DAD)
HCT (RE)
ΔA 267.2 nm -290.1 nm
ΔA 270.5 nm -259.4 nm
ΔP 267.2 nm -290.1 nm
ΔP 279.4 nm - 305.2 nm
ΔP 285.8 nm -272.9 nm
ΔP 279.4 nm - 305.2 nm

D0在285.5 nm
D0在270.5 nm
D0在285.5 nm
D0在270.5 nm
D0在285.5 nm
D0在270.5 nm
10.0
5.0
99.80
99.60
99.46
100.60
100.12
100.40
100.70
100.80
100.19
99.10
99.20
100.60
100.85
99.10
100.67
100.75
99.50
99.87

回收百分比 a ± 标准偏差
100.67 ± 0.71
101.87 ± 0.50
99.43 ± 0.36
101.62 ± 0.85
99.61 ± 0.47
100.29 ± 0.38

加入的CAR浓度（5.0、10.0和20.0 μg/mL）和HCT浓度（2.5、5.0和10.0 μg/mL）的平均值。
ND：未检测到（有效配方）。

此外，对所提出方法与官方方法[9]所得结果进行了统计评估，如表S1所示。另外，还对所提出方法与报告的HPLC [35]方法的结果进行了统计比较，后者用于在存在DSA的情况下估计CAR和HCT；表4。计算出的t值和F值低于其相应的理论值，表明所提出方法和官方方法之间以及在所提出方法和报告的HPLC方法之间在精确度和准确性方面没有显著差异，如表S1和表4所示。

表4. 所提出的分光光度法与报告的HPLC方法[35]在纯粉末形式下测定CAR、HCT和DSA的结果之间的统计比较。

空单元格
CAR
HCT
DSA

项目
D0 (285.5 nm)
报告的HPLC方法 [35]a
D0 (270.5 nm)
报告的HPLC方法 [35]a
D0 (265.7 nm)
报告的HPLC方法 [35]a
平均值
100.07
99.58
99.92
100.02
100.16
99.74
标准偏差
0.49
0.79
0.49
0.46
0.53
0.71
RSD%
0.49
0.79
30.49
0.46
0.52
90.71
n = 67
67
67

方差
0.24
0.10
62.41
0.24
0.10
16
0.28
0.90.50
4

学生t检验b
1.364 (2.201)
0.378 (2.201)
1.219 (2.201)
F检验b
2.599 (4.95)
1.135 (4.39)
1.795 (4.95)

报告的HPLC方法用于在存在DSA的情况下通过梯度洗脱测定CAR和HCT，流动相包含乙醇和0.1%甲酸，流速为1.0 mL/min，使用苯柱（4.6 mm × 15 cm），并在254 nm处进行紫外检测。

利用Microsoft Copilot进行AI辅助的效率评估
通过数据分析获得的成果，利用连续提示进行AI评估，数据准备步骤如下：
步骤1：实验数据准备
- 分析组合中的CAR和HCT
- 溶剂：乙醇
- 仪器：Shimadzu UV-Vis分光光度计
- AI工具：Microsoft Copilot（https://copilot.microsoft.com）
- 准备含有/不含有DSA的实验室混合物
- 记录混合物中每种成分的回收率（%）和标准偏差（SD）

步骤2：数据集组织
创建一个表格（表2），包括：
- 所提出的分光光度法
- 相应的回收率
- 标准偏差

步骤3：将数据输入Microsoft Copilot
使用提示：
> “评估与每种波长组合相关的标准偏差和回收率，以确定用于分光光度法的最优波长对。”

步骤4：AI分析和推荐
- Copilot评估数据集
- 基于最高回收率和最低标准偏差进行评估

步骤5：解释和应用结果
- 验证推荐的波长对是否符合准确性、精确度和稳健性标准

步骤6：使用验证参数进行数据分析；根据ICH Q2(R1)详细记录准确性、精确度、特异性、线性和稳健性，以符合监管要求和决策制定。
- 记录Microsoft Copilot作为AI工具的使用。

