特发性多中心卡斯特曼病的IPL亚型和TAFRO亚型中白细胞介素-6的生成存在差异

《Haematologica》：Distinct interleukin-6 production in IPL and TAFRO subtypes of idiopathic multicentric Castleman disease

　　西锅麻美 | 西村绿菲利兹 | 西村良人 | 山田里奥 | 原武子 | 江西大辅 | 千松亮人 | 伊藤敏宏 | 小贺智弘 | 冈田沙耶香 | 川原百合 | 上家日向 | 武田勇大 | 迈克尔·V·冈萨雷斯 | 大卫·C·法格根鲍姆 | 弗里茨·范里 | 桃尾修二 | 佐藤康晴
日本冈山县冈山大学健康科学研究生院分子血液病理学系

特发性多中心卡斯特曼病（iMCD）是一种罕见的淋巴增生性疾病，其特征是全身炎症和淋巴结肿大。该病有两种主要临床亚型：特发性浆细胞淋巴结病（iMCD-IPL）和伴血小板减少、腹水、发热、肾功能障碍/网状纤维化及器官肿大的iMCD（iMCD-TAFRO），这两型具有不同的病理生理机制。虽然已知iMCD患者体内白细胞介素-6（IL-6）水平升高，但不同亚型间IL-6的产生来源尚不明确。本研究通过免疫组化、原位杂交及基因表达谱分析探讨了iMCD亚型中IL-6的产生来源及其转录调控机制。免疫组化和原位杂交结果显示，在iMCD-IPL中浆细胞是主要的IL-6表达细胞；而在iMCD-TAFRO中，则是血管内皮细胞表达IL-6。此外，iMCD-IPL中的浆细胞IL-6蛋白表达水平高于iMCD-TAFRO。基因表达分析发现，iMCD-IPL中XBP1、MZB1、DERL3、SSR4、FKBP11、FKBP2、PIM2、RABAC1和SDF2L1等基因上调，这提示内质网应激和浆细胞分化可能参与了IL-6的异常调控。我们的研究结果表明，XBP1介导的IL-6生成可能参与了iMCD-IPL的发病机制，这或许可以解释该亚型对IL-6阻断治疗反应良好的原因。相反，iMCD-TAFRO中的IL-6主要来源于血管内皮细胞，表明血清中IL-6升高可能是该亚型细胞因子风暴的次要现象。未来的研究应阐明蛋白质组学和基因表达谱分析如何指导iMCD的亚型特异性治疗方案。

**引言**
特发性多中心卡斯特曼病（iMCD）是一种罕见的非克隆性淋巴增生性疾病，其特征为全身淋巴结肿大和炎症。该病分为两种临床亚型：特发性浆细胞淋巴结病（iMCD-IPL）和伴血小板减少、腹水、发热、肾功能障碍/网状纤维化及器官肿大的iMCD（iMCD-TAFRO），两者具有不同的临床病理特征和治疗反应。iMCD-IPL患者病情进展缓慢，表现为浆细胞增多和高丙种球蛋白血症；而iMCD-TAFRO则具有明显的临床症状，包括腹水等。组织学上，iMCD-TAFRO的生发中心及滤泡间区域可见显著的血管增生。这类患者常需要入住重症监护室或接受肾脏替代治疗。iMCD-TAFRO患者体内炎性细胞因子水平高，基因表达模式提示存在细胞因子风暴的病理状态。尽管过去十年IL-6抑制剂一直是iMCD的一线治疗方法，但不同亚型的患者对治疗的反应差异显著。先前研究发现，iMCD-IPL患者对siltuximab或tocilizumab的IL-6阻断治疗反应良好，且疗效可持续；而iMCD-TAFRO患者对IL-6治疗反应不佳，常需联合使用高剂量糖皮质激素、rituximab或淋巴瘤/骨髓瘤相关系统性化疗。另有研究表明，肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂和Bruton酪氨酸激酶（BTK）抑制剂也可能有效。这些差异提示不同亚型之间存在潜在的致病机制差异，可能与IL-6及其产生细胞的作用有关。尽管临床反应不同，但iMCD-IPL和iMCD-TAFRO患者的血清IL-6水平通常相似。最近在日本的研究中发现，部分TAFRO患者无淋巴结肿大。TAFRO无淋巴结肿大与有淋巴结肿大（包括iMCD-TAFRO）之间的病理差异尚不明确，可能与淋巴结中炎症相关基因的表达差异有关。最新基因表达研究发现，iMCD-TAFRO中PI3K-Akt信号通路显著富集，表明非IL-6细胞因子可能为其发病机制的主要驱动因素。先前的研究认为iMCD淋巴结中的IL-6来源于血管内皮细胞或B细胞，但未比较不同亚型间的差异。因此，本研究旨在通过免疫组化、原位杂交和基因表达分析，明确iMCD-IPL和iMCD-TAFRO中IL-6及其相关转录调控因子的细胞来源。

