丙醛脱氢酶的失活会触发 Clostridium ljungdahlii 的代谢重编程

《Green Carbon》：Aldehyde dehydrogenase inactivation triggers metabolic reprogramming in Clostridium ljungdahlii

　　刘子勇|张坤迪|史鹏辉|范一轩|查晓生|李兰鹏|张全|易志红|王淑宁|贾德辰|顾阳|Frank Bengelsdorf|李富丽
中国科学院青岛生物能源与生物过程技术研究院，青岛新能源实验室，光电转换与太阳能利用国家重点实验室，266101 青岛，中国

**摘要**
由于克雷伯氏菌（Clostridium ljungdahlii）具有负碳代谢特性，在果糖和合成气发酵过程中引起了广泛关注。该菌种通过双功能醇-乙醛脱氢酶（AdhEs）和乙醛：铁氧还蛋白氧化还原酶（AORs）将乙酰辅酶A、乙醇和乙酸的生物合成联系起来。本研究探讨了AdhE中的醛脱氢酶（ALDH）结构域在不同发酵过程中的代谢功能。ALDH根据碳源和能量来源的不同动态调节催化途径，从而协调细胞生长和产物组成，并维持细胞内代谢平衡。在果糖发酵过程中，ALDH的缺失通过重新平衡烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）代谢来增强乙醇的合成；而在一氧化碳（CO）发酵过程中，ALDH的障碍会抑制乙醛向乙酰辅酶A的转化，这一过程对NADH的再生至关重要。值得注意的是，在二氧化碳/氢气（CO2/H2）发酵过程中，ALDH的失活会中断乙酰辅酶A向乙酸的转化途径，导致细胞死亡。这些发现揭示了C. ljungdahlii中乙酸和乙醇代谢的调控机制，为合成气发酵的代谢工程提供了新的见解。

**1. 引言**
化石资源（如煤炭、石油和天然气）的广泛使用每年释放约400亿吨二氧化碳，造成了严重的生态破坏。利用产乙酸菌进行合成气发酵是一种可持续且负碳的解决方案[1][2]。产乙酸菌通过Wood-Ljungdahli途径（WLP）将二氧化碳（CO?）和/或一氧化碳（CO）转化为乙酸和乙醇，这是最热力学效率高的乙酸合成路线[3][4][5]。这些细菌（包括经过工程改造的菌株）目前被用于生物燃料和生物化学品的大规模生产[1][6]。
克雷伯氏菌（Clostridium ljungdahlii）是用于基于合成气生产乙醇的模型菌株[7]。通常，乙醇是通过双功能醇-乙醛脱氢酶（AdhE）分两步从乙酰辅酶A合成的，AdhE包含醛脱氢酶（ADH）和醛脱氢酶（ALDH）结构域，并将乙醇的形成与NADH氧化过程耦合起来[8][9][10][11][12]。有趣的是，C. ljungdahlii拥有两个相邻的adhE基因（CLJU_c16510–20），这在产乙醇细菌中较为罕见。该菌株还编码两种乙醛：铁氧还蛋白氧化还原酶（AORs；CLJU_c20110和CLJU_c20210），这些酶既能催化乙酸的还原生成乙醛，又能氧化还原型铁氧还蛋白（Fdred）[7][13]。AOR的存在形成了一个以乙醛为中心的代谢网络，提供了多种乙醇和乙酸的合成途径[2]；在某些条件下，乙酸和乙醇都可以作为底物重新利用。先前的研究表明，气体发酵过程中的乙醇形成主要依赖于AOR途径，其中AOR和ADH起关键作用；然而，ALDH在乙醇和乙酸代谢中的具体功能仍不清晰[14][15][16]。

**图1. 不同碳源和能量来源下克雷伯氏菌（Clostridium ljungdahlii）的中心代谢途径**
缩写说明：
- WL途径（Wood-Ljungdahl途径）；
- Pta（磷酸乙酰转移酶）；
- Ack（乙酸激酶）；
- AdhE（醛/醇脱氢酶）；
- AOR（乙醛：铁氧还蛋白氧化还原酶）；
- PFOR（丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶）；
- CODH（一氧化碳脱氢酶）；
- Fdh（甲酸盐脱氢酶）；
- Hyt（电子分叉氢化酶）；
- Fdred（还原型铁氧还蛋白）；
- Fdox（氧化型铁氧还蛋白）；
- Nfn（电子分叉和铁氧还蛋白依赖型转氢酶）；
- Rnf复合体（膜相关且节能的还原型铁氧还蛋白：NAD+氧化还原酶）；
- Rnf-ATP酶系统（由两个酶复合体组成，Rnf复合体通过Fdred与NAD+的氧化在膜上生成质子梯度；ATP酶复合体在细胞质中消耗质子梯度并将ADP磷酸化为ATP）；
- AdhE途径（通过AdhE催化乙醇生成）；
- AOR途径（参与乙酸和乙醇的生成）。

