利用完整的缺乏糖蛋白的巨核细胞，区分免疫性血小板减少症中的致病性自身抗体与非致病性自身抗体

《Haematologica》：Differentiating pathogenic from bystander autoantibodies in immune thrombocytopenia using intact glycoprotein-deficient megakaryocytes

　　南燕张|Günalp Uzun|Tamam Bakchoul|Brian R. Curtis|Peter J. Newman
美国威斯康星州密尔沃基市Versiti血液研究所

针对血小板表面糖蛋白（GP）的自身抗体是免疫性血小板减少症（ITP）的主要原因，然而由于现有诊断测试的灵敏度不足，这些自身抗体的检测并未得到常规应用。为了克服这一问题以及其他诊断限制，我们生成了HLA class I阴性、血型为O的诱导多能干细胞系，并通过基因编辑使其产生一种新型的缺乏GP的体外衍生巨核细胞（MK）。利用缺乏GPIIb、GPIbα和GPIX的MK，我们可以敏感且特异性地识别和表征GPIIb-IIIa和GPIb/IX特异性的血浆自身抗体，以及之前未被描述的、针对GPIX的罕见患者自身抗体。这些表面表达特定血小板GP抗原的冷冻生物工程MK的可用性简化了与疾病进展相关的抗血小板自身抗体的检测过程，同时避免了那些由于次级接触“隐性表位”而产生的非致病性“旁观者自身抗体的干扰，这些抗体否则可能会混淆诊断和治疗。使用选择性缺乏血小板自身抗体主要靶标的完整MK有望显著改善ITP的临床诊断和治疗。

**引言**
免疫性血小板减少症（ITP）是一种自身免疫性疾病，其主要特征是血小板计数降低。许多患者只有轻微或没有出血症状，但有时也可能发生严重甚至危及生命的出血，这可能需要长期治疗，从而影响患者的生活质量。即使在今天，由于缺乏可靠的标准化测试或生物标志物来确诊ITP，该病仍然主要通过排除法进行诊断。大约七分之一的原发性ITP患者被误诊，这对ITP的管理有重大影响，并可能导致患者接受不必要的治疗。血小板自身抗体是ITP的主要驱动因素，尽管细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞等其他机制也可能参与ITP的发病机制。尽管如此，由于现有方法的灵敏度较低，血小板自身抗体检测并未被常规用于ITP的诊断。因此，虽然阳性的自身抗体检测有助于确认ITP，但阴性的结果并不能排除该病。因此，迫切需要开发出能够以高特异性和灵敏度检测抗血小板自身抗体的替代方法，以提供明确的实验室确诊依据。

血小板表面糖蛋白（GP），主要是GPIIb-IIIa和GPIb/IX，是导致ITP的抗血小板自身抗体的主要靶标。被调理的血小板的清除主要通过Fcγ受体依赖的吞噬作用或血小板去唾液酸化机制实现。然而，关于自身抗体特异性、血小板破坏机制以及对某些治疗的反应之间的不确定性限制了ITP诊断测试的实用性，因此这些测试常常不被推荐使用。目前，临床诊断实验室更倾向于使用抗原捕获测定（如酶联免疫吸附测定ELISA）、单克隆抗体特异性血小板抗原固定（MAIPA）和血小板抗体珠阵列，因为它们对GP具有高特异性。然而，这些方法耗时且需要使用去污剂来溶解血小板GP，这可能会破坏不稳定的表位。这些测定中使用单克隆抗体可能会与抗血小板自身抗体的结合竞争，从而导致假阴性结果。此外，这些测试通常仅在专业实验室中进行，每个实验室都有自己的阳性判定阈值。即使这些阈值存在微小差异，也可能影响低亲和力或弱自身抗体的检测，从而导致假阴性或假阳性结果。无论使用何种测定方法，血小板自身抗体都可以来自两个来源：结合在患者血小板上的抗体以及患者血浆中自由循环的抗体。诊断实验室通常优先通过从患者血小板中分离出这些抗体，因为这种方法由于富集了细胞表面的自身抗体而更具敏感性。然而，这种方法需要大量的血液和足够高的血小板计数，对于严重血小板减少的患者来说可能不可行。在这种情况下，检测血浆中的自身抗体虽然是次优选择，但往往是唯一可行的方法。分析血浆中的自身抗体在研究中也具有重要价值，因为ITP患者的血浆样本是研究疾病发病机制、预后和治疗反应的重要资源。与仅针对血小板GP胞外结构的血小板相关抗体不同，血浆中可能含有针对胞内表位的抗体。虽然这些针对胞内表位的抗体不被认为是致病的，但它们可能是在血小板破坏过程中产生的 secondary 免疫反应的结果，可能会干扰诊断和治疗。

