综述：克隆性造血驱动突变：分子机制及其临床意义——通过子代细胞的促炎特性实现前白血病造血干细胞和前体细胞的“包容性适应”

《Haematologica》：Clonal hematopoiesis driver mutations: molecular mechanisms and clinical implications - inclusive fitness of pre-leukemic hematopoietic stem and progenitor cells through pro-inflammatory features of their progeny

　　塔尔·巴哈拉克（Tal Bacharach）、阿德里安·杜埃克（Adrian Duek）、利兰·I·什卢什（Liran I. Shlush）
魏茨曼科学研究所分子细胞生物学系，雷霍沃特（Rehovot）

克隆性造血是由携带体细胞驱动突变的造血干细胞和前体细胞的年龄相关性扩增所驱动的；然而，这些细胞长期存活的机制尚未完全明了。本综述通过包容适应性（inclusive fitness）的视角来理解克隆性造血，提出突变的前白血病造血干细胞和前体细胞不仅通过内在的自更新优势增强其进化成功，还通过其分化后代的间接效应来实现这一目标。我们综合证据表明，突变的免疫细胞会促进炎症微环境的形成，这种微环境选择性地损害野生型造血干细胞，同时增强突变细胞的自我更新，从而建立自我维持的反馈循环，影响克隆动态和系统性疾病风险。

**引言**
长寿细胞不可避免地会在时间积累体细胞突变，而且矛盾的是，不复制的细胞可能比分裂的细胞积累更多突变；例如，心肌细胞比淋巴细胞含有更多的体细胞单核苷酸变异。然而，克隆扩增（定义为单个细胞分裂成大量子细胞的过程）只发生在分裂的细胞中，可能是由于正向选择或遗传漂变所致。因此，大多数更新的人类组织中都可能出现克隆扩增。在本综述中，我们使用进化科学的概念来描述克隆性造血的各种特性，特别关注包容适应性。

**克隆性造血中的选择与漂变**
在克隆性造血中，尽管一些观察结果与遗传漂变相符，但大多数证据表明正向选择是塑造老化血液系统体细胞进化的主要力量。漂变可能发生在造血干细胞（HSC）有效种群规模减小的情况下，例如再生障碍性贫血，其中自身免疫严重耗尽了HSC，或在胚胎早期HSC种群规模较小，这可能使罕见变异以较高的频率固定下来。这样的遗传漂变证据来自缺乏复发动态突变的克隆性造血病例。衰老还与HSC克隆多样性降低（有效种群规模减小）有关，这可能导致没有适应性优势的突变固定。在一个极端的例子中，研究人员记录了一位超级百岁老人的突变模式，并证明大多数血细胞是两个主要克隆的后代，这两个克隆携带的体细胞突变没有预期的功能选择优势。另一种解释可能是我们仍然不完全理解许多变异的选择优势，因此错误地将这些情况归类为漂变。如果将所有非重复事件视为克隆性造血，那么70岁以上个体中克隆的普遍比例超过1%，而不是之前估计的10-20%。克隆性造血中漂变与正向选择之间的争论仍未解决；然而，这一点在临床方面非常重要，因为非重复事件通常不会导致白血病，但可能导致其他病理状况。

尽管如此，遗传漂变驱动的造血扩增概率很低。HSC的有效种群规模估计约为1万到10万个细胞，其下游前体细胞的数量更多，因此在年轻个体中随机固定突变极为罕见。此外，随着年龄增长，同一造血细胞类型的多个个体中会出现有限基因组的重复突变——即克隆性造血现象。这些突变在多个个体中独立出现的极低可能性强烈表明正向选择驱动了它们的重复发生。观察到相同的体细胞突变可以在多个造血谱系（包括髓系和淋巴系）中检测到，这表明正向选择在HSC水平上起作用。相反，观察到在成熟血细胞中CH突变的变异等位基因频率高于HSC，这表明正向选择也可能在更分化的细胞 compartment 内起作用，但支持这一观点的明确证据仍缺乏。总体而言，大多数克隆性造血病例可能是由正向选择驱动的，至少部分在HSC层面起作用，从而导致前白血病造血干细胞的产生。