**图2. 克雷伯氏菌（Clostridium ljungdahlii）中C2化学品的代谢调节网络**
缩写说明：
- AdhE（醛/醇脱氢酶）；
- AOR（乙醛：铁氧还蛋白氧化还原酶）；
- Fdred（还原型铁氧还蛋白）；
- Fdox（氧化型铁氧还蛋白）。

底物类型决定了能量供应方式，从而影响细胞生长、产物组成和整体代谢（图1）。C. ljungdahlii能在多种底物上生长，常见的底物包括果糖、一氧化碳（CO）和二氧化碳/氢气（CO?/H?）[7][17][18]。果糖和一氧化碳既可作为碳源也可作为能量来源。果糖发酵通过糖酵解产生ATP、NADH和Fdred，这种广泛的克雷伯氏菌代谢特性使得基于糖的培养基适用于筛选工程菌株[7][19][20][21]。在一氧化碳发酵过程中，CO的氧化产生的Fdred驱动能量生成，支持细胞生长并使乙醇成为主要产物[21]。相比之下，二氧化碳/氢气发酵主要生成NADPH和Fdred（通过NADPH依赖性酶复合体CLJU_c06990-07080），导致能量平衡不同，乙酸成为主要产物[15][22]。因此，底物选择显著影响C. ljungdahlii的生长和代谢产物分布，但其背后的调控机制仍不甚明了。

在本研究中，我们从大肠杆菌（Escherichia coli）中表达了C. ljungdahlii的两种AdhE酶并进行了纯化，并构建了相应的缺失突变体，以研究它们在自养和异养发酵中的作用。我们证明，ALDH结构域根据碳源和能量来源的不同对氧化还原平衡的贡献也不同。阐明这一涉及ALDH的代谢网络为合理设计高效的乙醇和乙酸生产菌株提供了理论基础。

**2. 材料与方法**
2.1. 细菌菌株和培养基
C. ljungdahlii DSM 13528购自德国微生物与细胞培养物有限公司（DSMZ）。C. ljungdahlii菌株在改良的DSMZ 879培养基中培养，以果糖或合成气为碳源，在37°C的厌氧条件下进行发酵。ΔadhE1菌株是adhE1基因（CLJU_c16510）缺失的突变体，ΔadhE1+2菌株是adhE1和adhE2基因（CLJU_c16510-16520）都缺失的突变体。这两种突变体的构建和验证过程已在先前的研究中描述[18]。大肠杆菌菌株在LB培养基中生长，并添加适当的抗生素以进行质粒传播、克隆和蛋白质表达（表S1）。

2.2. AdhE的表达、纯化和酶活性分析
从C. ljungdahlii的基因组DNA中扩增出全长AdhE1（2613 bp）和AdhE2（2634 bp）序列，使用Gibson组装方法将其克隆到pGLO1质粒中[23]。将表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，在37°C下培养至OD600达到0.6。通过添加0.5 mM β-硫代半乳糖苷并在16°C下孵育18小时来诱导AdhE的过表达。随后，将大肠杆菌细胞在4°C下以8000 ×g的离心力沉降20分钟，然后重新悬浮于裂解缓冲液中。细胞裂解液经超声处理后，以12000 ×g的离心力在4°C下离心1小时。所得上清液使用Ni-NTA亲和层析法分离标记有His的AdhE蛋白，洗脱液使用200 mM咪唑。纯化后的AdhE通过SDS-PAGE检测纯度，并用BCA方法测定浓度。纯化过程在厌氧条件下进行，使用气体置换法去除培养基中的氧气。新鲜纯化的AdhE立即用于酶活性测定。

酶活性测定在96孔石英板上进行，温度为37°C，使用BioTek仪器监测340 nm处的NADH和NADPH的消耗和生成情况。每个实验条件设置三个重复实验，通过绘制吸光度变化曲线来表示酶活性。反应总体积为200 μL，首先加入0.4 μM纯化的AdhE酶，孵育30分钟。反应混合物包含0.2 μM底物、20 μM Fe2+和1.5 μM NAD+（NADH）或NAPD+（NADPH）。底物包括CoA、乙酰辅酶A、乙醇、乙酸和乙醛。根据图1中的途径组合辅因子和底物来检测AdhE、ALDH结构域和ADH结构域的酶活性。酶活性定义为每分钟转移2 μmol电子。

此外，还在37°C下，使用密封有橡胶塞的1.5 mL厌氧比色皿中测定不同发酵条件下细胞提取物中AdhE和AOR的酶活性。细胞提取物的制备和酶活性测定方法在先前的出版物中有详细描述[18][22]。酶活性定义为每分钟转移2 μmol电子。

2.3. 醛脱氢酶的分子动力学模拟
采用分子动力学（MD）模拟来研究AdhE1和AdhE2的动态特性。使用C. ljungdahlii的AdhE蛋白序列作为查询序列，与SWISS-MODEL在线程序（https://swissmodel.expasy.org/）进行比较。序列比对显示其与大肠杆菌AdhE的同一性为64.9%，因此选择大肠杆菌AdhE的晶体结构（PDB ID：6tqh.1.A）作为同源建模的模板。3D结构分析揭示了AdhE1和AdhE2在醛结构域内辅因子结合域的主要差异。因此，为了便于研究，3D结构建模仅关注它们的醛结构域，随后进行分子动力学模拟。