1. 准确性
- 所有分光光度法（SAR-AR-SS, SAD-RE-SS, DAD-RE-SS）的CAR和HCT回收率始终在98–102%的可接受范围内，确认了高准确性。
- 对于含有*DSA*的混合物，回收率也在此范围内，证明了该方法在所有三种分析物存在时的可靠性。

2. 精确度
- 复试测量中的低标准偏差表明*出色的重复性*和*中等精确度*。
- 在不同浓度比和杂质水平下的结果一致，进一步支持了该方法的精确度。

3. 特异性
- 方法能够有效区分混合物中的CAR、HCT和*DSA*。

4. 线性
- 在不同分析物比例（例如1:1到4:1）下，回收百分比保持稳定，确认了CAR和HCT的线性，以及当包含DSA时的线性。

5. 坚定性
- 方法在不同条件下（包括不同的杂质水平和分析物比例）保持一致的性能，表明了强大的*稳健性*。

建议的分析窗口
- *窗口III（DAD-RE-SS）对所有分析物显示出最一致和最完整的回收率，特别是在复杂混合物中。推荐在三种成分都存在时进行常规分析。

纠正措施
- 在可行的情况下，通过参考方法（例如HPLC）验证分光光度结果，以增强对特异性和准确性的信心。

5.4. 统计分析
按照AI的建议，使用分光光度结果与参考方法[35]（HPLC）对实验室制备的混合物和药物制剂进行了交叉验证，以增强对特异性和准确性的信心（表S3&S4）。

对所提出方法和官方方法获得的结果进行了单因素ANOVA统计分析；表S2。在这项研究中，计算出的F（Fcal）值低于表中列出的F（Ftab）值，且两个目标分析物的P值均超过0.05。这些结果表明，所提出的方法与官方方法之间没有显著差异，如表S2、S3和S4所示。

5.5. 适用性评估
所提出的分光光度方法属于第四类，表明其适用范围广泛（4-5种基质），涵盖了广泛的基质类别（纯粉末形式和实验室制备的混合物，以及在不同比例的相关物质存在的情况下的实验室制备的混合物，包括有效的和/或复杂的药物制剂或生物流体）。它们可以在不同的分析情境中分析多种不同的基质，显示出相当的多功能性和稳健性。这种分类强调了它们在复杂和多样化的分析应用中的适用性。而报告的分光光度方法的适用范围较为有限，因为它仅适用于（3种基质），能够分析几种不同的基质（纯粉末形式和实验室制备的混合物，以及有效的药物制剂）。

该方法的实用性和功能通过两个新工具进行了评估：CACI [65]和BAGI [66]。新的CACI工具展示了一种简单、实用、有效的且易于理解的方法来评估和比较分析方法，这些方法基于点击化学的基本概念。关键参数包括样本大小、样本制备、灵敏度、适用性、可行性、便携性和自动化，每个参数都给出了相应的分数来反映该方法与这些概念的符合程度。CACI中的图示颜色代码表示技术在每个评估参数上的表现。优秀的表现由彩色图示表示，灰色表示中等实用性能，黑色表示足够的表现或不符合规定参数。该软件作为开源资源可在bit.ly/CACI2025获取。BAGI工具是一种新的软件，用于有效评估分析方法的适用性。它作为绿色矩阵的补充工具，主要强调实用概念。使用连续的蓝色等级来显示最终分数，其中深蓝、蓝、浅蓝和白色分别对应于高、中和不符合规定参数的程度。关于总得分，建议分析方法的适用性得分超过60分。通过使用基于Web的应用程序（bagi-index.anvil.app）可以评估分析方法的适用性。显然，CACI考虑了BAGI软件中忽略的几个因素。CACI和BAGI工具分别对报告的HPLC方法[35]、报告的分光光度方法[3,[28],[29],[30],[31],[32]以及官方方法[9]进行了评估；表5。将CACI工具应用于所提出的方法，得分为77分，而报告的方法[3,[28],[29],[30],[31],[32]和报告的HPLC方法[35]分别得分为75分和73分，因为所提出的方法应用于四种基质；纯药物、实验室制备的混合物、有效的药物制剂和含有DSA的复杂药物制剂，而报告的方法仅应用于三种基质；纯药物、实验室制备的混合物和有效的药物制剂。此外，由于HPLC分析成本较高且分析时间较长，报告的HPLC方法得分较低。而官方方法[9]的得分分别为62分和64分，因为它们仅应用于一种基质；因此它们的适用性较低。另一方面，将BAGI工具应用于所提出的方法和报告的方法[3,[28],[29],[30],[31],[32]后，得分为87.5分，因此它们的适用性优于报告的HPLC方法和官方方法[9]，得分分别为85.67分和77.5分。最终，所提出的方法在适用性方面优于报告的方法和官方方法，因为其CACI得分较高（77分）。