**克隆性造血相关突变的不完全外显率及其向白血病的转化**
虽然并非所有前白血病造血干细胞（preL-HSPC）都会在个体的一生中发展成白血病，但与野生型（WT）HSC相比，它们具有更高的演化潜力，因此在此被称为preL-HSPC。CH相关突变的不完全外显率（有些突变会导致白血病，而有些则不会）仍然是个谜。有人认为，体细胞不完全外显率的机制与生殖系相关疾病中的机制类似。需要注意的是，体细胞突变出现的年龄可能对此有重要影响。虽然本综述不会深入探讨这一主题，但必须认识到基因型-表型相关性是由风险等位基因和保护性等位基因及其与可变环境的相互作用共同决定的。所有这些变异都可能发生在生殖系或体细胞水平。最近发现了一个保护性生殖系变异的例子（在TCL1A基因中）。CH是否发展成白血病取决于血细胞内的复杂进化压力，包括突变发生的时间、细胞之间的竞争方式以及保护机制能否抑制危险克隆。

**前白血病造血干细胞和前体细胞的克隆动态**
HSC内的克隆动态为造血再生和血液系统疾病的发展提供了洞察。测序技术的进步揭示了驱动克隆优势的突变可能在生命早期出现，并在几十年内逐渐扩增。大多数克隆在40岁之前开始扩增。这意味着由于较小的选择优势，大多数preL-HSPC扩增非常缓慢。SRSF2、SF3B1和U2AF1的剪接体突变是例外，这些突变很可能在较老的年龄出现，并具有最高的适应性效应得分。Wagner等人最近计算了preL-HSPC的倍增时间。他们假设人类干细胞池由1万（或10万）个细胞组成，可检测到的克隆占该群体的1%。进一步假设是从单个突变细胞开始扩增，耗时约为60年；相对克隆大小的倍增时间估计约为9年（1万个HSC）或6年（100个HSC）。这与CH克隆的估计生长率相当。然而，目前大多数克隆动态研究依赖于对CH个体的短期监测，使用全外显子/基因组测序方法。这些研究在追踪缓慢扩增的克隆方面面临挑战，需要更长的随访期和更精确的测量方法来准确评估临床和治疗 Context 中的克隆动态。由于已有多种关于CH克隆动态的综述，本综述重点关注CH进化景观的一个特定方面：preL-HSPC如何通过其后代的影响主动塑造环境以促进自身的扩增。

**克隆性造血中的包容适应性**
包容适应性的概念最早由W.D. Hamilton在1964年提出。包容适应性包括直接适应性（个体自身繁殖的收益）和间接适应性（通过惠及相关个体获得的收益）。一个典型的包容适应性例子是雌性虎鲸延长后的繁殖寿命，这增强了后代的生存率——特别是较年长的雄性，从而提高了母亲的包容适应性。为了将包容适应性的设计原则应用于CH案例，需要证明以下几点：(i) 直接适应性的证据（已在本文前面部分讨论并证实）；(ii) preL-HSPC后代（即成熟细胞）产生的间接适应性的证据。在此提出，突变的成熟血细胞可以创造一个有利于祖先preL-HSC自我更新和持续存在的微环境。这种间接效应可以通过两种不同的方式发生。首先，突变的成熟免疫细胞/血小板/前体细胞可以改变微环境，特别是改变骨髓基质或免疫微环境，从而进一步促进造血中的克隆扩增。Ngo等人和Bachrach等人最近对此进行了综述。其次，突变的成熟免疫细胞可以影响其他组织并改变多种不同的疾病（非血液系统疾病）。受CH影响的疾病反过来又可以促进preL-HSPC的进一步扩增。首次证明这种可能包容适应性的证据来自观察结果：炎症会导致野生型HSC的自我更新减少和分化增加，而在CH中则相反。

**炎症对克隆性造血的影响**
在正常造血中，HSC的自我更新和分化在稳态和应激条件下保持平衡。炎症以相反的方式破坏WT和CH突变HSC的这种平衡：炎症在WT HSC中促进终末分化和自我更新丧失，但在突变HSC中增强自我更新，偏向于白血病发生。此外，突变HSC后代可以通过细胞因子分泌放大炎症，影响邻近的基质和间充质细胞，并重塑组织微环境。这些效应共同形成了一个自我强化的循环，其中preL-HSPC生成一个炎症性生态位，进而支持它们的持续扩增。本综述重点探讨了这种自我强化循环的机制。

**炎症对克隆性造血的影响（以干扰素-γ为例）**
与WT HSC的炎症反应不同，在Dnmt3a敲除（KO）小鼠中，M. avium感染在感染后2个月和12个月时都增加了移植效果。感染后，Dnmt3a KO HSC在二次应激下的分化减少和凋亡率降低，与WT HSC类似。与WT小鼠一样，这种反应依赖于干扰素-γ（IFN-γ），因为在Ifngr1 KO小鼠中，Dnmt3a KO小鼠的移植效果消失了。值得注意的是，受感染的Dnmt3a KO小鼠没有表现出成熟的髓系或淋巴细胞数量增加，表明分化受阻。在人类疾病中，携带DNMT3A突变的患者血清IFN-γ水平升高，尽管尚未确定因果关系。虽然该研究中无法确定血清IFN-γ升高的确切机制，但可以假设它与DNMT3A突变有关，从而提供了包容适应性的第一个可能例子。DNMT3A突变的preL-HSPC产生的成熟细胞分泌IFN-γ，为其后代（preL-HSPC）提供了选择优势。

