COUP-TFII通过激活BCL11A-XL抑制剂LIN28B来调控血红蛋白的转换，并在胎儿与成人红系细胞中直接结合δ和β珠蛋白的启动子

《Haematologica》：COUP-TFII regulates hemoglobin switching by activating the BCL11A-XL repressor LIN28B and directly binding δ and β globin promoters in fetal versus adult erythroid cells

　　卡尔罗塔·弗里戈（Carlotta Frigo）、瓦伦蒂娜·帕斯托里（Valentina Pastori）、詹卢卡·赞班尼尼（Gianluca Zambanini）、玛蒂娜·法比亚诺（Martina Fabiano）、萨吉拉·艾哈迈德（Sajeela Ahmed）、埃莉莎贝塔·奇特里奥（Elisabetta Citterio）、克劳迪奥·坎图（Claudio Cantù）、安东内拉·埃莱娜·朗基（Antonella Ellena Ronchi）
意大利米兰比科卡大学（Università degli Studi di Milano-Bicocca）生物技术和生物科学系

胎儿珠蛋白基因的重新激活是治疗β-血红蛋白病的最有前景的方法，这意味着可以逆转自然发生的血红蛋白转换过程。在本研究中，我们发现孤儿核受体COUP-TFII在成人HUDEP2红细胞前体细胞中的表达会通过特异性占据β-位点中的“成人”β-区域来激活γ-珠蛋白（HbF），同时抑制β-成人珠蛋白。值得注意的是，尽管COUP-TFII和主要的γ-珠蛋白抑制剂BCL11A-XL具有相似的DNA结合位点和大量的染色质靶点（包括β-位点的调控区域），但它们对γ和β启动子的结合方式不同，从而导致相反的转录结果。此外，我们发现COUP-TFII还能激活Lin28B，这是一种已知的BCL11A-XL的转录后抑制剂。我们的研究揭示了一种分子机制，有望用于提高β-血红蛋白病患者体内的γ-珠蛋白水平。

**引言**
从胎儿（HbF）珠蛋白到成人（HbB）珠蛋白的表达转换是人类发育过程中的一个关键事件，而逆转这一过程为β-血红蛋白病患者提供了具体的治疗选择。目前，重新激活胎儿γ-珠蛋白以治愈β-血红蛋白病的努力主要集中在针对HbF抑制剂上，其中BCL11A-XL是最重要的抑制剂之一。已经证明，特异性抑制BCL11A-XL是一种有效的治疗策略，这突显了阐明影响珠蛋白基因表达的机制和因素的重要性。然而，人们对HbF激活的分子机制仍知之甚少。
最近的研究表明，孤儿核受体COUP-TFII/NR2F2在小鼠胚胎发育过程中（特别是在卵黄囊来源的细胞中）具有生理活性，当它在成人细胞（包括人类撒丁岛β039型地中海贫血细胞）中重新表达时，能够重新激活胎儿珠蛋白，从而克服了所有胎儿珠蛋白抑制剂的抑制作用。然而，其作用机制尚未得到充分探究。为了解COUP-TFII促进胚胎/胎儿红细胞生成的能力及其在成人细胞中部分逆转珠蛋白表达的分子基础，我们对HUDEP细胞中的COUP-TFII结合位点进行了全基因组分析。这些源自人类脐带血的永生化细胞能够模拟胎儿与成人红细胞生成环境中的珠蛋白基因调控：HUDEP1仅表达胎儿γ-珠蛋白，而HUDEP2则表达成人β-珠蛋白及其所有抑制因子（包括BCL11A-XL）。由于COUP-TFII在DNA上识别的是核受体常见的GGTCA结合位点，这与BCL11A-XL的结合位点几乎相同，因此HUDEP2细胞使我们能够测试COUP-TFII是否通过与BCL11A-XL竞争同一DNA序列来克服对γ-珠蛋白的抑制。同时，通过比较HUDEP1和HUDEP2细胞中的CUT&RUN分析结果，可以评估COUP-TFII在胎儿样与成人样细胞中的染色质重新分布情况，并识别除珠蛋白位点之外控制血红蛋白转换的其他相关靶点。

