Menin抑制剂DS-1594b与venetoclax联合使用可促进急性髓系白血病细胞的分化，并在含有混合谱系白血病基因重排及nucleophosmin-1突变的部分细胞中发挥协同杀伤作用

《Haematologica》：Menin inhibitor DS-1594b drives differentiation and induces synergistic lethality in combination with venetoclax in acute myeloid leukemia cells with rearranged mixed-lineage leukemia and mutated nucleophosmin-1

　　瓦莱里奥·乔罗 | 瓦西琳娜·沙兰杰娃 | 安娜·斯夸尔斯卡 | 凯瑟琳·查赫鲁尔 | 娜塔莉亚·巴拉恩 | 曾志红 | 卡桑德拉·拉格姆吉 | 纳瓦尔·达维尔 | 宾格·Z·卡特 | 索维拉·昌德里 | 帕拉尼拉贾·坦达帕尼 | 玛丽亚·保罗拉·马尔泰利 | 托马斯·A·米尔恩 | 马丽娜·科诺普列娃
美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心血液生成生物学与恶性肿瘤系，休斯顿，德克萨斯州

混合谱系白血病（MLL）的重排（MLLr）和核仁磷酸蛋白-1（NPM1）突变与急性白血病相关，其发病机制受到menin和MLL之间蛋白质-蛋白质相互作用的显著影响。我们假设使用DS-1594b针对menin-MLL相互作用，并通过venetoclax阻断抗凋亡蛋白BCL-2，可能会促进分化并增强对MLLr和NPM1突变白血病模型的清除效果。我们分别用venetoclax单独、DS-1594b单独或两者联合治疗具有MLLr、NPM1突变的急性髓系白血病（AML）细胞系以及来自AML患者的原代样本。我们通过多种细胞检测方法、Western blotting和BH3蛋白谱分析来测量增殖、活力、凋亡和分化情况。DS-1594b和venetoclax联合使用表现出显著的协同效应，增强了多个细胞系的分化并抑制了增殖。在NPM1突变的AML患者来源的异种移植模型中，DS-1594b单药治疗显著延长了生存期。重要的是，与DS-1594b单药治疗相比，DS-1594b和venetoclax联合使用更显著地减少了白血病负担并延长了小鼠的生存时间。menin的抑制是该模型中转录变化的主要驱动因素，并影响了抗凋亡调节因子的表达，这为这两种药物之间的协同作用提供了机制解释。总体而言，我们在体外和体内观察到他们在诱导分化和抑制增殖方面的协同效果。我们的研究共同强调了这种联合策略作为改善具有这些特定基因组改变患者治疗效果的新治疗方法的前景。

**引言**
急性白血病是一组异质性的侵袭性血液癌症，其特征是骨髓中未成熟白细胞的快速增殖。其中，混合谱系白血病（MLL，KMT2A）的重排（MLLr）和核仁磷酸蛋白1（NPM1）突变代表了两种不同的亚型，每种亚型都带来了重大的临床挑战。MLLr是儿童血液系统恶性肿瘤中的常见遗传异常，在80%的婴儿急性淋巴细胞白血病患者中可见。然而，在成人急性髓系白血病（AML）中，它们的发生率仅为5%至10%。这些重排源于涉及MLL基因的易位，产生的融合蛋白增强了增殖、阻断了分化并推动了侵袭性白血病的发展。不幸的是，MLLr白血病对传统治疗方法具有高度抗性，导致新诊断患者的5年生存率仅为35%，而复发性/难治性（R/R）AML患者的生存率更低，低于10%。相比之下，NPM1突变是成人AML中最常见的改变之一，在约30%的病例中存在。NPM1基因编码一种核仁磷酸蛋白，参与多种细胞过程，包括核糖体生物合成和中心体复制。NPM1突变会导致异常的细胞质定位，破坏正常功能并通过HOX基因激活促进白血病的发展。尽管没有FLT3内部串联重复（ITD）突变的NPM1突变AML通常预后较好，但它仍然是复发性/难治性和老年患者的临床难题。
Menin由MEN1编码，是一种通过其与染色质修饰复合物的相互作用来调节基因表达的支架蛋白，在各种细胞过程中起关键作用。Menin最初被确定为与多发性内分泌瘤1型（一种遗传性肿瘤综合征）相关的MEN1基因的产物。多项研究揭示了menin、MLL和MLL融合蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用在MLLr白血病发病机制中的关键作用。同样，突变的NPM1也与MLL复合物相互作用，调节NPM1突变AML中的致癌特征。因此，使用其他menin抑制剂针对menin-MLL相互作用已成为MLLr和NPM1突变AML临床前和临床研究中的一种有前景的治疗策略。值得注意的是，首个menin抑制剂revumenib最近获得了美国食品药品监督管理局的批准，用于治疗具有KMT2A易位的R/R急性白血病，标志着治疗这些复杂白血病的一个重要里程碑。menin抑制剂的抗性机制可能包括出现特定的点突变，从而破坏药物结合，但新的证据表明不同抑制剂可能对耐药性发展的不同途径具有独特的影响。因此，扩展不同结构menin抑制剂的临床前数据对于完善治疗方法至关重要。