基于使用完整血小板的测定方法很早就被开发出来用于检测血小板特异性抗体。由于这些方法保留了完整的天然表面抗原，因此具有高灵敏度。但由于血小板表面表达的抗原种类复杂，这些方法最终因特异性较差而被放弃用于ITP自身抗体的检测。只有在使用来自Glanzmann血小板无力症或Bernard-Soulier综合征（BSS）患者的缺乏GP的供体血小板作为阴性对照的情况下，才实现了对ITP自身抗体的可靠检测。除了血小板特异性抗原外，血小板还表达ABO血型抗原和HLA class I分子，这进一步增加了抗体特异性的解读复杂性。在本研究中，我们通过用生物工程巨核细胞（MK）替代供体来源的血小板，重新启用了全细胞测定方法来检测患者血浆中的ITP自身抗体，实现了高灵敏度和出色的特异性。通过创建缺乏GP的诱导多能干细胞（iPSC）衍生的MK，我们能够敏感地检测并准确表征针对主要血小板表面GP复合物（即GPIIb-IIIa和GPIb/IX）的自身抗体，包括那些标准ACA无法检测到的抗体。此外，使用缺乏GPIbα和GPIX的MK还能够检测到之前未描述的抗GPIX自身抗体，从而提高了自身抗体的表征能力。重要的是，使用完整MK可以避免检测到标准ACA能检测到的非致病性“无辜旁观者”自身抗体。冷冻生物工程MK的易获得性应能简化抗血小板自身抗体的检测过程，从而显著提升ITP的研究及临床诊断和治疗水平。

**方法**
**研究设计**
使用去标识的ITP患者血浆样本获得了威斯康星医学院/Froedtert医院机构审查委员会（IRB）的批准（PRO00036374）。根据批准的IRB协议，患者同意书被免除。血浆样本来自两个临床诊断实验室：美国的Versiti血小板和中性粒细胞免疫学实验室（地点1），以及德国图宾根大学医院的临床免疫学和输血医学研究所（地点2）。为了确保纳入真正的ITP病例，诊断实验室仅选择了先前被确认具有血小板相关或循环抗体的患者样本。地点1的28个ITP血浆样本已经使用PABA20或ELISA进行了检测，而地点2的20个样本使用了MAIPA进行了检测。所有ITP患者样本在转移到研究实验室进行完整MK检测之前都经过了匿名化和编码。作为阴性质量控制，每个测试中都包含了一个来自Versiti的去标识正常人类血浆样本池。此外，地点1还提供了三个编码正常的血浆样本，随机分配到ITP样本中以确保检测准确性。诊断测试结果随后由实验室发布，用于比较分析，并汇总在在线补充表S1中。