**方法**
单细胞RNA测序数据分别来自Popescu等人（E-MTAB-7407）和Ranzoni等人（E-MTAB-9067）。对于胎儿肝脏数据，进一步处理和分析使用了Scanpy（版本1.10.4）和Numpy（版本2.0.2）。排除了检测到基因少于200个的细胞，以及线粒体DNA含量超过5%的细胞，以减少来自受损或死亡细胞的潜在偏差。处理后的数据使用Celltypist（v1.6.3）进行注释，并应用预训练的“Pan_Fetal_Human.pkl”模型以确保分析一致性。对于卵黄囊数据，未进行额外预处理，细胞类型注释遵循原始作者的分类方法。结果通过UMAP嵌入图进行可视化。

**细胞系**
HUDEP1和HUDEP2细胞根据标准协议进行培养。培养基和培养条件的详细信息见表1。

**构建元件**
Nr2f2小鼠cDNA被克隆到IRES-EmeraldGFP (eGFP) pHR SIN BX IR/EMW慢病毒载体中。psPAX2和pMD2.GVSVG包装质粒用于在HEK293T细胞中生成慢病毒伪颗粒（lentiweb.com）。

**慢病毒转导**
HEK293T细胞转染72小时后，收集重组病毒颗粒并在K562细胞上进行滴度测定。转导HUDEP1和HUDEP2细胞的MOI为20-30。实验中使用的感染细胞比例（以eGFP+细胞计）≥75%（在线补充图S1）。

**RNA分离和实时定量聚合酶链反应**
总RNA使用Trizol Reagent（Euroclone）纯化，并通过High Capacity cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）进行逆转录。实时分析使用StepOneTM仪器（Applied Biosystems）和SsoAdvanced? Universal SYBR? Green Supermix（Bio-Rad）完成。引物信息见表2。

**Western印迹**
总蛋白提取物和核蛋白提取物按标准程序制备。蛋白质条带（5-10 μg/条）通过10-15%丙烯酰胺凝胶进行SDS/PAGE分离，然后转移到Hybond-ECL硝酸纤维素膜上（GE healthcare）。膜经封闭处理后，加入相应抗体孵育，洗涤后使用ECL试剂（Millipore）进行检测。抗体信息见表3。

**CUT&RUN**
CUT&RUN-LoV-U实验按照Zambanini的方法进行。每个样本（未转导或用COUP-TFII载体转导的HUDEP1/2细胞）收集500,000个细胞。细胞用核提取缓冲液洗涤三次后，核蛋白与Magnetic ConA Agarose珠子结合。样品与抗体一起孵育过夜，多余抗体被洗涤掉，随后在4°C下用pAG-MNase消化30分钟。消化完成后用CaCl2（2 mM）停止消化，并在STOP缓冲液中洗脱DNA。消化液与相应的DNA洗脱液混合，DNA结合到珠子上后弃去上清液，珠子用80%乙醇洗涤两次。DNA用Tris-HCl洗脱，整个过程重复两次。

**电泳迁移率检测**
COS7细胞（转染了BCL11A-XL-myc或COUP-TFII-Flag载体）的核蛋白提取物按照先前的方法制备。使用标记有32P的DNA寡核苷酸探针（FW: 5’ACTGAACCCTTGACCCTGCCCT, REV: 5’AGGGCAGGGTCAAGGGTTCAGT）与1-3 μg的核蛋白提取物在室温下孵育20分钟。蛋白-DNA复合物在5%丙烯酰胺凝胶（29:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺比例）上进行分离，并通过放射自显影技术可视化。BCL11A-XL和COUP-TFII条带分别用anti-myc（Ab32 Abcam）和anti-Flag（F7425 Sigma-Aldrich）抗体鉴定。