5.6. 绿色评估
分析方法的绿色评估具有重要意义。这项评估的主要目的是通过减少或减轻有害溶剂来提高生态可持续性[32,35,58,59,80]。因此，需要创新的评估工具来评估所提出方法的环境影响，如AGREE [60]、AGREEprep [61]、MoGAPI [62]、AGSA [63]和CaFRI [64]。AGREE是一种分析绿色度量软件，可在https://mostwiedzy.pl/AGREE免费获取，它通过生成一个包含总体得分（范围从0到1）的图示来提供全面的评估。AGREEprep基于十个影响类别，每个类别转换为0–1尺度上的标准化子分数，然后这些子分数结合起来得到最终的整体评估分数。评估标准考虑了多个因素，包括溶剂的选择和使用、材料、试剂，以及废物产生、能源需求、样本大小和分析通量。评估还考虑了通过分配权重来区分每个标准的相对重要性。分析师旨在鼓励使用安全的试剂和材料，同时尽量减少有害废物的产生。因此，对标准3、4、5、8和10赋予更高的权重，强调产生无害废物、保持小样本体积和确保操作员安全的重要性。评估使用了一个开放访问、用户友好的软件平台进行，该平台生成了一个清晰且易于解释的图示，总结了总体性能和各个影响因素的贡献。开放访问软件的编译版本可在mostwiedzy.pl/AGREEprep获取。MoGAPI软件可在bit.ly/MoGAPI免费获取，提供了更精确的绿色度评估。它不仅提供了常用的GAPI工具的典型红/绿/黄图示，还通过计算总分提供了方法的总体绿色度评估。AGSA工具是一种分析绿色之星面积软件，可在bit.ly/AGSA2025免费获取，它提供了一种综合的评分方法，能够评估GAC的12个概念，并以星形图显示遵守程度。每个原则由星形图的一个不同轴表示，遵守程度由相应轴的长度反映。创新的CaFRI工具是一个综合的绿色度评估框架，将碳足迹作为主要的环境影响参数，专门用于评估传统的分析实验室实践。该评估考虑了各种关键参数，包括能源消耗、能源产生的碳强度、目标碳足迹减少措施的应用、样本存储和运输、人员参与、废物管理实践和资源回收举措。在CaFRI评估框架中，任何分析方法的最大可得分为100分。该工具被集成在用户友好的软件中，可在线免费获取（链接：https://bit.ly/CaFRI）。足迹图被划分为多个区域，每个区域对应特定的评估参数：红色表示性能不佳，黄色代表性能中等，绿色则表示最佳性能，同时也体现了绿色化学的理念。从问卷中收集的数据点被转换成一个0-100分之间的最终分数，其中完全符合绿色化学标准的流程可以获得满分100分。AGREE、AGREEprep、MoGAPI、AGSA和CAFRI工具被用于评估报告中的HPLC方法[35]、光谱测量方法[32]以及CAR和HCT的官方方法[9]，具体结果如表6所示。AGREE工具对所研究的方法及报告的方法[32]进行了评估，得分为0.73；而报告的HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为0.7、0.53和0.57。当使用AGREEprep工具对所提出的方法和报告的方法[32]进行评估时，得分为0.62；报告的HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为0.58、0.37和0.47。此外，使用MoGAPI工具对所提出的方法和报告的方法[32]进行评估，得分为82；而报告的HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为79、66和65。使用AGSA工具对所研究的方法及报告的光谱测量方法[32]进行评估时，得分为90.28；而报告的HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为84.72、68.06和72.22。CaFRI工具对所提出的方法和报告的方法[32]进行评估，得分为95；而报告的HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为86、74和78。最终，由于这些方法能够通过使用环保溶剂来最小化溶剂用量并减少仪器能耗，因此它们在AGREE、AGREEprep、MoGAPI、AGSA和CaFRI工具的评价中表现更为优越。