**方法**
研究共纳入64名iMCD-IPL患者（50例）或iMCD-TAFRO患者（14例），所有病例均来自日本冈山大学的病理咨询档案，并符合iMCD的诊断标准。所有病例均排除了IgG4相关疾病。目前使用三种iMCD-IPL的诊断标准，这些标准略有不同。本研究根据Kojima等人的标准诊断iMCD-IPL：（1）明显的多克隆性高丙种球蛋白血症（γ球蛋白>4.0 g/dL或血清IgG水平>3,500 mg/dL）；（2）广泛性淋巴结肿大；（3）无明确的自身免疫性疾病；（4）成熟浆细胞的片状浸润。iMCD-TAFRO的诊断标准包括血小板减少、腹水、发热/高炎症状态及器官肿大，此外还需满足其他临床标准或骨髓中的病理特征（如网状纤维化或巨核细胞增生）。所有患者均通过血清学或免疫组化方法排除卡波西肉瘤相关疱疹病毒/人类疱疹病毒8型感染。本研究已获得冈山大学机构审查委员会的批准（项目编号2007-033），并遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。

**组织学、免疫组化、样本定量及原位杂交**
所有淋巴结标本均经10%甲醛固定并石蜡包埋，切片厚度为3 μm，然后用苏木精和伊红染色。所有病例均进行了IL-6的免疫组化染色，并计算了H评分。此外，在2例iMCD-IPL和2例iMCD-TAFRO病例中观察了IL-6及其受体（IL-6R）mRNA的表达情况（在线补充附录）。

**全转录组分析**
对20名iMCD-IPL患者（12例）、未另行分类的iMCD患者（6例）及2名iMCD-TAFRO患者（2例，具有冷冻淋巴结病变）进行了全转录组分析。不符合iMCD-IPL和iMCD-TAFRO标准的患者被归为iMCD-NOS。所有iMCD-NOS病例均为不完全符合iMCD-TAFRO标准的类似病例，但他们伴有胸腔积液或腹水，并显示血管增生。总RNA提取和测序过程详见在线补充附录。随后使用CIBERSORTx软件（https://cibersortx.stanford.edu）进行去卷积分析。

**基因表达谱分析**
使用nCounter平台（NanoString Technologies，美国西雅图）对24例iMCD-IPL和7例IL-6蛋白表达阳性的iMCD-TAFRO病例进行了基因表达谱分析。RNA提取和测序过程详见在线补充附录。

**统计分析**
对于分类数据，我们使用了χ2检验；比较两个连续变量时使用了Wilcoxon秩和检验。所有P值均采用双侧检验计算，以0.05为统计显著性阈值。统计分析使用R版本4.2.1（https://cran.r-project.org）进行。

**结果**
表1总结了本研究患者的临床特征。iMCD-IPL患者与iMCD-TAFRO患者在年龄上无显著差异（P=0.644）。与先前研究和亚型定义一致，iMCD-IPL患者的血小板计数和免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）水平高于iMCD-TAFRO患者（P<0.001）。血清IL-6水平在不同亚型间无显著差异（P=0.234）。