**结果**
**早期人类红细胞生成中的COUP-TFII表达**
在E11.5小鼠胚胎肝脏中，Coup-TFII在红细胞-髓系祖细胞（EMP）中表达，并随着这些细胞向红细胞分化而减少。为了确定这种表达模式是否在人类红细胞生成中也存在，我们分析了三个代表不同时间点的单细胞RNAseq数据集：受精后4-7周的卵黄囊（YS）、7-17周的胎儿肝脏以及17-22周的胎儿肝脏（图1）。Popescu等人的数据集显示，受精后4-7周的卵黄囊中有两个表达Coup-TFII的细胞群体（左图）：第一个群体被归类为内皮细胞，表达高水平的COUP-TFII和低水平的珠蛋白；第二个群体被归类为巨核细胞-红细胞-肥大细胞祖细胞（MEMP），同时表达COUP-TFII和珠蛋白（主要是HBG2）。另外两个独立的数据集也显示，在胎儿肝脏中存在同时表达COUP-TFII和珠蛋白基因的细胞群体（图1，中间和右图）。在两个胎儿肝脏数据集中，COUP-TFII+珠蛋白+群体被鉴定为内皮细胞。在7-17周时，还发现了一个额外的“血管平滑肌细胞（VSMC）周细胞”群体。这两个COUP-TFII+珠蛋白+群体共同表达的基因与Diamond-Blackfan贫血（DBA）相关（罕见病数据库Orphanet：https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich?dataset=608a66f9e8a7b-d75e308bd91e8ed9024）。DBA是一种罕见的先天性再生障碍性贫血，影响非常早期的红细胞祖细胞，这一观察结果与早期红细胞特征一致。

**COUP-TFII和BCL11A-XL的相互作用**
在成人细胞（包括β039型地中海贫血细胞）中，COUP-TFII的重新表达会以β-珠蛋白为代价激活γ-珠蛋白。为研究COUP-TFII在成人细胞中激活γ-珠蛋白的分子机制，我们在类似成人的HUDEP2（表达成人β-珠蛋白）和类似胎儿的HUDEP1（表达胎儿γ-珠蛋白）脐带血来源的祖细胞中重新表达了COUP-TFII。在HUDEP2中，COUP-TFII在RNA（图2A）和蛋白质水平（图2B）上均能激活γ-珠蛋白，这与预期一致。BCL11A-XL在DNA上的结合位点与COUP-TFII的结合位点（GGTCA）相同。由此我们假设COUP-TFII可以直接与BCL11A-XL竞争其在γ-珠蛋白启动子上的结合位点。为了验证这一假设，我们首先检查了BCL11A-XL在体外是否能与ApoAI增强子上的COUP-TFII结合位点结合。观察到这两种蛋白确实能够结合，且各自的结合位点可通过特异性抗体被识别（图2D）。随后我们使用CUT&RUN分析了HUDEP2中COUP-TFII的全基因组结合位点，并将其与Liu等人公布的BCL11A-XL的结合位点进行比较。作为对照，我们还在不表达BCL11A-XP且高表达γ-珠蛋白的类似胎儿的HUDEP1细胞中进行了COUP-TFII的CUT&RUN分析。比较结果显示，BCL11A-XL和COUP-TFII在HUDEP2细胞中的结合位点有许多共同点（图2E, F），以及与Bcl11a敲除小鼠中受影响的基因相似的差异表达基因（DEG）。这些结果表明这两种蛋白可能通过竞争同一DNA序列来调节相同基因的表达（图2G）。为具体研究COUP-TFII和BCL11A-XL在珠蛋白调控中的相互作用，我们利用Liu等人的数据分析了它们在β-位点上的结合情况（图2H），发现这两种蛋白在位点控制区域（LCR）有共同的结合位点。令人惊讶的是，COUP-TFII并不结合到y-启动子内部的GGTCA序列上，而这些序列正是BCL11A-XL的作用目标。相反，COUP-TFII占据了“成体”δ-和β-珠蛋白启动子（图2H），这可能会干扰它们与LCR的相互作用。为了深入分析，我们使用另一种COUP-TFII抗体重复进行了两次CUT&RUN实验，并且只考虑了至少在四个重复实验中都出现的峰值（在线补充图S2）。这种分析得出的COUP-TFII在β-基因座上的结合谱与图2H中的谱图是一致的（见图3A）。进一步的足迹图谱确认了COUP-TFII在δ和β启动子上的结合（见图3B）。该区域是先天性胎儿血红蛋白持久性（HPFH）的自然缺失靶点，也是模拟HPFH表型的人为缺失区域（见图3C）。