分子动力学模拟使用AMBER18软件套件进行。每个模型都溶解在周期性盒状TIP3P水分子中，水分子距离蛋白原子10.0 ?[24]。添加反对离子以中和模拟系统。蛋白质系统采用ff14SB力场。NAD+力场参数参考了相关文献[25][26]。在MD模拟之前，先对水和离子进行5000步的能量优化，然后对整个系统进行5000步优化，以消除潜在的不利相互作用。MD模拟使用AMBER18中的PMEMD.CUDA代码进行，在310.15 K的温度和1.0 atm的压力下进行，时间步长为2 fs。温度和压力通过Langevin算法调节[27]。使用Particle-Mesh Ewald方法计算静电相互作用，非键合相互作用的截止距离设为10.0 ?[28]。应用SHAKE算法约束所有涉及氢原子的键[29]。每个系统在NPT系综下平衡1000 ps，然后进行50 ns的生产MD模拟。使用PyMOL和Chimera软件生成图谱[30]。

2.4. 批量和连续批式发酵
野生型及突变体的批量发酵在装有果糖的改良DSMZ 879培养基的螺旋盖瓶中进行，重复三次。果糖发酵在250-mL螺旋盖瓶中进行，工作体积为50 mL，在36°C下使用摇床孵育。气体分析在10-L螺旋盖瓶中进行，工作体积为8 mL，在36°C的孵育器中使用磁力搅拌器。接种前用氩气冲洗瓶子的顶部空间，并收集发酵过程中产生的气体。突变体和野生型的连续批式气体发酵在FUS-5L生物反应器（Gouqiang Biotech Co. Ltd., 上海）中进行，培养基为2.5 L的改良DSM 897，实验重复两次。有关发酵参数和气体成分的详细信息可以在先前的出版物中找到[18][21]。每种菌株都进行了气体发酵研究，每个实验重复三次。

2.5. 通过RNA-seq技术进行基因表达分析
对野生型和突变体的指数生长期细胞进行比较转录组分析，研究三个生物重复实验中的基因表达模式。从生物反应器培养物中获得的细胞沉淀物在指数生长阶段以10,000 × g的离心力离心10分钟，立即置于液氮中冷冻，并储存在?80°C。RNA分离和高通量RNA测序（RNA-Seq）由Allwegenetech Corp.（北京，中国）完成。使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion, Santa Clara, CA, USA）按照制造商的协议提取总RNA。使用Agilent 2100 Bio-analyzer（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）评估RNA完整性，选择RNA完整性数（RIN）≥ 7的样本进行后续分析。根据制造商的说明使用TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit（Illumina, San Diego, CA, USA）构建文库，并在Illumina测序平台（HiSeqTM 2500）上进行测序，生成150 bp/125 bp的双端 reads。基于每百万映射读数中每个千碱基的转录本读取数（RPKM）标准化，分析了基因表达谱。在相同的代谢条件下，三个生物学重复实验的平均RPKM值被呈现在表格中，作为转录组比较的参考值。处理后的RNA-Seq数据被提交到ArrayExpress数据库（www.ebi.ac.uk/arrayexpress），访问号为EMTAB-13020和MTAB13021.2.6。

### 用于透射电子显微镜的菌株制备

在CO发酵条件下生长的野生型及ΔadhE1突变体的细胞（5 mL）在84小时时通过10,000 g离心10分钟进行收获。细胞用0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次以去除培养液。为了样品制备，将沉淀物在4°C下用2.5%戊二醛（2 mL）固定过夜。固定10小时后，细胞在室温下用0.1 M PBS溶液洗涤三次。之后，将重悬的细胞静置三十分钟再进行离心。然后，用1 mL新鲜1% OsO4染色1小时，随后用1 mL PBS缓冲液洗涤三次。细胞随后依次在30%、50%、70%、80%、90%和100%的丙酮浓度中脱水（每次各15分钟）。一部分脱水的细胞经过3:7和7:3的树脂-丙酮混合物（每种混合物1 mL）浸泡5小时，然后再用纯树脂浸泡10小时。在70°C下烘烤24小时完全固化后，使用钻石刀将样品切成70 nm厚的切片。最后，将切片放置在Formvar涂层的铜网格和显微镜载玻片上，用于透射电子显微镜观察。