在这里，我们研究了新型menin-MLL抑制剂DS-1594b与venetoclax（一种选择性的抗凋亡BCL2蛋白抑制剂）联合使用的临床前潜力。Venetoclax在AML中表现出有希望的活性，使其成为靶向治疗的理想伴侣。我们和其他研究者已经证明，具有t(4;11) MLL易位的急性淋巴细胞白血病细胞表达高水平的BCL2，并对venetoclax高度敏感，因为由此产生的MLL/AF4融合蛋白通过增加其位点上的H3K79me2/3上调BCL2。我们假设使用DS-1594b与venetoclax联合可以促进细胞分化并提高急性白血病的杀伤力，特别是在MLLr和NPM1突变的AML中。为了验证这一假设，我们使用了携带MLLr或NPM1突变的细胞系以及NPM1突变急性白血病的患者来源异种移植（PDX）模型来评估DS-1594b和venetoclax对白血病细胞活力、凋亡诱导和分化潜力的协同效应。通过临床前评估这种药物组合，我们的研究旨在为具有NPM1突变和MLLr的急性白血病提供靶向治疗策略的见解，可能为这些高风险患者提供新的治疗选择。

**方法**
我们从DSMZ和佩鲁贾大学获得了具有MLLr（OCI-AML2、MOLM-13、MOLM-14、MV4-11、MOLM-13 ven-res）、NPM1突变（OCI-AML3、IMS-M2）以及没有这些改变的细胞系（U937、HL60）。细胞和患者样本（每个孔2,000-150,000个）分别用DS-1594b（0-10 μM，5-10天；Daiichi Sankyo21）和/或venetoclax（0-500 nM，5天；LC Laboratories22）处理，其中MV4-11细胞因高敏感性而处理3天。该研究获得了德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构审查委员会批准（方案LAB-01-473），并遵循《赫尔辛基宣言》进行；所有参与者均获得了书面知情同意。

**增殖、活力、凋亡和分化检测**
细胞增殖通过CellTiter-Glo发光细胞活力检测（Promega）测量ATP来测定。每种处理对存活细胞和凋亡细胞数量的影响通过流式细胞术和Annexin-V-DAPI检测进行评估。为了评估分化，细胞用CD14、CD15、CD11b、CD45和CD33抗体（BD Biosciences）染色，并用流式细胞术进行分析。

**Western blotting**
免疫印迹按照Baran等人的方法进行（在线补充附录）。使用的抗体列表见在线补充表格S1。

**BH3蛋白谱分析**
BH3蛋白谱分析按照先前的方法进行（在线补充附录）。

**急性髓系白血病异种移植小鼠研究**
40只雌性NSG小鼠（8-10周龄；Jackson Laboratory，NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rgtm1Wjl/SzJ）通过尾静脉接种3×10^6个NPM1m PDX/luc/GFP细胞（100 μL）。在通过生物发光确认白血病移植后，小鼠（每组10只）被随机分配到对照组、venetoclax组、DS-1594b组或联合组。DS-1594b以50 mg/kg剂量口服给药4周，从注射后12天开始；venetoclax以50 mg/kg剂量口服给药2周，然后以100 mg/kg剂量口服，持续28天的周期。每周称重小鼠，并根据IACUC指南在实验结束时处死。脾脏PDX细胞进行条形码标记，并用金属结合抗体进行高维细胞术（CyTOF）分析。每隔7-10天使用IVIS Lumina LT系统获取生物发光图像。