**流式细胞术分析**
为了分析MK表面糖蛋白的表达，将2×10^5个细胞与以下荧光偶联抗体在室温下孵育20分钟：藻红蛋白（PE）/Cyanein7偶联的抗GPIIb、FITC偶联的抗GPIIIa、APC偶联的抗GPIbα（BioLegend）、PE偶联的抗αVβ3（克隆LM609，Sigma）、AF647偶联的抗GPVI（11A12）、FITC偶联的抗GPIX（BD Biosciences）、Alexa Fluor 488偶联的抗IL-4Rα（R&D systems）。每种单克隆抗体对应的荧光标记同型对照用于背景染色。通过将MK与羊抗GPV一抗（R&D systems）孵育后，再与Alexa Fluor 488偶联的驴抗羊免疫球蛋白（IgG）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）孵育来监测GPV表面表达。对于自身抗体的检测（在线补充图S1），将5×10^5个iPSC衍生的MK与10-25 μL的人血浆在室温下孵育30分钟。洗涤后，将细胞与PE偶联的驴抗人IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）、PE/Cyanein7偶联的抗GPIIb或APC偶联的抗GPIba或AF647偶联的抗GPVI在室温下孵育20分钟。未暴露于人血浆但用二级和门控抗体染色的细胞作为阴性对照。抗HPA-1a（26.4）同种抗体（由挪威北部大学的Maria Therese Ahlen博士提供）用作阳性对照。流式细胞术使用BD FACSCelesta或FACSymphony A5 SE细胞分析仪进行。数据使用FlowJo软件（Tree Star Inc.）进行分析。流式细胞术数据以双指数尺度显示。由于数字背景减法，一些未染色群体的荧光强度值为负值；这些值被视为背景噪声。

**统计分析**
使用GraphPad Prism 9（GraphPad Software）进行了统计分析。多个组之间的比较使用单因素ANOVA和Dunnett检验进行。P<0.05被认为具有统计学意义。

**GPIIb-IIIa和GPIb/IX缺乏的诱导多能干细胞系的生成和表征**
使用血型为O、HLA class I阴性的iPSC系作为所有基因编辑程序的起始系，因为其分化的MK显示出对21名随机选取的健康供体的血浆具有较低的背景结合活性（在线补充图S2）。然后使用CRISPR/Cas9技术生成了编码血小板膜GPIIb的基因被删除的iPSC克隆（在线补充图S3A）。ITGA2B基因的破坏并未影响iPSC向MK的分化，GPIIb KO MK的大小与WT MK相当（在线补充图S4）。流式细胞术分析确认了GPIIb表面表达的完全丢失（图1A）。正如预期的那样，GPIIb缺乏还导致MK表面GPIIIa的表达显著减少；剩余的少量GPIIIa表达是由内源性的integrin αV亚单位恢复及其形成的αVβ3所引起的（图1A）。GPIIb的破坏并未影响MK表面其他主要GP（如GPIbα和GPVI）的表达（图1A）。GPIb/IX/V复合物由一个大的GPIba亚单位通过二硫键与GPIbβ连接，并与非共价地与GPIX和GPV结合。我们生成了缺乏GPIbα、GPIX和GPV的单基因敲除（KO）iPSC克隆（在线补充图S3B-D），并在GPIbα KO iPSC克隆的AAVS1位点引入了一个编码chimeric IL4Rα-GPIbα26蛋白的转基因（在线补充图S5）。这种融合蛋白（图1B左侧所示）几乎完全替换了人类GPIbα的整个胞外结构，使其与人类白细胞介素-4受体α（IL4Rα）的胞外结构结合。先前研究表明，IL4Rα-GPIbα可以像完整的GPIbα亚单位一样与GPIbβ结合，并完全支持GPIb/IX复合物的组装。WT iPSC克隆随后分化为MK，显示出细胞表面高水平的GPIbα、GPIX和GPV表达（图1B）。相比之下，缺乏GPIbα的MK完全失去了GPIbα的表达，并且表面GPIX和GPV的表达也显著降低（图1B）。同样，缺乏GPIX的MK也显示出GPIbα和GPV的表达显著降低（图1B）。而缺乏GPV的MK则表现出正常的GPIbα和GPIX表达（图1B），这与先前的研究结果一致，即GPV的生物合成和表面表达依赖于GPIb/IX复合物的存在，但GPIb/IX的表面表达不需要GPV。IL4Rα-GPIbα的表达如预期地恢复了缺乏GPIbα的MK中的GPIX表面表达，但仅部分恢复了GPV的表达（图1B），这表明与GPIbα的胞外结构的相互作用可能在GPV向细胞表面的运输中起重要作用。最后，针对GPIb/IX/V的靶向破坏并未显著影响其他主要GP（如GPIIb和GPVI）的表达（图1B）。