### 分析方法

C. ljungdahlii菌株的生长情况通过使用2600分光光度计（Unico仪器公司，中国）在600 nm处测量光密度来进行监测，样品置于德国Müllheim的Hellma GmbH公司制造的石英比色皿中。在控制pH和气压的条件下培养的细胞，每隔12小时从生物反应器中取样。根据制造商的说明，使用商业检测试剂盒（NAD+/NADH Assay Kit with WST-8，S0176S，Beyotime，上海，中国）测定2 mL样品中的NAD+和NADH水平。乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的浓度使用Agilent 1260高效液相色谱（HPLC）系统进行测定，该系统配备有Agilent Hi-Plex H柱（Agilent Technologies，美国Santa Clara），并在35°C下运行，使用折射率检测器。柱子温度保持在55°C。流动相为稍微酸化的（5 mM H2SO4）水，流速为0.7 mL/min。分子氢（H2）和二氧化碳（CO2）通过GC系统（GC-7820，中国Tengzhou的Lunan Analysis Instruments Co. Ltd.）检测，该系统配备有TDX-01柱（2 m × 3 mm），检测通过热导率检测器进行，载气为高纯度氩气。

### 结果

#### 3.1 AdhE纯化和特异性活性测定

为了研究C. ljungdahlii中两种AdhE的功能差异，我们表达了全长AdhE1和AdhE2蛋白（96 kDa）（见图S2）。使用相同的酶浓度，通过检查NADH的生成和消耗速率来比较这些酶的催化特性。AdhE的酶活性通过以乙醇作为氧化反应底物或以乙酰辅酶A作为还原反应底物进行评估（见图3(a)和表S2）。我们对反应动力学和特异性活性的分析显示，虽然AdhE1和AdhE2具有相似的乙醇催化速率，但AdhE1将乙酰辅酶A转化为乙醇的速率高于AdhE2。随后，我们分别评估了两种酶的ADH域和ALDH域的活性（见图3(b, c)和表S2）。

#### 3.2 ALDH域的分子动力学模拟

通过监测与初始结构相比的骨架原子的RMSD值来评估NAD+-结合的AdhE的稳定性（见图4）。对于NAD+-结合的AdhE1，骨架原子的RMSD在模拟10 ns后稳定，波动在2-3 ?之间（见图4(a)）。相比之下，对于NAD+-结合的AdhE2，骨架原子的RMSD在模拟20 ns后稳定，波动在3-4 ?之间，表明AdhE2需要更大的构象变化才能达到平衡。此外，在MD模拟中，NAD+-结合的AdhE在10 ns、30 ns和50 ns时的RMSD变化显示了NAD+从AdhE2结合口袋中逐渐脱离的过程，表明NAD+与AdhE2的结合不稳固（见图4）。

#### 3.3 使用果糖的野生型和突变菌株的发酵

C. ljungdahlii具有糖酵解途径，能够发酵果糖。在clostridia的厌氧发酵过程中，会生成多余的还原当量，以Fdred和NADH的形式存在。这些还原当量通过合成氢气和乙醇等醇类物质来维持细胞内的氧化还原平衡（见图1）。在C. ljungdahlii中，两种AdhE酶在乙醇合成中起重要作用。当adhE1基因被敲除时，产生的?adhE1突变体依赖于adhE2进行代谢。然而，由于AdhE2中的ALDH域失活，只有其醇脱氢酶活性保持功能（见图S1）。当两个adhE基因都被删除时，C. ljungdahlii的乙醇生产途径完全受阻。野生型和突变菌株在果糖上的发酵结果显示，在75 mM果糖发酵介质中，野生型和突变菌株主要合成乙酸和乙醇（见图5、图S4和表S3）。通过分析代谢途径，可以看出1 mol果糖代谢可以产生2 mol乙酸或2 mol乙醇（见图1）。

#### 3.4 野生型和突变菌株的果糖发酵

C. ljungdahlii野生型菌株和adhE基因缺失突变体在果糖上的发酵结果显示，在75 mM果糖发酵介质中，野生型和突变菌株主要合成乙酸和乙醇（见图5、图S4和表S3）。通过计算产物中的总碳原子与从果糖中消耗的碳原子之比来确定果糖发酵中的碳回收率。这一指标量化了固定到产物中的碳与作为CO?释放的碳的比例。理论上，乙酸和乙醇中的碳回收率约为67%，因为从丙酮酸合成乙酰辅酶A会释放CO?（见图1）。然而，我们的发酵结果显示，超过70%的消耗果糖碳被转化为乙酸和乙醇（见表S3）。这一高于理论值的产量表明存在额外的非糖酵解途径来合成这些产物。基于代谢途径，说明Wood-Ljungdahl途径利用了额外的代谢能量来固定CO?并产生乙醇和乙酸。为了进一步探究这一点，我们将果糖发酵规模扩大到8 L体积，并收集发酵过程中产生的气体进行分析（见图6）。结果显示，除了CO?外，野生型和突变菌株中还检测到了H?和H?S，表明在果糖发酵过程中存在多余的还原当量。计算出的CO?产量分别为野生型2.2 mM，?adhE1突变体4.7 mM，?adhE1+2突变体1.2 mM。果糖消耗和CO合成数据的分析和比较（见图5、图S4和表S3）表明，大多数来自果糖糖酵解的CO?被重新利用。野生型菌株的生长、果糖消耗和乙醇产量低于?adhE1突变体，但高于?adhE1+2突变体（见图5和表S3）。发酵分析显示，?adhE1突变体中ALDH的失活增强了C. ljungdahlii在果糖发酵过程中的生长速率和乙醇产量，而同时缺乏AdhE1和AdhE2的?adhE1+2突变体的代谢受到显著影响。根据已建立的代谢途径，我们构建了一个可能的代谢平衡图（见图S5）。关键的代谢差异在于乙醇的合成。在?adhE1突变体中，乙醇仅通过AOR途径产生。然而，在野生型菌株中，功能性的AdhE和AOR酶共存，形成了两条理论上的平行乙醇合成途径。我们提出，在野生型菌株中同时维持NADH和还原型ferredoxin（Fdred）的氧化还原平衡较为困难，这可能激活了替代的代谢途径。实验观察证实，AdhE1和AdhE2的催化活性严格依赖于NAD+/NADH作为辅因子。此外，AdhE1在乙醇合成途径的所有步骤中都表现出酶活性，包括逆反应，并且显示出比AdhE2更高的催化能力（见表S2）。这些模拟结果为实验发现提供了分子层面的解释。