**炎症对克隆性造血的影响（与脂肪骨髓和白细胞介素-6的关系）**
在另一种脂肪骨髓的小鼠模型中，人类和鼠类的DNMT3A突变preL-HSPC表现出自我更新增加，这种效应在来自老年小鼠的突变细胞中更为明显。脂肪骨髓小鼠的骨髓液和脂肪细胞在体外表达更高水平的白细胞介素（IL-6），中和IL-6可以降低DNMT3A突变preL-HSPC在脂肪骨髓条件下的选择优势。这些发现表明，与年龄相关的脂肪骨髓创造了一个促炎性的骨髓微环境，通过IL-6及其他介质为DNMT3A突变preL-HSPC提供适应性优势。有趣的是，SRSF2突变HSC在脂肪骨髓条件下并未获得类似的优势，这突出了内在细胞程序与外在炎症信号之间的突变特异性相互作用。在这个例子中，IL-6促进了DNMT3A突变preL-HSPC的自我更新。

总之，本研究强调了炎症在克隆性造血中的双重作用：在WT HSC中抑制自我更新和分化，在克隆性造血中增强自我更新。在人类研究中，骨髓脂肪的含量与骨矿物质密度相关。多项研究表明，在健康人群和骨质疏松症患者中，骨髓脂肪含量与骨矿物质密度之间存在显著的负相关关系。总体而言，包容性适应度（inclusive fitness）似乎可以解释所有这些相关性。DNMT3A突变型的前谱系造血干细胞（preL-HSPC）会产生分泌IL-6的单核细胞和中性粒细胞，并增加破骨细胞的数量，这些因素会降低骨矿物质密度并导致骨髓脂肪化，进一步加剧IL-6的分泌。IL-6既来自突变型单核细胞/中性粒细胞，也来自野生型脂肪化的骨髓，这种双重作用促进了DNMT3A突变型前谱系造血干细胞的扩增。尽管这一理论得到了文献的支持，但仍需要正式的证据来验证。

在炎症过程中，克隆造血干细胞（clonal hematopoiesis）中的突变造血干细胞会增强自我更新能力并降低分化能力——以TET2和白细胞介素-1β（IL-1β）为例：在使用LPS处理的急性炎症模型中，TET2基因敲除（KO）的小鼠表现出造血干细胞（HSC）、谱系造血干细胞（HSPC，即LSK细胞）和常见髓系祖细胞的扩增。虽然LPS降低了野生型（WT）HSC的植入能力，但TET2 KO小鼠的HSC植入能力却增强了。TET2 KO LSK细胞在感染后表现出对凋亡的抵抗力，并且IL-6的表达水平升高。IL-6激活了Shp2/Stat3/Morrbid介导的促存活通路，在WT和TET2 KO小鼠中均有体现，但在KO小鼠中这一通路更为显著。在其他小鼠模型的移植实验中，当将TET2 KO细胞移植到未经额外炎症刺激的IL-1β处理的受体内时，无论是否受刺激，TET2 KO细胞都能保持较高的植入率；而IL-1β在两种基因型中都显著增加了髓系细胞的产量，尤其是在TET2 KO小鼠中更为明显。IL-1β还增强了TET2 KO HSC的自我更新能力。这些研究证实了IL-1β在TET2 KO小鼠自我更新增强中的作用，从而完成了包容性适应度的循环。目前还需要进一步的证据来证明成熟TET2 KO细胞会分泌更多的IL-1β。

在动脉粥样硬化小鼠模型中，TET2 KO HSC的植入能力高于WT HSC，这与动脉斑块大小的增加有关。来自这些小鼠的腹膜TET2 KO巨噬细胞在受到LPS或IFN-γ刺激时，表现出促炎基因表达的增加，包括IL-6和IL-1β。通过药物抑制NLRP3炎症小体，巨噬细胞和动脉斑块的大小都得到了改善，这表明在炎症应激下，TET2缺陷的巨噬细胞通过分泌IL-1β促进过度炎症反应，从而加重动脉粥样硬化。在左前降动脉结扎诱导的心肌梗死模型中观察到了类似的现象，TET2 KO小鼠出现了更严重的病理变化，包括收缩功能障碍加重、纤维化增加和心脏肥大。髓系特异性TET2基因的缺失也再现了这些效应，伴有心脏组织和骨髓来源的巨噬细胞中IL-1β、IL-6、CCL5和SELP表达的升高。抑制炎症小体可以恢复受损的心脏修复能力，突显了TET2缺陷巨噬细胞通过炎症小体激活在心肌梗死后病理过程中的作用。此外，TET2在肥胖和老年小鼠中的缺失还通过IL-1β加剧了胰岛素抵抗和高血糖。