**表6. 根据AGREE、AGREEprep、MoGAPI、AGSA和CaFRI工具对提出的光谱测量方法、报告的方法及官方方法的绿色度进行评估的结果。**

**5.7. 红度评估**
分析方法的可靠性和“红色度”是科学实践中的基本要素，因为它确保获得的结果具有一致性、准确性和可靠性。可靠性反映了该方法在不同实验条件下能够产生接近真实值的可重复结果的能力[81]。通过两种创新工具AMRI[67]和RAPI[68]对方法的可靠性和“红色度”进行了评估。AMRI是一种分析方法可靠性指数，它是一种创新的评分系统和专用软件工具（链接：bit.ly/AMRI2026），旨在提供分析方法可靠性的标准化和定量评估。AMRI框架基于国际公认的验证指南（如ICH、FDA）构建，包含线性、工作范围、真度、精度、选择性、稳健性、稳定性以及对加标样品和实际样品的适用性等关键验证参数。每个参数都根据预定义的应用特定接受标准进行系统评估。RAPI工具是一种红色分析实践指数，使用简单的开源软件（链接：mostwiedzy.pl/rapi）根据十个预定义的标准来评估方法。每种标准的性能通过离散评分量表（0、2.5、5.0、7.5或10分）进行定量评分。分配的分数被直观地转化为相应的颜色强度和饱和度级别，范围从白色（0分）到深红色（10分）。基于这些评估结果，会自动生成一个星形图，并将其分割成代表各个标准的不同区域，其中显示 overall 平均定量分数（0-100）。在这方面，该工具与BAGI工具[66]在概念上类似，后者是一种最近推出的专注于实际适用性标准的工具，使用蓝色方案表示。AMRI和RAPI工具被用于评估报告中的HPLC方法[35]、光谱测量方法[32]以及CAR和HCT的官方方法[9]，具体结果如表7所示。使用AMRI工具对所提出的方法进行评估时，得分为79；而报告的光谱测量方法[32]、HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为75、79和61。RAPI工具对所提出的方法和报告的方法[32]的评估得分为77.5和75；报告的HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为75和47.5、57.5。最终，由于所提出的方法能够产生可重复且接近真实值的结果，因此它们在AMRI和RAPI工具的评估中表现更为优越。

**表7. 根据AMRI、RAPI和SAMI工具对提出的光谱测量方法、报告的方法及官方方法的红色度和可持续性进行评估的结果。**

**5.8. 可持续性评估**
化学分析中的可持续性需要综合性的评估工具，这些工具不仅要考虑环境因素，还要涵盖经济可行性、社会责任、创新性和实际适用性。SAMI[69]工具是一种分析方法可持续性指数，基于联合国的可持续发展目标（SDGs），链接：bit.ly/SAMI2026。SAMI利用系统化的评分框架，定量评估所有17项SDGs的相关正负贡献，从而从环境影响、经济可行性、社会责任和实际适用性等方面来评估分析方法。该工具还提供了颜色编码的可视化方式，以增强清晰度和可解释性。SAMI工具被用于评估报告中的HPLC方法[35]、光谱测量方法[32]以及CAR和HCT的官方方法[9]，具体结果如表7所示。使用SAMI工具对所研究的方法及报告的光谱测量方法[32]进行评估时，得分为60；而报告的HPLC方法及CAR和HCT的官方方法得分分别为54、30和40。因此，所提出的方法因具有最小的环境影响、最高的实际适用性和成本效益而获得了最高的SAMI分数。