**组织学、免疫组化和原位杂交结果**
iMCD-IPL和iMCD-TAFRO的病理学结果分别见图1和图2。iMCD-IPL淋巴结的生发中心正常或增生，滤泡间区域可见片状浆细胞增生（图1A）；常伴有含铁血黄素沉积（图1B）。而iMCD-TAFRO的生发中心萎缩，伴有明显的血管增生（图2A）；萎缩的生发中心内常见“漩涡状”血管（图2B）。部分iMCD-TAFRO病例还表现出血浆细胞增生，血管明显增多。在iMCD-TAFRO中，浆细胞并非以片状排列，而是散布在增殖的血管和淋巴细胞中（图2C、D）。

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**结论**
iMCD-IPL患者的IL-6蛋白表达水平显著高于iMCD-TAFRO患者（图3）。免疫组化显示，iMCD-IPL的滤泡间区域有片状成熟浆细胞增生，细胞质中可见IL-6颗粒（图3A）；血管内皮细胞也表达IL-6，但程度低于浆细胞（图3E）。iMCD-TAFRO中部分病例显示滤泡间浆细胞增生（图3B），血管内皮细胞也表达IL-6（图3D）。定量分析显示，iMCD-IPL的IL-6 H评分显著高于iMCD-TAFRO（P<0.001，图3G）。原位杂交结果进一步证实了免疫组化发现：iMCD-IPL的IL-6主要来源于浆细胞，而iMCD-TAFRO的IL-6主要来源于血管内皮细胞。此外，iMCD-IPL中的IL-6R mRNA主要存在于浆细胞中，而iMCD-TAFRO的IL-6R mRNA同时存在于浆细胞和血管内皮细胞中（图4C、D）。

**全转录组分析**
全转录组分析显示，不同iMCD病例间的转录本数量存在关联（图5）。部分iMCD-IPL样本（IPL1、2、4、5、6、8）与1例iMCD-NOS和1例iMCD-TAFRO病例（NOS1和TAFRO2）聚类在一起；其余iMCD-IPL样本（IPL3、7、9、10、11、12）则分属不同簇。属于独立簇的iMCD-IPL病例中，片段≥200个核苷酸的分布值（DV200）低于95%。通过非层次聚类分析识别了这些病例组中上调的基因。研究发现，iMCD-IPL中上调的基因主要与浆细胞相关（在线补充图S2）。然而，iMCD-IPL和iMCD-TAFRO之间的浆细胞数量无明显差异（P=0.536）。

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**图1. 特发性多中心卡斯特曼病-特发性浆细胞淋巴结病（iMCD-IPL）的病理学特征。** （A）滤泡间区域扩大，生发中心正常或增生；（B）滤泡间区域有片状成熟浆细胞增生及含铁血黄素沉积。

**图2. 特发性多中心卡斯特曼病伴血小板减少、腹水、发热、肾功能障碍/网状纤维化及器官肿大的病理学特征。（A）无浆细胞增生的iMCD-TAFRO：生发中心萎缩，血管明显增生；（B）有浆细胞增生的iMCD-TAFRO：生发中心萎缩，伴有漩涡状血管。**