#### 3.5 野生型和突变菌株的果糖发酵

C. ljungdahlii具有糖酵解途径，能够发酵果糖。在clostridia的厌氧发酵过程中，会生成多余的还原当量，如Fdred和NADH。这些还原当量通过合成氢气和乙醇等醇类物质来维持细胞内的氧化还原平衡（见图1）。在C. ljungdahlii中，两种AdhE酶在乙醇合成中起重要作用。当adhE1基因被敲除时，产生的?adhE1突变体依赖于adhE2进行代谢。然而，由于AdhE2中的ALDH域失活，只有其醇脱氢酶活性保持功能（见图S1）。当两个adhE基因都被删除时，C. ljungdahlii的乙醇生产途径完全受阻。野生型和突变菌株在果糖上的发酵结果显示，在75 mM果糖发酵介质中，两者主要合成乙酸和乙醇（见图5、图S4和表S3）。通过分析代谢途径，可以看出1 mol果糖代谢可以产生2 mol乙酸或2 mol乙醇（见图1）。

#### 3.6 代谢途径的比较

野生型和突变菌株的果糖发酵结果表明，除了CO?外，还检测到了H?和H?S，表明在果糖发酵过程中存在多余的还原当量。这些结果表明，Wood-Ljungdahl途径利用了额外的代谢能量来固定CO?并产生乙醇和乙酸。基于已建立的代谢途径，我们构建了一个可能的代谢平衡图（见图S5）。野生型和突变菌株之间的关键代谢差异在于乙醇的合成。在?adhE1突变体中，乙醇仅通过AOR途径产生。然而，在野生型菌株中，功能性的AdhE和AOR酶共存，形成了两条理论上平行的乙醇合成途径。我们认为，在野生型菌株中难以同时维持NADH和还原型ferredoxin（Fdred）的氧化还原平衡，这可能激活了替代的代谢途径。这一观点得到了乳酸和2,3-丁二醇检测结果的支持（见图S4），这两种物质在两种突变体中均未产生。然而，这种策略的效率低于乙醇合成途径。细胞内NADH水平的分析显示，?adhE1突变体含有更多的NADH，但总NADH/NAD?比率低于野生型菌株（见图S5和表S4）。因此，突变体的NAD?/NADH+比率较低。这些结果表明，野生型菌株在有效消耗NADH以维持代谢氧化还原平衡方面存在困难，导致相对于突变体，果糖的利用和乙醇产量较低。?adhE1+2突变体基因组中编码两种主要AdhE酶的基因缺失，使其在果糖发酵过程中的生长速率和乙醇产量显著降低。其主要产物是40 ± 4 mM的乙酸，整个发酵过程中仅消耗了16 ± 4 mM的果糖（见图4和表S3）。为了进一步研究果糖发酵过程中能量代谢与产物合成之间的调控关系，对C. ljungdahlii的野生型及其ΔadhE1突变株进行了比较转录组分析。结果表明，在野生型菌株中，adhE1基因的转录水平（RPKM值，389）显著高于adhE2基因（RPKM值，2）（表S5）。在ΔadhE1突变株中，adhE1基因被敲除后，adhE2基因的转录水平显著增加（RPKM值，1353），表明尽管C. ljungdahlii拥有两个adhE基因，但在adhE1存在的情况下，adhE2几乎不会被转录。产物分析显示，野生型菌株在糖代谢过程中对NADH和Fdred的利用效率较低。因此，与这两种还原剂相关的基因表达上调，尤其是与WLP相关的基因（表S5）。这是因为WLP在碳固定过程中需要大量的还原力，这体现在编码CO脱氢酶（CLJUc09090-c09110、CLJUc37550和CLJUc37670）和氢化酶（CLJUc23060-c23070、CLJU_c07030-c07080）的基因表达上。在C. ljungdahlii的野生型和ΔadhE1突变株的细胞提取物中测定了AdhE和AOR的酶活性（图S6）。在缺乏adhE1基因的ΔadhE1突变株中，AdhE2基因补偿了其功能，这通过细胞提取物中检测到AOR和ADH的活性而来，但没有检测到ALDH的活性，这与纯酶的表达和转录组结果一致。