**图1. DS-1594b单独使用可促进MLL重排和NPM1突变细胞系的分化。**
(A) 通过用DS-1594b单独处理具有MLL重排（OCI-AML2、MOLM-13、MOLM-14、MV4-11、MOLM-13 ven-res）和NPM1突变（OCI-AML3和IMS-M2）的细胞系以及阴性对照（U937和HL60）细胞系（浓度在0.0001 μM至9 μM之间，持续7天）来测定增殖情况。剂量-反应曲线通过基于非线性回归的曲线拟合程序分析，计算半最大抑制浓度（IC50）值。
(B) 细胞用载体（0.2%二甲基亚砜[DMSO]或0.1、1或10 μM（或0.01、0.1和1 μM）DS-1594b处理5天。使用CD11b标记通过流式细胞术确定分化效应。进行双向ANOVA以确定统计显著性（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001）。
(C) 7天后通过流式细胞术、计数珠子和Annexin-V及DAPI确定凋亡细胞。进行双向ANOVA以确定统计显著性（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001）。
(D) OCI-AML3、HL60、OCI-AML2和IMS-M2细胞用指定浓度的DS-1594b处理5或7天。之后准备总细胞裂解物，进行BCA蛋白测定，并加载30 μg蛋白进行Western blot分析。裂解物中的β-actin表达水平作为加载对照。N/A：不适用。

**RNA测序分析**
使用FastQC30检查FastQ文件的质量，并使用Trim Galore!参数（--2colour 20）修剪读取序列。然后使用STAR将修剪后的读取序列映射到hg38参考基因组。使用featureCounts量化基因表达。使用DESeq233进行差异基因分析。使用RUVSeq进行批次校正。使用ClusterProfiler进行基于生物过程术语的基因本体富集分析。

**结果**
**DS-1594b单独使用可促进MLL重排和NPM1突变细胞系的分化**
首先，我们评估了DS-1594b在7天治疗后天MLLr（MOLM-13、MOLM-14、MV4-11）和NPM1突变（OCI-AML3、IMS-M2）细胞系活力的影响。我们的发现表明，低浓度的DS-1594b显著降低了这些细胞系的增殖，而对非MLLr/非NPM1突变的U937和HL60细胞没有影响（图1A）。鉴于AML中venetoclax抗性的普遍性，我们生成了venetoclax抗性的AML细胞系（ven-res）来评估menin抑制是否可以提供另一种治疗选择。为此，我们将MOLM-13、OCI-AML2和MV4-11细胞暴露于逐渐增加的venetoclax浓度下，从10 nM开始，逐渐增加到1 μM（见在线补充附录）。值得注意的是，ven-res MOLM-13细胞系以及其他两种ven-res细胞系OCI-AML2和MV4-11都对DS-1594b有不同反应。MOLM-13 ven-res对治疗敏感，而OCI-AML2和MV4-11 ven-res则没有反应（图1A；在线补充图S1A）。鉴于已知menin抑制剂诱导细胞分化的作用，我们通过流式细胞术检查分化标志物（CD11b、CD14、CD15）来评估DS-1594b是否单独诱导了测试的AML细胞系的分化。我们的结果显示，OCI-AML3、OCI-AML2、MOLM-13 ven-res和MOLM-14细胞系在5天后开始显示出分化效果（图1B），并在10天治疗后效果更加明显（在线补充图S1B）。值得注意的是，只有MOLM-14细胞系中表达了中性粒细胞特有的分化标志物CD15，而CD14仅在CD11b表达后表达（在线补充图S1C、D）。即使在较高剂量的DS-1594下，非NPM1/非MLLr细胞系如U937或HL60也未观察到分化。此外，DS-1594b处理在7天后诱导了OCI-AML2、OCI-AML3和MV4-11细胞的凋亡（图1C）。值得注意的是，在10天治疗后，MOLM-13和MOLM-13 ven-res细胞系中也观察到了凋亡（在线补充图S1E）。使用DS-1594b处理5天后进行的Western blot分析显示所有白血病细胞系中的menin蛋白水平降低，OCI-AML3和OCI-AML2中的BCL-2表达减少，OCI-AML2细胞中的细胞周期抑制剂p27水平也降低（图1D）。有趣的是，在OCI-AML3中MCL-1表达上调，而其他细胞系中没有。此外，在OCI-AML2和OCI-AML3中观察到CD11b的上调，这与流式细胞术分析的结果一致。接下来，使用动态BH3蛋白谱分析，我们测试了menin抑制是否增强了细胞对BCL2家族成员的依赖性（见在线补充附录）。将MV4-11细胞预先用DS-1594b处理，然后暴露于不同的BH3模拟肽，并通过流式细胞术监测24小时后细胞质色素c的释放来测量线粒体外膜通透性。我们观察到，在两种细胞系中，抑制menin都能增加细胞对泛激活剂和敏化剂hBIM、hBID-Y、PUMA和Bmf-Y肽的响应（在线补充图S2A，B），而只有OCI-AML3细胞还增加了对MCL-1靶向mNoxaA和MS1肽的响应。这种模式表明，在MV4-11细胞中，DS-1594b增强了细胞对BCL-2的依赖性，而在OCI-AML3细胞中，该药物还增加了细胞对抗凋亡蛋白MCL-1的依赖性以维持生存。下载：下载文件（481KB）下载：下载全尺寸图像