在缺乏BCL11A-XL的HUDEP1细胞中，y-珠蛋白的表达水平大约是HUDEP2细胞的40倍（基于GAPDH计算），COUP-TFII仍然能够结合到LCR区域（见图3D）。然而，在“成体”启动子上并未检测到COUP-TFII的存在，这表明它在发育过程中能够重新调整其在基因座上的占据位置。在这些相同的细胞中，COUP-TFII的表达增加了ε-珠蛋白的表达，但并没有进一步增加已经很高且可能已经饱和的β-珠蛋白的表达（见图3E）。

值得注意的是，虽然COUP-TFII激活了y-珠蛋白的表达，但它同时减少了β-珠蛋白的转录（见图2A）。这种情况在HUDEP2和HUDEP1细胞中都存在，而在HUDEP1细胞中β-珠蛋白的表达水平本来就很低（见图3E）。最后，在α-珠蛋白基因座上，COUP-TFII在HUDEP1和HUDEP2细胞中显示出类似的占据模式，并且与α-珠蛋白相比，它更倾向于促进胚胎形式的ζ-珠蛋白的表达（见在线补充图S3）。

我们的CUT&RUN数据集使我们能够寻找COUP-TFII对其他参与血红蛋白转换的基因的潜在直接调控作用。我们重点关注了BCL11A-XL和LIN28B，这两种基因分别在类似成体的HUDEP2细胞和类似胎儿的HUDEP1细胞中选择性表达。在HUDEP2细胞中，COUP-TFII占据了已知BCL11A红系增强子内的+55Kb DNAseI高敏感位点，并在分化条件下弱抑制其转录（见图4A）。在HUDEP1细胞中，我们未能在BCL11A基因座内检测到COUP-TFII的峰值，因为该基因座的染色质构象是封闭的（相关数据见Huang等人的ATACseq研究）。HUDEP1细胞表达LIN28B，这是一种癌胎儿基因，它编码一种RNA结合蛋白，能够通过干扰BCL11A-XL的翻译来在成体细胞中激活y-珠蛋白。在这些细胞中，我们发现COUP-TFII激活了LIN28B，使其RNA和蛋白质水平均有所增加（见图4B）。在HUDEP2细胞中，由于LIN28B基因座不可接近，COUP-TFII无法与其结合（相关数据见Huang等人的研究）。综合这些数据表明，根据染色质的可及性，COUP-TFII可以通过选择性地占据BCL11A和LIN28B基因座来促进从胎儿状态向成体状态的转变（如图4C所示）。