在JAK2突变的前白血病造血干细胞和祖细胞中，炎症也增强了自我更新能力。在髓系增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm, MPN）患者中，粒细胞中的IL-1β和IL-1α表达与JAK2V617F变异等位基因的频率相关。在小鼠模型中，JAK2V617F突变与IL1受体（IL1R）的缺失共同作用，逆转了JAK2V617F小鼠的多种疾病表型，包括外周血细胞计数异常、骨髓和脾脏中的髓系细胞扩增、HSPC水平升高、集落形成能力增强（CFU-GM和CFU-MK）、脾肿大、骨髓纤维化以及HSC植入异常。这些结果表明IL-1β促进了JAK2 V617F驱动的MPN的自我更新和临床特征，提供了另一个包容性适应度的例子。JAK2 V617F变异等位基因的频率还与MPN患者的血浆TNF-α水平相关。TNF-α补充剂降低了健康CD34+细胞的集落形成能力，但增加了MPN来源的CD34+细胞的集落产量，并且选择性地促进了突变细胞集落的扩增，而抑制了野生型细胞的集落生长。

克隆造血干细胞中的突变免疫细胞通过非细胞自主机制影响邻近细胞，从而促进炎症。WT单核细胞衍生的巨噬细胞在接触DNMT3A或TET2缺陷单核细胞衍生的巨噬细胞的条件培养基后，上调了干扰素信号通路，而自身并没有发生DNMT3A或TET2表达的变化。这表明突变型髓系细胞可以通过细胞自主和非细胞自主机制促进炎症。同样，携带JAK2V617F突变的MPN患者的WT CD34+造血祖细胞对TNF-α介导的集落形成抑制更为敏感，进一步支持了突变细胞在调节炎症环境、进而影响其他造血群体中的作用。在心血管背景下，用DNMT3a-KO单核细胞的上清液处理的心脏成纤维细胞上调了TGF-β和α-平滑肌肌动蛋白（marker of myofibroblast activation）。类似地，用DNMT3a-KO单核细胞上清液处理的心脏球（cardiospheres，一种3D心脏组织模型）会损害收缩功能，表明突变型髓系细胞可以通过分泌因子影响心脏重塑和功能。

总之，髓系细胞中DNMT3a和TET2的突变增强了炎症信号通路，促进了IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子的分泌，这些因子导致局部和全身炎症，影响附近的非造血细胞，并驱动病理组织重塑（如纤维化和心脏功能障碍）。

**结论与未来方向**
本综述综合了越来越多的证据，表明克隆造血（CH）不仅受到HSPC中驱动突变的内在效应及其与环境相互作用的经典正选择（positive selection）的影响，还受到其分化后代的非细胞自主机制（inclusive fitness）的影响。在包括DNMT3A、TET2和JAK2在内的多种CH相关突变中，突变型前谱系造血干细胞在炎症条件下表现出选择性优势，能够抑制野生型干细胞的自我更新，同时保持或增强突变干细胞的持久性。同时，成熟的突变免疫细胞常常表现出过度炎症表型，这些表型由细胞因子信号通路和先天免疫感受通路驱动，从而重塑局部和全身环境。这些观察结果支持了一个概念框架，即CH突变通过直接和间接的方式增加HSPC的适应度，符合进化中的包容性适应度原则，即后代对其祖先克隆的长期成功有所贡献。尽管有强有力的间接和机制上的支持，但一些关键问题仍未解决，这些是未来研究的重要方向。最重要的是需要直接的实验证据来将特定的突变后代群体与体内干细胞水平的持续优势联系起来。解析特定突变的反馈回路，明确全身炎症与骨髓限制炎症的相对贡献，以及确定年龄、组织环境和共病如何改变这些相互作用将至关重要。同时，整合克隆动态、炎症状态和临床结果的纵向人类研究将有助于区分炎症在疾病进展中的促进作用和因果作用。最后，这个框架提出了一个可能性，即选择性地靶向炎症回路或后代衍生的信号（而非突变型HSPC本身）可能是一种治疗策略，可以在保护正常造血的同时限制克隆扩增。理解何时以及如何安全地破坏这种类似包容性适应度的反馈回路仍是该领域的核心挑战。