**使用生物工程巨核细胞从免疫性血小板减少症血浆中鉴定糖蛋白特异性自身抗体**
如图2A所示，之前使用诊断ACA分型的ITP患者血浆1-4对WT MK和缺乏GPIbα的MK均表现出强烈的结合（在线补充表S1）。患者1和2完全失去了与GPIIb KO巨核细胞的结合能力，这表明这些自身抗体可能针对GPIIb本身或GPIIb-IIIa复合物上的其他部位；而患者3和4的血浆显示出与GPIIb KO巨核细胞的结合能力显著降低，但尚未降至零，这表明自身抗体很可能针对GPIIIa（β3）亚单位，该亚单位在GPIIb KO巨核细胞的αVβ3复合物中仍然存在。支持这一观点的是，一种针对GPIIIa的特异性同种抗体（anti-HPA-1a）29也与GPIIb KO巨核细胞的结合能力较低。值得注意的是，使用完整的巨核细胞技术还能够在标准诊断方法无法检测到的ITP患者血浆中识别出自身抗体。例如，ITP患者5-8的血浆样本在ACA检测中呈阴性（见在线补充表S1），但与WT和GPIbα KO巨核细胞均有一定的结合能力（见图2B），这与这些患者自身的抗体针对在常规去污溶解过程中会被破坏的“不稳定表位”相一致。此外，使用抗FcγRIIa抗体IV.3阻断FcγRIIa受体并未影响ITP自身抗体与巨核细胞的结合，说明通过FcγRIIa受体发生的非特异性抗体结合在本检测系统中并不重要（见在线补充图S6）。

患者1和2的自身抗体完全失去了与GPIIb KO巨核细胞的结合能力，这表明这些自身抗体可能针对GPIIb本身或GPIIb-IIIa复合物上的其他部位；而患者3和4的血浆显示出与GPIIb KO巨核细胞的结合能力显著降低，但尚未降至零，这表明这些自身抗体很可能针对GPIIIa（β3）亚单位，该亚单位在GPIIb KO巨核细胞的αVβ3复合物中仍然存在。支持这一观点的是，一种针对GPIIIa的特异性同种抗体（anti-HPA-1a）29也与GPIIb KO巨核细胞的结合能力较低。值得注意的是，使用完整的巨核细胞技术还能够在标准诊断方法无法检测到的ITP患者血浆中识别出自身抗体。例如，ITP患者5-8的血浆样本在ACA检测中呈阴性（见在线补充表S1），但与WT和GPIbα KO巨核细胞均有一定的结合能力（见图2B），这与这些患者自身的抗体针对在常规去污溶解过程中会被破坏的“不稳定表位”相一致。此外，使用抗FcγRIIa抗体IV.3阻断FcγRIIa受体并未影响ITP自身抗体与巨核细胞的结合，说明通过FcγRIIa受体发生的非特异性抗体结合在本检测系统中并不重要。

含有确认的anti-GPIb/IX自身抗体的ITP患者血浆也被用于检测其是否与iPSC衍生的巨核细胞发生反应。如图3A所示，患者9、11和12的血浆与WT和GPIIb KO巨核细胞均有一定的结合能力，但与GPIbα KO和GPIX KO巨核细胞的反应性丧失，这表明存在针对GPIb/IX复合物的自身抗体。患者10的血浆与WT、GPIbα KO和GPV KO巨核细胞有强结合能力，但与GPIIb KO和GPIX KO巨核细胞的结合能力显著降低，这表明同时存在anti-GPIIb-IIIa和anti-GPIX自身抗体（见图3A）。值得注意的是，这一案例突显了巨核细胞检测技术带来的更高分辨率，使得能够识别出患者10体内先前未被发现的anti-GPIX自身抗体。尽管通过ACA在患者11和12中检测到了anti-GPIIb-IIIa自身抗体，但使用完整的巨核细胞技术无法确认其存在。