目前针对β-血红蛋白病患者重新激活胎儿珠蛋白的研究主要集中在针对y-抑制因子上。然而，胚胎/胎儿细胞中y-珠蛋白是如何被激活的机制仍不清楚。我们最近首次报告称，在人类正常细胞和β-地中海贫血细胞中，COUP-TFII以牺牲β-珠蛋白基因为代价激活了y-珠蛋白。在本研究中，为了了解COUP-TFII如何在成体细胞中克服胎儿珠蛋白的抑制作用，从而部分恢复胎儿样的环境，我们分析了其在早期人类发育过程中的表达情况（基于scRNA数据集，见图1），并通过CUT&RUN技术在HUDEP1（类似胎儿的、表达y-珠蛋白的细胞）和HUDEP2（类似成体的、表达β-珠蛋白的细胞）中绘制了其基因组占据图谱。HUDEP1细胞使我们能够模拟类似胎儿的红细胞生成细胞，这些细胞由于伦理和技术原因难以获取。比较HUDEP1和HUDEP2细胞中COUP-TFII的基因组占据情况发现，COUP-TFII在珠蛋白基因座上的分布发生了显著变化。在类似成体的HUDEP2细胞中表达COUP-TFII时，它能在RNA和蛋白质水平上激活y-珠蛋白（见图2A和B），这与我们之前的研究结果一致。由于COUP-TFII与成体细胞中的主要y-珠蛋白抑制因子BCL11A-XL具有相同的DNA结合位点（见图2C），并且这两种蛋白在体外都能识别相同的序列（见图2D中的电泳迁移率测定），我们详细比较了它们在β-基因座上的占据情况（见图2H）。尽管这两种蛋白有许多相同的基因组靶点（见图2E和F），但它们也存在显著差异。在HUDEP1和HUDEP2细胞中，COUP-TFII均结合到LCR上，这表明它可能参与了调控珠蛋白基因在发育过程中顺序转录的转录复合体。然而，令人惊讶的是，COUP-TFII并不结合到y-启动子内的GGTCA序列上，而这些序列正是BCL11A-XL的作用目标。相反，COUP-TFII占据了“成体”的δ-和β-珠蛋白启动子（见图2H）。在这种情况下，我们推测COUP-TFII在δ和β启动子上的存在可能会阻碍或减弱它们与LCR的相互作用。这种机制可能导致y-珠蛋白在β-珠蛋白被抑制的情况下被激活（见图2A），从而克服了包括BCL11A-XL在内的多种抑制因子的共同作用。观察到的COUP-TFII在激活胚胎/胎儿珠蛋白的同时减少β-珠蛋白表达的现象（见图2A）与我们之前在CD34+细胞的β-地中海贫血红系细胞中获得的数据一致。这一发现表明，在成体细胞中重新激活COUP-TFII可能是一种增加y-珠蛋白表达的有效策略，同时还可以抑制有缺陷的β-珠蛋白链的细胞内积累。

总之，COUP-TFII在成体细胞中通过多种方式发挥作用：它不仅激活y-珠蛋白的表达，还降低了β-珠蛋白的表达；在类似胎儿的HUDEP1细胞中，它促进了胚胎形式的ζ-珠蛋白的表达；在类似成体的HUDEP2细胞中，它改变了染色质的可及性，从而影响了珠蛋白基因的表达。我们的工作模型强调了COUP-TFII在建立有利于y-珠蛋白表达的环境中的多重作用，并提出了一个分子机制来解释其在成体细胞中解除y-珠蛋白抑制的能力。目前尚不清楚为什么在HUDEP1细胞中检测不到COUP-TFII在成体区域的占据。我们认为这可能反映了该区域在HUDEP1中的不可及性，只有HUDEP2中的该区域是开放的，允许COUP-TFII结合到这些位置。此外，COUP-TF1细胞中虽然增加了E-珠蛋白的表达，但并没有进一步增加已经很高的β-珠蛋白表达。通过比较胎儿细胞和成体细胞中COUP-TFII的基因组占据情况，我们揭示了COUP-TFII在珠蛋白基因表达差异调控中的多重作用。我们认为，在从胎儿到成体的转变过程中，COUP-TFII的表达下降以及SOX6的同步增加可能通过多种机制促进血红蛋白的转换：直接调控珠蛋白基因座，以及通过其转录后抑制因子LIN28B来调节BCL11A-XL的翻译（如图4C所示）。需要指出的是，这一基于HUDEP细胞的分子模型可能无法完全反映体内的人类血红蛋白转换过程，需要在转换发生时的原代人体细胞中进行进一步验证。进一步的体内研究将有助于明确由Coup-TFII引起的胎儿/成体珠蛋白比例变化是否具有临床意义。总体而言，我们的研究有助于理解COUP-TFII在成体细胞中重新激活β-基因座中的γ-珠蛋白的分子机制，并为COUP-TFII如何整合到维持有利于γ-珠蛋白表达的胚胎/胎儿转录环境中的复杂网络中提供了新的见解。

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