通过转录组分析比较了C. ljungdahlii野生型和ΔadhE1+2突变株。结果表明，由于adhE酶基因完全被敲除，在ΔadhE1+2突变株中未检测到adhE1和adhE2的转录。此外，AOR的转录水平也显著低于野生型菌株（表S6）。ΔadhE1+2突变株中缺乏ALDH和AOR酶活性，这一发现与转录组分析结果一致（图S6）。在果糖发酵过程中，ΔadhE1+2突变株主要合成醋酸（图4和表S3）。在此过程中产生的NADH和Fdred无法通过乙醇合成途径被消耗，因此必须利用其他代谢途径来维持细胞内的氧化还原平衡。在ΔadhE1+2突变株中，WLP的作用变得更为显著，其转录水平高于野生型菌株，这包括编码CO脱氢酶（CLJUc09090-c09110、CLJUc37550和CLJU_c37670）的基因表达（表S6），表明该突变株在CO2还原过程中消耗了大量的还原力。

C. ljungdahlii野生型和突变株的发酵实验表明，配备了WLP的C. ljungdahlii可以利用合成气进行生长。在使用CO作为碳源和能源的发酵过程中（图7），野生型菌株和ΔadhE1突变株均表现出正常的生长和代谢。然而，缺乏醛醇脱氢酶的ΔadhE1+2突变株无法生长，这说明AdhE酶在CO发酵中的重要性。下载：下载高分辨率图片（420KB）；下载全尺寸图片。图7显示了在CO上生长的C. ljungdahlii野生型（WT）和ΔadhE1突变株的生长情况、CO消耗量及产物：A：生长曲线；B：废气中的CO体积比例；C：发酵过程中的乙醇产量；D：发酵过程中的醋酸产量；E：2,3-丁二醇（2,3 BD）和乳酸的产量；F：发酵过程中的细胞内NAD+/NADH产量。在CO发酵过程中，野生型菌株的生长优于ΔadhE1突变株（图7(a)）。在相同的废气流速下，分别在两个发酵时间点（对数生长阶段72小时和稳定生长阶段120小时）测量了废气中的CO和CO2比例。结果表明，与ΔadhE1突变株相比，野生型菌株在两个时间点的废气中CO含量更低。此外，对废气的分析未检测到H2和H2S，表明C. ljungdahlii在气体发酵过程中不依赖H2和H2S来维持细胞内氧化还原平衡，这突显了CO发酵和果糖发酵作为碳源和能源时的差异。

在CO发酵过程中，野生型菌株产生的醋酸量低于ΔadhE1突变株（图7(d)），但产生的乙醇、乳酸和2,3-丁二醇量更多，尤其是乙醇。野生型菌株可以产生599 ± 39 mM的乙醇，而ΔadhE1突变株只能产生107 ± 9 mM的乙醇（图7(c, e)）。这三种产物都以乙酰辅酶A为前体，需要还原力（Fdred、NADH或NADPH）进行合成（图1）。发酵结果显示，ALDH通过将乙醛转化为乙酰辅酶A来提供还原力。由于ΔadhE1突变株中的醛醇脱氢酶部分失活，还原力的供应减少，导致乙醇、乳酸和2,3-丁二醇的产量降低。这表明在CO发酵过程中，ALDH催化乙醛生成乙酰辅酶A，从而产生NADH。因此，乙醇的合成涉及醋酸向乙醛的转化，そして部分乙醛通过醇脱氢酶转化为乙醇。细胞内NADH的分析显示，野生型菌株的NADH含量高于突变株。结合生长和发酵结果，这些发现表明在CO发酵过程中，野生型菌株能够产生更多的NADH，有利于促进其生长和乙醇的产生（图7(f)和表S4）。

为了研究野生型菌株与ΔadhE1突变株在关键代谢途径中的转录变化，进行了比较转录组分析（表S7）。结果发现，在CO发酵过程中，adhE1基因表达时，adhE2基因的转录水平几乎可以忽略不计（RPKM值，3），而敲除adhE1基因后，adhE2基因的转录水平显著增加（RPKM值，665）。在CO和果糖发酵过程中观察到了类似的转录变化。此外，野生型菌株中主要的一氧化碳脱氢酶（CLJUc09090-c09110）的转录水平明显高于ΔadhE1突变株（表S7）。这种酶将CO氧化生成CO2，产生的Fdred作为CO发酵过程中的主要生物能量，有助于ATP、NADH和NADPH的生成。在ΔadhE1突变株中，由于醛醇脱氢酶的失活，该基因簇的转录水平显著升高。这种功能丧失导致代谢过程中缺失了一条NADH获取途径，诱导主要能量来源的转录增加，从而产生更多的Fdred作为CO发酵过程中的主要生物能量，有助于ATP、NADH和NADPH的合成，并相关基因（如aor基因（aor1/CLJUc20110和aor2/CLJUc20210）和氢化酶基因（CLJUc23060-c23090和CLJU_c37220）的转录水平也上升。有趣的是，参与微隔室合成的基因（CLJUc11830-11940）在ΔadhE1突变株中的转录水平显著提高，而这些基因在野生型菌株中几乎不表达。微隔室是细菌中具有特定功能的蛋白质结构。其在突变株中的表达增强可能与突变株中乙醛的积累有关。在C. ljungdahlii的微隔室组装基因簇中，包含编码醇脱氢酶（CLJU_c011880）和醛醇脱氢酶（CLJU_c11960）的基因，使得乙醛可以在微隔室内进行氧化和还原反应，从而促进乙醛的代谢并保护细胞免受毒性影响。