与针对GPIIb-IIIa的特异性自身抗体的发现类似，巨核细胞检测技术还发现了ACA无法识别的针对GPIb/IX复合物的自身抗体。患者13至15的血浆与WT巨核细胞有强结合能力，但与GPIIb KO巨核细胞的结合能力显著降低，与GPIbα KO和GPIX KO巨核细胞的结合能力也有所降低（见图3B），这表明这些样本中同时存在强效的anti-GPIIb-IIIa自身抗体和较弱的anti-GPIb/IX自身抗体。患者16的血浆与WT巨核细胞有强结合能力，但与GPIIb KO、GPIbα KO和GPIX KO巨核细胞的结合能力显著降低，这表明同时存在强效的anti-GPIIb-IIIa和anti-GPIb/IX自身抗体（见图3B）。总体而言，这些结果有力证明了iPSC衍生的、缺乏GP的巨核细胞在检测和表征ITP自身抗体方面具有更高的敏感性和分辨率——这些特性未来可能对指导治疗具有重要意义（详见下文讨论）。正如预期的那样，这种全细胞检测方法也可用于检测抗血小板自身抗体，例如在一名接受输血后疑似有抗血小板抗体的BSS患者中成功识别出了之前未被发现的anti-GPIb/IX自身抗体（见在线补充图S7）。

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**图1. 表面抗原水平的表征**
（A）流式细胞术分析显示，在GPIIb敲除（KO）巨核细胞中，GPIIb-IIIa的表面表达丧失，而αVβ3和其他主要血小板表面糖蛋白（GP）的表达正常。左侧示意图显示整合素β3（GPIIIa）与αIIb（GPIIb）或αV结合形成复合物在巨核细胞表面。αVβ3的表达通过特异性单克隆抗体LM609进行检测。
（B）流式细胞术分析每个GP KO巨核细胞中GPIb/IX/V复合物各组分的表面表达。左侧示意图显示，嵌合蛋白IL4Rα-GPIbα用白细胞介素-4受体α链（IL4Rα）的胞外域（残基1-198）替换了大部分GPIbα的胞外域（残基1-472）。红线代表GPIbα和GPIbβ之间的二硫键。颜色编码数字表示相应峰的中位荧光强度。ISO：染色抗体的同型对照；WT：野生型。

**区分非膜反应性自身抗体和导致血小板破坏的病原性自身抗体**
如在线补充表S1所示，本研究共检测了48份ITP患者血浆样本，其中28份来自站点1，20份来自站点2。尽管两个诊断实验室使用了不同的ACA方法，但结果可以分为三组，如图4A所示。WMK在站点1的46.4%和站点2的44.4%的样本中确认了ACA的诊断结果。值得注意的是，WMK在站点1的21.4%的样本和站点2的22.2%的样本中检测到了此前无法检测到的自身抗体，这突显了保存易变天然抗原的优势。重要的是，在32.1%（站点1）和33.3%（站点2）的样本中，WMK未能检测到自身抗体，这引发了对于某些实验室ACA结果可能具有误导性的担忧，并强调了进一步评估和谨慎临床解释的必要性。