**图3. 特发性多中心卡斯特曼病亚型中的IL-6免疫组化染色。** （A）iMCD-IPL：滤泡间区域有片状成熟浆细胞增生，细胞质呈颗粒状染色；（B）iMCD-TAFRO：滤泡间区域有浆细胞增生，并伴有明显的血管增生。比例尺 = 50 μm。 (G) iMCD-IPL与iMCD-TAFRO之间IL-6 H-score的比较。IL-6染色模式根据4分制（0-3）进行计算。H-score的计算公式如下：H-score = （0档的比例）× 0 + （1+档的比例）× 1 + （2+档的比例）× 2 + （3+档的比例）× 3，如先前所述。33 iMCD-IPL组的IL-6 H-score显著更高（P<0.001）。iMCD-IPL：中位数（四分位数范围）：162.1（115.7-196.0）；iMCD-TAFRO：中位数（四分位数范围）：36.4（17.7-58.3）。基因表达谱分析 对所有可用病例进行了105个基因的靶向基因表达谱分析（nCounter），以验证RNA测序的结果。在所有样本中表达量最高的十个基因是IGLL5、XBP1、MZB1、DERL3、SSR4、FKBP11、PIM2、FKBP2、RABAC1和SDF2L1（在线补充图S4）。值得注意的是，其中九个基因（XBP1、MZB1、DERL3、SSR4、FKBP11、FKBP2、PIM2、RABAC1和SDF2L1）在iMCD-IPL中的表达水平显著高于iMCD-TAFRO（每个基因的P值均<0.05，具体显著性不同）（图6）。按亚型显示的基因表达排序见在线补充图S5。讨论 本研究首次直接证明了iMCD-IPL和iMCD-TAFRO之间IL-6产生的不同途径，这是通过免疫组化、原位杂交和基因表达分析确定的。本报告首次直接证明了iMCD-IPL与iMCD-TAFRO之间存在不同的IL-6产生机制。先前的研究报告了iMCD内皮细胞中的IL-6信号传导，但没有区分亚型。21,23 我们发现iMCD-TAFRO亚型中的血管内皮细胞产生的IL-6更为明显。在iMCD-TAFRO中，我们观察到了PI3K-Akt通路的激活以及与细胞因子风暴相关的基因（如TNFA、IL1R、MTOR和VEGFA）的上调；6,19 然而，并未观察到IL-6基因表达的显著差异。因此，iMCD-TAFRO中血清IL-6的升高被认为是细胞因子风暴的结果，而不是主要的疾病驱动因素。5,34,35 相比之下，在iMCD-IPL中，我们在增殖的浆细胞中检测到了IL-6蛋白以及IL-6和IL-6R mRNA，支持了自分泌IL-6产生的假设。值得注意的是，IGLL5在iMCD-IPL中的高表达进一步强化了自分泌和可能的旁分泌机制，因为已知XBP1能驱动IL-6的分泌（图7）。XBP1是一种在多发性骨髓瘤中起作用的转录因子，它可以增强IL-6的分泌、浆细胞的存活和血管生成。36, 37, 38 此外，XBP1是一种与内质网（ER）应激相关的基因，其表达在淋巴结中B细胞分化为浆细胞的过程中增强。36,39 鉴于iMCD-IPL中的血管增生并不明显，20 XBP1的激活可能由除了血管生成之外的其他因素驱动，这与该亚型中IL-6上调的另一种机制一致。持续的XBP1驱动的IL-6循环可能解释了iMCD-IPL患者的临床特征，包括高丙种球蛋白血症和血小板增多症。虽然XBP1促进浆细胞存活的作用也可能有助于iMCD-IPL的慢性发展，但需要进一步研究以确定导致浆细胞过度分化和IL-6产生的XBP1激活的触发因素。此外，本研究中的基因表达分析显示，iMCD-IPL与ER应激相关基因（包括XBP1）的表达增加有关。ER应激与淋巴结中的浆细胞密切相关，确定这种基因特征的增加是否依赖于iMCD-IPL和iMCD-TAFRO的组成细胞至关重要。