**5.9. 所提出方法与报告的光谱测量方法的比较优势**
所提出的方法采用先进的技术，能够从光谱数据中提取关键信息。这些方法包括结合了同时吸收分辨率（SAR）和光谱减除（SS）的SAR-AR-SS、结合了同时幅度差（SAD）和比率差（RE）及光谱减除（SS）的SAD-RE-SS，以及结合了比率提取（RE）和光谱减除（SS）的DAD-RE-SS。这些方法在解决复杂光谱特征（如部分或完全重叠、等吸点、光谱延伸）方面表现出广泛的适用性，并且在使用专用光谱测量软件时需要最少的操作。这些技术的一个主要优势是使用了因子化光谱（FS），它们基于特定波长下的记录响应来生成分辨光谱。与先前报道的光谱测量方法[3],[28],[29],[30],[31],[32]相比，这些方法可以利用不同的窗口准确恢复混合物中分析物的D0光谱，从而高效地揭示其光谱特征。因此，目标药物可以在其λmax值处以高精度和真度进行定量测定。此外，因子化比率光谱可以在不需要大量手动操作的情况下恢复原始光谱。在应用于窗口I和III的分辨率策略中，使用纯组分光谱生成了CAR和HCT的FS，以验证方法的适用性。选择正确的因子化光谱类型（D0或比率）对于准确分离三元混合物中的分析物至关重要。采用了三种基于一种药物FS的光谱测量分辨率策略：CAR通过数学方法（SAR-AR-SS、SAD-RE-SS或DAD-RE-SS）实现；HCT和DSA则通过吸收分辨率（AR）、比率提取（RE）或光谱减除（SS）（通过算术运算实现）。对这些提出的方法与最近为CAR和HCT的药学分析开发的光谱测量技术进行了比较评估。虽然以前的方法仅专注于活性成分的定量，但目前的工作旨在同时定量药物及其相关的有毒杂质。所提出方法的范围更广，能够进行杂质谱型分析，支持稳定性研究，并符合ICH等法规标准中关于杂质检测和方法验证的要求。相比之下，现有方法仅限于活性药物的定量分析，缺乏进行杂质分析所需的灵敏度和特异性。所提出的方法具有更高的选择性，能够准确分离和定量复杂混合物中的所有组分，这使得它们更适合常规质量控制、安全性评估和法规提交。此外，所提出的方法在CACI评分中表现出更高的优势。

**6. 结论**
CAR和HCT的组合展示了作为降压剂和调节糖尿病患者胰岛素抵抗的双重治疗效果。本研究证明了基于人工智能的创新方法在准确和精确测定CAR、HCT及其杂质DSA方面的广泛适用性。AI通过数据分析结果来评估分析方法的效率。将AI结果与传统方法（如HPLC）进行比较，证实了它们的可靠性和准确性。研究结果表明，这些方法具有广泛的适用性（适用性IV），并且能够有效分析研究中的药物和杂质，同时表现出良好的准确性和精度。采用了多个分析窗口来有效分析相关组分：窗口I基于三元混合物的零级光谱，利用等效因子实现了各组分的准确定量；窗口III利用混合物的比率光谱和单一除数进行了分析；DAD-RE-SS在无需等效因子或等吸点计算的情况下实现了更好的回收率。这些方法依赖于零级光谱和比率光谱的应用，有效消除了干扰，生成了高纯度的光谱。此外，应用点击化学原理表明，这些方法比传统和官方方法更具通用性和适用性。与昂贵的HPLC和HPTLC技术相比，这些方法具有显著的优势，包括更简单的程序、更短的分析时间、更低的溶剂消耗以及更高的灵敏度，使其适用于常规质量控制。尽管这些方法的选择性与传统技术相当，但它们作为一种有效、可靠、可持续、实用且经济高效的选择，适用于实验室环境中组合药物制剂的分析。特别是在先进仪器设施有限的发展中国家，这些方法为药品混合物的同时分析提供了可行的解决方案，支持其在药品质量控制实验室中的应用。

**作者贡献声明**
Mona Nabil：撰写——原始草案、方法论、研究、数据分析、数据管理、概念化。
Nancy W. Nashat：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、概念化。
Hoda M. Marzouk：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、概念化。
Samah S. Abbas：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、概念化。
Hayam M. Lotfy：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、方法论、研究、数据分析、概念化。