先前的研究表明，ITP患者的血浆中存在能结合血小板膜GP胞质区的自身抗体，21,22但这些抗体与ITP的病理机制关系不大，因为它们不会结合或清除完整的血小板。在这方面，使用生物工程巨核细胞的优势在于只报告那些能够实际结合并从循环中清除血小板的自身抗体的存在。例如，图4中的一个案例显示，患者17的ITP血浆在ACA检测中与GPIb/IX有强反应（见图4B），但在完整的iPSC衍生的巨核细胞和完整的人类血小板中几乎没有反应（见在线补充图S8），这表明检测到的抗体是非病原性的，可能是患者血浆中的无关物质。当由于严重血小板减少症而无法进行血小板相关抗体检测时，这样的ACA结果可能会产生误导（见在线补充表S1）。为了进一步研究这种抗体的性质和定位其表位，我们使用WT巨核细胞或表达缺乏GPIbα胞外域的嵌合蛋白的IL4Rα-GPIbα巨核细胞进行了改进的ACA检测（见图4D）。该抗体能与WT的GPIb/IX复合物结合，但不能与嵌合蛋白复合物结合，表明其表位位于GPIbα胞外域的隐蔽区域。虽然这些隐蔽表位在ACA检测中暴露的机制尚不清楚，但这些发现强调了使用完整的、缺乏GP的iPSC衍生的巨核细胞作为识别ITP中病原性自身抗体的可靠工具的价值。

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**图2. 使用完整巨核细胞检测和表征免疫性血小板减少症患者血浆中的anti-GPIIb-IIIa自身抗体**
野生型（WT）和缺乏糖蛋白（GP）的巨核细胞（MK）与正常健康对照者或免疫性血小板减少症（ITP）患者的血浆孵育。结合在巨核细胞上的抗体通过FITC标记的驴源抗人免疫球蛋白（Ig）G进行流式细胞术检测。颜色编码数字表示相应峰的中位荧光强度。上方显示了通过诊断抗原捕获检测（ACA）和完整巨核细胞（WMK）在每位患者血浆中检测到的自身抗体，以供对比（见图）。
（A）WMK在临床诊断实验室中通过ACA确认的ITP患者血浆中检测到了anti-GPIIb-IIIa自身抗体。正常血浆作为阴性对照。Anti-HPA-1a（26.4）抗体是一种针对GPIIIa的特异性人类同种抗体。
（B）WMK在先前ACA检测中未能检测到的ITP患者血浆中检测到了anti-GPIIb-IIIa自身抗体。

ITP是一种异质性疾病。虽然ACA检测到的无关自身抗体可以解释一些在WMK检测中呈阴性但在ACA中呈阳性的病例（见图4A），但这并不能解释所有情况，还有其他可能的解释。首先，ACA在某些情况下可能比基于流式细胞术的全细胞检测更敏感，因为它们在珠子或微孔板表面上提供了更高的目标抗原密度。这对于识别在血小板溶解过程中保持稳定的线性肽表位或构象表位的自身抗体尤为重要。其次，我们不能完全排除某些疾病相关表位在iPSC衍生的巨核细胞中缺失或表达不足的可能性，尽管这些细胞对多种针对GPIIb-IIIa和GPIbα的单克隆抗体表现出强烈的结合能力。

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**图3. 使用完整巨核细胞检测和表征免疫性血小板减少症患者血浆中的anti-GPIb/IX自身抗体**
野生型（WT）和缺乏糖蛋白（GP）的巨核细胞（MK）与免疫性血小板减少症（ITP）患者血浆或20名健康捐赠者的正常人血浆混合孵育。结合在巨核细胞上的抗体通过FITC标记的驴源抗人免疫球蛋白（Ig）G进行流式细胞术检测。颜色编码数字表示相应峰的中位荧光强度。上方显示了通过抗原捕获检测（ACA）和完整巨核细胞（WMK）在每位患者血浆中检测到的自身抗体，以供对比（见图）。
（A）WMK在临床诊断实验室中通过ACA确认的ITP患者血浆中检测到了anti-GPIb/IX自身抗体。WMK在患者9中检测到了强效的anti-GPIb/IX抗体，在患者11和12中检测到了弱的anti-GPIb/IX抗体，在患者10中检测到了同时存在的强抗GPIIb-IIIa抗体和强anti-GPIb/IX抗体。
（B）WMK在之前ACA检测中未能检测到的ITP患者血浆中检测到了anti-GPIb/IX自身抗体。WMK在患者13至15中检测到了同时存在的弱anti-GPIb/IX抗体和强anti-GPIIb-IIIa抗体，在患者16中检测到了同时存在的强anti-GPIb/IX抗体和强anti-GPIIb-IIIa抗体。