反卷积分析显示，iMCD-IPL和iMCD-TAFRO之间的浆细胞数量没有显著差异，这表明两组之间的IL-6活性差异可能是由于它们的不同特征而非浆细胞数量造成的。组织学上，iMCD-TAFRO中的浆细胞与血管细胞和淋巴细胞混合在一起，而iMCD-IPL中的浆细胞则呈片状增殖。iMCD-IPL和iMCD-TAFRO中浆细胞的分布区域和外观模式被认为是不同的。下载：下载文件（1MB）下载：下载全尺寸图像 图4. 特发性多中心卡斯特曼病亚型中的白细胞介素-6和白细胞介素-6受体原位杂交。(A) 特发性多中心卡斯特曼病-特发性浆细胞性淋巴结病（iMCD-IPL）。主要在浆细胞中观察到白细胞介素-6（IL-6）mRNA信号（黄色箭头）。比例尺 = 50 μm。(B) 伴有血小板减少、水肿、发热、肾功能障碍/网状内皮纤维化和器官肿大的特发性多中心卡斯特曼病（iMCD-TAFRO）。在血管内皮细胞中检测到IL-6 mRNA信号（黄色箭头）。未在浆细胞中检测到IL-6 mRNA信号。比例尺 = 50 μm。(C) iMCD-IPL。主要在浆细胞中检测到IL-6受体（IL-6R）mRNA信号（黄色箭头）。比例尺 = 50 μm。(D) iMCD-TAFRO。在血管内皮细胞中观察到IL-6R mRNA信号（黄色箭头）。未在浆细胞中检测到IL-6R mRNA信号。比例尺 = 50 μm。下载：下载文件（368KB）下载：下载全尺寸图像 图5. 特发性多中心卡斯特曼病亚型的全转录组分析。基于每百万转录本的750个高变异性基因，对特发性多中心卡斯特曼病病例进行了相关性分析。在包含IPL1、2、4、5、6、8、NOS1和TAFRO2的簇中观察到强烈的正相关。下载：下载文件（219KB）下载：下载全尺寸图像 图6. 使用定制面板对特发性多中心卡斯特曼病亚型进行基因表达分析。比较特发性多中心卡斯特曼病-特发性浆细胞性淋巴结病（iMCD-IPL）和伴有血小板减少、水肿、发热、肾功能障碍/网状内皮纤维化和器官肿大的特发性多中心卡斯特曼病（iMCD-TAFRO）中前十个表达最丰富的基因（IGLL5、XBP1、MZB1、DERL3、SSR4、FKBP11、PIM2、FKBP2、RABAC1和SDF2L1）的表达水平。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, NS：无显著差异。我们注意到iMCD-IPL中的IL-6蛋白染色在浆细胞中比在血管内皮细胞中更强。此外，iMCD-IPL中的浆细胞IL-6染色强度高于iMCD-TAFRO中的浆细胞。这种差异可能并不反映IL-6的单纯过度产生，而是由于iMCD-IPL中的浆细胞内产生的IL-6被滞留而非分泌。这种慢性自分泌的IL-6信号传导机制可能维持着iMCD-IPL中的浆细胞持续增殖及相关症状，这需要在未来的研究中得到验证。相反，iMCD-TAFRO中以内皮细胞来源的IL-6为主可能反映了不同的病理生理机制，并解释了为什么一些iMCD-TAFRO患者对IL-6抑制剂反应有限。值得注意的是，免疫组化测定的IL-6 H-score在iMCD-IPL中显著更高；可能需要考虑这是由于iMCD-IPL组织中浆细胞数量较多所致，这可能并不真正反映实际的IL-6量。然而，由于大多数iMCD-TAFRO病例确实存在不同程度的浆细胞性增生和少量IL-6阳性细胞，我们针对每个病例的热点区域量化了H-score，因此染色强度的差异可能是iMCD-IPL中H-score较高的原因。我们在iMCD-IPL和iMCD-TAFRO中都发现了相似的高IGLL5表达，但这一观察结果的显著性可能因亚型而异。在iMCD-IPL中，IGLL5的上调可能归因于浆细胞的数量较多，因为IGLL5位于免疫球蛋白λ位点并参与B细胞的发育。