通过透射电子显微镜观察了C. ljungdahlii野生型和ΔadhE1突变株在CO发酵过程中微隔室的合成情况（图S7）。结果发现，野生型菌株中不存在微隔室结构相关的蛋白质聚集。然而，在相同的发酵条件下，突变株的横截面和纵向切片的电子显微照片显示白色蛋白质聚集（图S7(c, d)），表明与野生型菌株相比，突变株中微隔室相关基因的转录和蛋白质表达水平显著增加。在C. ljungdahlii中，编码细菌微隔室所有成分和特征酶的基因构成了一个大的基因簇（CLJU_c11830-11990）。如上所述，突变株中醛醇脱氢酶的失活导致乙醛积累。微隔室的合成可能有助于处理乙醛，减轻其积累引起的细胞毒性。

在使用CO2/H2作为碳源和能源的发酵过程中，研究了C. ljungdahlii野生型和ΔadhE1突变株。发酵结果显示，在这些条件下，野生型菌株的最大生长OD值仅为约1.6（图8）。与CO发酵相比，野生型菌株的生长速率显著下降，主要产物为醋酸，总浓度为564 ± 22 mM（图8）。ΔadhE1突变株在这些条件下无法生长，表明在pH 6.0、CO2/H2作为碳源和能源的条件下醛醇脱氢酶的失活对C. ljungdahlii是致命的。考虑到野生型菌株在这些条件下的主要产物是醋酸且其生长速率远低于CO条件，这表明在CO2/H2发酵过程中ATP的产生能力显著降低。结合在CO2/H2发酵过程中观察到的较高AOR酶活性，可以看出C. ljungdahlii通过将乙酰辅酶A合成乙醛，并在整个代谢过程中将乙醛转化为乙酸来维持细胞内氧化还原平衡，从而强调了醛醇脱氢酶在C. ljungdahlii的CO2/H2发酵中的不可或缺性。

C. ljungdahlii在不同碳源下的能量代谢和产物合成表现出不同的策略。在己糖（果糖）发酵过程中，糖酵解产生等摩尔的ATP和NADH[7]。[31],[32]。然而，由丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）产生的还原型铁氧还蛋白（Fdred）的处置是一个关键挑战。与某些厌氧菌不同，C. ljungdahlii缺乏有效的氢化酶通过产生H2来消除多余的Fdred[1],[5],[7],[22]，因此它主要利用醛醇脱氢酶（AOR）途径将Fdred氧化为乙醛。在这种情况下，通过ALDH的天然果糖代谢会在Fdred和NADH生成之间造成氧化还原失衡，迫使野生型菌株激活多种辅助途径。这导致生长缓慢、底物利用率低和产物多样性差（醋酸、乙醇、2,3-丁二醇等）（图4、图5和S4）。相比之下，ΔadhE1突变株（ALDH失活）纠正了这种失衡，使果糖消耗量翻倍，生物量增加，乙醇成为主要产物（94 ± 2 mM）（图4），突显了ALDH在氧化还原管理中的关键作用。