**讨论**
历史上，由于常用的诊断测试灵敏度和特异性较低，识别对ITP病理具有临床意义的抗血小板自身抗体的能力受到了限制。本研究的主要贡献是开发并使用了缺乏选定血小板膜GP自身抗体靶点的完整iPSC衍生的巨核细胞系（见在线补充图S1）。结合流式细胞术检测，这些方法相比现有的ELISA方法具有许多独特优势。首先，使用表达天然形式抗原的完整细胞可以提高对在血小板溶解过程中被破坏的不稳定抗原的自身抗体的检测能力。据报道，一些难以检测的抗血小板同种抗体（包括针对人类血小板同种抗原HPA-3a、3b和9b的抗体）存在不稳定抗原（24, 30, 31, 32, 33）。由于ITP患者血浆中自身抗体的丰度和亲和力通常较低，因此检测自身抗体更具挑战性。令人惊讶的是，我们发现许多在标准ELISA检测中无法检测到的自身抗体在完整的巨核细胞中表现出强结合能力（见图2B和3B），这为针对在去污溶解过程中被破坏的不稳定构象抗原的ITP自身抗体提供了额外证据。

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**图4. 使用完整巨核细胞区分非膜反应性自身抗体**
（A）比较完整巨核细胞（WMK）和临床抗原捕获检测（ACA）在检测免疫性血小板减少症（ITP）血浆中的抗血小板自身抗体方面的能力。如在线补充表S1所示，蓝色表示WMK结果与患者的实验室ACA结果一致的情况。橙色表示患者的血浆自身抗体仅能通过WMK检测到，而不能通过ACA检测到的情况。粉色表示患者通过ACA检测到的至少一种自身抗体无法通过WMK检测到的情况。
（B）临床血小板抗体珠阵列（PABA）检测显示患者17的血浆对GPIb/IX复合物有强反应。测试面板使用了6名捐赠者的血小板。数据显示了结合MBC143.1（抗HLA I类）、AP2（抗GPIIb/IIIa）和MBC142.17（抗GPIb/IX）抗体的珠子所检测到的抗人免疫球蛋白（Ig）G的中位荧光强度（MFI）。
（C）WMK未在患者17的血浆中检测到与血小板反应的自身抗体。
（D）使用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的巨核细胞进行的ACA表明，患者17抗体识别的表位位于GPIbα的胞外域或其相关区域。GPIb/IX复合物通过抗GPIbα单克隆抗体MBC142.17从野生型（WT）巨核细胞中捕获。IL4Rα-GPIb/IX 复合物通过抗 IL4Rα 单克隆抗体 clone 25463 从 IL4Rα-GPIbα MK 中捕获。通过辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG 检测到自身抗体与捕获抗原的结合。数值表示 2 次独立实验的平均值 ± 标准差。*P<0.05，**P<0.01（使用 Dunnett 检验进行单因素方差分析，与正常血浆结合相比）。Ab：抗体；OD：光密度。

其次，GP 缺陷的 MK 细胞可作为自身的内部对照，提高自身抗体表位特征的特异性和分辨率。例如，GPIbα 是已知唯一含有自身反应性表位的 GPIb/IX 复合物成员。然而，利用缺乏经过严格筛选的血小板膜 GP 的完整 iPSC 衍生的 MK 细胞系，我们能够识别出针对该复合物中 GPIX 组件的自身抗体（图 3A）——这是设计针对循环自身抗体滴度的 GP 特异性嵌合自身抗体受体（CAAR）T 细胞的关键第一步（参见参考文献 35 和下面的讨论）。