40 相比之下，iMCD-TAFRO中IGLL5的意外高表达可能代表了一个有趣的悖论，表明可能是不同类型细胞或信号在iMCD-TAFRO中驱动IGLL5。值得注意的是，IGLL5在多发性骨髓瘤和肿瘤浸润免疫细胞中也上调，表明其在免疫调节和炎症中具有广泛的作用。41,42 一个潜在的假设是，iMCD-TAFRO中的IGLL5表达可能源自非浆细胞群体，如激活的B细胞、树突状细胞或髓系来源的抑制细胞，在广泛的内皮细胞激活和严重的细胞因子风暴背景下。未来的研究应采用单细胞RNA测序和空间转录组学来确定iMCD中IGLL5的细胞来源，并阐明其在免疫失调中的作用。这些方法还可以确定IGLL5是否可以作为特定iMCD亚型的有用生物标志物或治疗靶点。相对于iMCD-TAFRO，iMCD-IPL中还有几个其他基因的表达显著增加，包括DERL3、SSR4、FKBP2和FKBP11。DERL3编码一种由ER应激激活的Derlin家族蛋白。43 SSR4编码跨ER膜转运蛋白（TRAP）复合体的一种成分。44 FKBP2和FKBP11编码在ER应激期间上调的FK506结合蛋白；值得注意的是，FKBP11在XBP1驱动的B细胞分化为浆细胞的过程中被诱导。45 表达模式支持ER应激驱动的浆细胞产生IL-6是iMCD-IPL的一个关键特征这一假设。下载：下载文件（378KB）下载：下载全尺寸图像 图7. 特发性多中心卡斯特曼病-特发性浆细胞性淋巴结病的发病机制和基因表达。特发性多中心卡斯特曼病-特发性浆细胞性淋巴结病的病理假设基于免疫组化、原位杂交和基因表达分析的结果。一个未知的触发因素增强了B细胞向浆细胞的分化并导致浆细胞增殖。在此模型中，浆细胞产生免疫球蛋白，导致内质网（ER）扩张。因此，ER应激相关基因上调，XBP1可能持续激活，从而参与浆细胞的IL-6自分泌产生。免疫球蛋白的产生可能上调MZB1并加剧ER应激。IL-6：白细胞介素-6；IL-6R：白细胞介素-6受体。从临床角度来看，这些发现强调了在iMCD中需要针对亚型进行个性化治疗。IL-6阻断仍是首选治疗方法，其重要性在iMCD-IPL中尤为明显，早期抗IL-6治疗可以中断XBP1驱动的自分泌IL-6循环和浆细胞增殖。然而，对于那些在IL-6阻断后复发或对其耐药的患者，目前还没有标准的治疗方案。8,46 利妥昔单抗是一种抗CD20 B细胞疗法，在美国被批准用于iMCD；然而，证据水平受到数据回顾性质和样本量较小的限制。46 鉴于XBP1在iMCD-IPL中的潜在关键作用，进一步的研究应探索先进的分子谱分析（如蛋白质组学或基因表达谱分析）是否可以指导二线治疗决策或预测对新靶向治疗的反应。本研究有一些局限性。首先，由于淋巴结标本的有限可用性，原位杂交染色的结果是定性的而非定量的。其次，由于批量基因表达分析的性质，我们无法确定表达每个基因的细胞。单细胞基因表达分析可能有助于识别iMCD-IPL中上调基因的细胞，包括XBP1和MZB1。未来需要更多的实验来研究XBP1抑制是否可以抑制IL-6的产生。第三，本研究尚未明确IL-6在血管内皮细胞中的作用机制。IL-6具有转信号传导和经典信号传导两条途径，它们的效果不同。由于已有报道指出血管内皮细胞中的转信号传导可以放大炎症反应，IL-6的转信号传导也可能参与iMCD-TAFRO。为了澄清这一点，需要未来的单细胞分析。总之，我们的研究阐明了iMCD亚型中不同的IL-6产生细胞和假设的调节机制，其中XBP1可能在iMCD-IPL的IL-6过度产生中起关键作用。未来的研究有助于阐明ER应激和IL-6及IL-6R在每种iMCD亚型中的作用。这些见解可能有助于我们更好地理解iMCD的发病机制，并突出潜在的分子靶点，以开发针对特定亚型的精准治疗。数据共享声明 本研究的支持数据可从通讯作者处获得。