图2. DS-1594b与venetoclax联合使用在表达MLL重排或NPM1突变的急性髓系白血病细胞中表现出协同的体外杀伤效果。(A) 通过将MLL重排（OCI-AML2、MOLM-13、MOLM-14、MV4-11、MOLM-13 venetoclax耐药）和NPM1突变（OCI-AML3和IMS-M2）细胞以及阴性对照细胞系（U937和HL60）分别单独或以固定比例联合使用DS-1594b（DS）、venetoclax（Ven）处理5天来进行增殖实验。MV4-11细胞处理了3天。基于Chou-Talalay方法的组合指数（CI）由CalcuSyn软件（版本2.0）确定。(B) 通过将细胞处理5天（MV4-11处理3天）来检测凋亡，然后使用计数珠、Annexin-V和DAPI通过流式细胞术测定凋亡细胞。进行双向ANOVA以确定二甲基亚砜（DMSO）和联合治疗之间的统计显著性（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001）。(C) OCI-AML2、OCI-AML3、IMS-M2、MV4-11和U937细胞分别用指定浓度的DS-1594b和venetoclax处理3天或5天。之后，准备总细胞裂解物，进行BCA蛋白测定，并加载30 μg蛋白质用于Western blot分析。裂解物中β-actin的表达水平作为加载对照。

总体而言，我们的结果表明DS-1594b可以诱导AML细胞分化，这与文献中报道的其他menin抑制剂的效果一致，同时也能阻断细胞增殖。此外，我们观察到在长期治疗（7-10天）后，几种细胞系中出现了显著的凋亡。重要的是，menin的抑制使AML细胞更依赖于BCL-2来维持生存。DS-1594b与venetoclax的联合使用在表达MLL重排或NPM1突变的急性髓系白血病细胞中表现出协同的体外杀伤效果。

我们在menin抑制后观察到AML细胞对BCL-2的依赖性增加，这使我们探索了使用临床常用的venetoclax靶向BCL-2是否可以增强DS-1594b在表达NPM1突变蛋白或MLL融合蛋白的细胞中的抗AML效果。为此，我们测试了在之前描述的相同的MLLr和NPM1突变细胞系中使用DS-1594b和venetoclax联合治疗的疗效。这些联合实验按照5天的治疗计划进行（MV4-11处理3天），以捕捉全面的药物反应和潜在的协同效应，特别是考虑到Menin抑制剂在AML中通常观察到的延迟活性。联合治疗显著减少了所有MLLr和NPM1突变细胞的增殖，而对照组细胞（HL60、U937）未受影响（图2A）。值得注意的是，MV4-11细胞在仅处理3天后就显示出显著的抑制效果（组合指数[CI]=0.07），表明其对药物组合具有高度敏感性，MOLM-13和MOLM-14细胞在处理5天后也表现出类似效果（CI分别为0.25和0.16）。此外，NPM1突变的IMS-M2细胞仅在联合治疗时显示出抑制效果，而在单独使用任一药物时则没有（CI=0.005）。此外，Bliss协同评分分析显示MOLM-14细胞中的联合治疗具有协同效应，但在U937细胞中则没有（在线补充图S2C），证实了这两种药物在MLLr AML细胞系中的效果。接下来，我们使用流式细胞术中的Annexin-V和Western blot分析来评估联合治疗对凋亡的影响。除了阴性对照U937外，所有测试的细胞系在联合治疗后都发生了凋亡（在线补充图S3A）。值得注意的是，在OCI-AML2细胞中，联合治疗的效力主要由venetoclax驱动。此外，Western blot分析（图2B）显示PARP-C水平升高，caspase-3总水平降低，这些都是已知的凋亡标志物。OCI-AML3细胞中的CD11b上调，而所有细胞系中的menin下调。OCI-AML3细胞在联合治疗3天后仍表达MCL-1，这与BH3分析显示的增强分化一致，但在5天后由于细胞状态的变化而减少。此外，除了U937对照组外，所有细胞系中的P27都下调。这些结果与单独使用DS-1594b时的观察结果相反。