在合成气发酵过程中，能量来源于CO氧化产生的Fdred或通过H2氧化产生的Fdred/NAD(P)H[4],[15],[22]。ATP主要通过Rnf-ATP酶复合体和醋酸合成产生[19],[33]。与糖酵解不同，这些合成气途径分离了ATP和NADH的产生。在CO发酵过程中，乙醇是主要产物[21]。ΔadhE1突变株的乙醇产量减少，表明ALDH提供的NADH对乙醇合成至关重要。此外，ALDH还能防止有毒的乙醛积累，促进生长和产物形成（图6、图7）。相反，在CO2/H2发酵过程中，醋酸是主要产物，乙醇产量较少，NAD(P)H过量而Fdred不足。根据高AOR和AdhE活性[21]以及突变体研究，我们提出了一种途径：乙酰辅酶A衍生的乙醛转化为醋酸的过程中消耗了NADH并产生了Fdred，从而发挥了关键的氧化还原平衡作用。这一途径的受阻会损害生长，这表明气体发酵在热力学极限下进行，任何微小的干扰都会显著影响代谢结果[34]。4.2. 代谢多样性和氧化还原平衡机制 C. ljungdahlii采用多种系统进行能量转换和氧化还原稳态调节。这些系统包括：(1) 电子分叉复合物（例如HytA-E氢化酶、NfnAB转氢酶），用于能量载体的可逆互转化[22]、[35]、[36]、[37]；(2) 跨膜Rnf-ATP酶系统，该系统将Fdred不可逆地转化为NADH，并同时建立质子梯度以合成ATP[5]；(3) 通过中间代谢物互转化能量形式的代谢循环。例如，在CO发酵过程中，醋酸-乙醛-乙酰辅酶A循环消耗Fdred来产生NADH和ATP（图9(a)）。相反，在CO2/H2发酵过程中，乙酰辅酶A通过乙醛转化为醋酸的过程消耗NADH来产生Fdred（图9(b)）。此外，其他氧化还原步骤，如与Fdred氧化耦合的亚甲基四氢叶酸还原酶反应，也可能有助于能量保存[5]、[15]、[38]。下载：下载高分辨率图像（735KB）下载：下载完整尺寸图像图9. 在CO（A）和CO2/H2（B）培养条件下生长的C. ljungdahlii的乙醇和醋酸生物合成途径及氧化还原平衡。使用的缩写：THF，四氢叶酸；HCO-THF，甲酰-THF；CH-THF，亚甲基-THF；CH2-THF，甲基-THF；CH3-THF，甲基-THF。对这些途径的分析解释了关键的生理现象。果糖发酵效率低下是由于无法通过H2释放重新氧化Fdred，导致氧化还原 Stress和代谢途径发生偏移[7]、[39]、[40]。在类似条件下，CO发酵产生的生物量高于CO2/H2发酵（图7(a)和图8）[15]、[21]、[22]，这归因于每摩尔底物产生的ATP更多[图9A]。尽管在CO和CO2/H2发酵过程中关键酶复合物（Hyt/Fdh、Nfn、AOR）的转录和蛋白质组变化很小[21]、[41]，但它们的代谢流方向发生了逆转（图9），显示了C. ljungdahlii维持氧化还原和能量平衡的代谢灵活性。4.3. 醋酸和乙醇合成的整合途径 在C. ljungdahlii中，醋酸和乙醇的代谢途径通过AOR独特地相互连接[42]、[43]。在ΔadhE1突变体中进行果糖发酵时，出现了一种新的高效乙醇合成途径：醋酸（提供ATP）通过AOR转化为乙醛（消耗Fdred），然后再被还原为乙醇（消耗糖酵解产生的NADH）（图S5）。这一过程与Wood-Ljungdahl（WL）途径结合使用CO2固定，碳回收率超过67%（表S3），超过了典型酵母发酵的碳效率，并展示了该菌株改进的潜力。在合成气发酵中，乙醇主要通过AOR途径合成，ALDH发挥着双重作用：它为乙醇形成提供NADH并防止有毒乙醛积累[15]、[16]、[21]。在CO发酵过程中，AOR和AdhE途径都处于活跃状态；抑制ALDH会降低乙醇产量并增加醋酸的产生（图7(c, d)）。在CO2/H2发酵过程中，醋酸合成的主要目的是生成ATP。独特的乙醛-醋酸转化途径每摩尔醋酸产生的ATP较少，但这一缺点被高合成速率所弥补，使得醋酸浓度可以达到较高水平（约580 mM），突显了C. ljungdahlii作为醋酸生产平台的潜力（图9）[21]、[44]。5. 结论 C. ljungdahlii表现出三种代谢模式——果糖发酵、CO发酵和CO?/H?发酵——每种模式都具有不同的生物能量特性和调节特征。我们的分析表明，在工程菌株（?adhE1）中，果糖发酵优先产生乙醇，其中ATP驱动的生长结合了过剩的Fdred和NADH，使得碳流从醋酸重新导向乙醇，而剩余的Fdred通过WL途径还原CO?。CO发酵依赖于ALDH介导的乙醛氧化生成NADH以合成乙醇。CO?/H?发酵仅通过两条独立途径产生醋酸，在低细胞密度下也能达到高浓度。这些结果展示了C. ljungdahlii的代谢多样性，并为碳负生物制造业的工业菌株工程提供了指导。CRediT作者贡献声明：Xiao-Sheng Zha：研究；Lan-Peng Li：指导、资金获取；Quan Zhang：资金获取、概念构思；Ji-Hong Yi：方法学；Shu-Ning Wang：方法学；De-Chen Jia：方法学；Yang Gu：方法学；Frank Bengelsdorf：写作-审阅与编辑、指导、概念构思；Liu Ziyong：写作-初稿、可视化、概念构思；Fu-Li Li：写作-审阅与编辑、指导；Kun-Di Zhang：写作-初稿、研究、概念构思；Peng-Hui Shi：研究；Yi-Xuan Fan：写作-初稿、可视化、研究。