第三，使用完整细胞仅能识别能够与细胞表面表位反应的自身抗体亚群，而忽略所谓的“旁观者抗体”，这些抗体可能是在抗体介导的血小板破坏过程中产生的。这些隐秘表位通常位于血小板表面 GP 的细胞内区域（21,22）或细胞质蛋白（36,37）上，作为次级免疫反应产生，并在 ITP 以及其他血小板破坏性疾病（如输血后紫癜和药物诱导的 ITP）中被发现。隐秘表位也可能位于血小板表面糖蛋白的细胞外结构域中，并在血小板老化、激活或损伤等条件下暴露出来（39-42）。自然产生的针对这些表位的自身抗体被认为有助于清除循环中的老化或受损血小板。

第四，作为血小板前体，MK 细胞提供了丰富的血小板表面糖蛋白靶点，从而有可能检测到 ELISA 检测面板中未包含的罕见抗原的自身抗体。在某些 ITP 病例中已报告了针对 GPVI 的自身抗体（43-46）。由于当前的 ITP 检测面板中没有提供 GPVI 作为靶点，这些病例可能被低估了。尽管我们尚未生成缺乏 GPVI 的 MK 细胞来表征抗体特异性，但我们预计在初步筛选中能够检测到与野生型 MK 结合的未知抗体。随后可以进行进一步研究以确定自身抗原的特异性。这种方法可以减少错过潜在致病自身抗体的可能性。

抗 CD20 单克隆抗体利妥昔单抗常被用作二线疗法，用于消除 B 细胞，而不考虑其特异性，以治疗 ITP。虽然最初是针对血液系统癌症开发的，但携带嵌合抗原受体（CAR）的 T 细胞（针对 CD19 和 CD20）目前正在多项自身免疫性疾病中进行临床试验（47）。从 2016 年开始，CAR T 细胞被重新设计为在其表面表达嵌合自身抗原，从而特异性地消除致病性的自身反应性 B 细胞，同时保留未参与自身免疫疾病的 B 细胞（48-50）。在 ITP 领域，已经开发出 GPIbα-CAAR T 细胞来消除特异性针对 GPIba 的 B 细胞（35）。未来的发展可能涉及开发多种 GP 特异性的 CAR T 细胞，这进一步凸显了像这里描述的这类敏感检测方法的必要性，这些方法对于选择合适的 CAR T 细胞治疗 ITP 至关重要。

ITP 是一种异质性疾病，包含具有不同临床和血清学特征的 patient 组。识别致病性抗血小板自身抗体对于推进我们对这种疾病的理解具有重要意义，并为改善 ITP 的研究、诊断和治疗带来巨大潜力。正如当前研究所展示的，全 MK 检测方法能够敏感检测并表征来自 ITP 血浆的致病性自身抗体。这种方法也可以用于分析与血小板相关的自身抗体，前提是这些抗体可以从患者血小板中分离出来（在线补充图 S9）。然而，由于缺乏额外的患者血小板和分离液，我们只能进行一项可行性研究。

目前，ITP 的诊断依赖于排除其他原因，但这存在误诊的风险。为了降低处理缺乏完整临床史的去标识化血浆样本时的风险，我们仅纳入了之前被确认携带与血小板相关或循环自身抗体的患者。未来的临床研究需要同时包含抗体阳性和阴性的 ITP 病例以及完整的患者医疗史，以全面验证 WMK 检测方法的临床实用性。我们预计 WMK 可能会发现血清学上未确认的 ITP 病例中未被发现的抗体，类似于我们在 BSS 患者中检测到的先前无法检测到的抗 GPIb/IX 同种抗体（在线补充图 S7），从而提高 ITP 诊断的敏感性和准确性。

目前的 GP 缺陷 MK 检测面板可以扩展到包括其他 GP 靶点，如 GPIa/IIa 和 GPVI。然而，由于我们的诊断实验室缺乏相关的 ITP 血浆样本，这些靶点的验证目前受到限制。这种新策略临床应用的主要挑战在于从已建立的 iPSC 系统中生产足够的 MK 细胞，因为大多数诊断实验室不具备进行 MK 分化的能力。未来可以通过使生物工程化的 iPSC 衍生的 MK 永生化来克服这一障碍，从而促进更广泛的临床应用。

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