这些发现共同证实，DS-1594b与venetoclax的联合治疗有效抑制了MLLr和NPM1突变细胞的增殖并诱导了凋亡，这是通过激活PARP-c和caspase-3-c途径实现的。

接下来，我们研究了DS-1594b与venetoclax联合治疗在携带MLL重排或NPM1突变的原发性AML患者样本中的分化作用和杀伤效果。我们的发现提供了证据，表明联合治疗在六个测试的患者样本中有四个样本中表现出中度协同效应（图3A；在线补充图S4A）。重要的是，在这些样本中，五个具有MLLr的患者样本中有三个样本的生存抑制表现出协同效应，表明对menin/BCL-2抑制有良好的反应。然而，来自患者3（PT3）的样本对menin抑制表现出耐药性。此外，在具有NPM1突变的PT6患者样本中，双重联合治疗表现出轻微的协同效应（图3A；在线补充图S4A）。相反，单独使用DS-1594b显著促进了AML细胞的分化，特别是在PT2和PT6中（图3B），而在其他单独使用DS-1594b治疗的样本中效果较弱。

总体而言，我们的结果表明，menin抑制剂与venetoclax的联合治疗可能是治疗携带MLLr或NPM1突变的AML患者的一种有前景的策略。此外，我们的发现还强调了使用DS-1594b作为单一药物促进AML细胞分化的潜力。

在观察到DS-1594b与venetoclax在体外对具有MLLr或NPM1突变的AML细胞具有中等协同效应后，接下来我们使用移植了NPM1突变AML细胞的NSG小鼠模型，在体内评估了这种联合治疗的抗白血病效果。我们以耐受良好的剂量单独和联合使用DS-1954b和venetoclax进行了测试。我们发现，联合治疗4周后AML负担的减少程度大于单独使用任一药物或使用溶剂对照。生物发光成像证实了联合治疗的疗效（图4A，B）。重要的是，联合组的小鼠体重没有显著变化，表明其耐受性良好，而venetoclax组和对照组的小鼠体重显著减轻（图4C）。有趣的是，DS-1594b组和联合组之间的体重没有差异。此外，联合组和单独使用DS-1594b组的脾脏重量也减少，表明治疗组中AML的进展受到显著抑制（图4D；在线补充图S5A）。骨髓移植情况没有明显差异（在线补充图S5B）。生存曲线清楚地显示了联合治疗的益处，其中DS-1594b组有一定效果，但联合组的效果最为显著（图4E）。值得注意的是，这种PDX模型似乎对venetoclax具有耐药性，这从生存曲线和生物发光图像中可以看出。

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图3. 联合治疗促进了携带MLL重排或NPM1突变的原发性急性髓系白血病患者样本的分化并显示出增强的杀伤效果。(A) 携带MLL重排（MLLr）或NPM1突变的患者细胞用指定浓度的DS-1594b和venetoclax处理3天。通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定法测量存活细胞数量。(B) 四名患者的细胞用溶剂（0.2%二甲基亚砜[DMSO]或0.1或1 μM DS-1594b处理5至7天。通过使用CD11b标记物进行流式细胞术来确定分化效果。由于患者细胞数量有限，因此每个实验只进行了一次。

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图4. DS-1594b与venetoclax联合治疗在NPM1突变患者来源的异种移植物中的体内疗效。(A) 肿瘤负担的生物发光成像。小鼠通过尾静脉接种NPM1m PDX/luc/GFP；每只小鼠3.0×10^6细胞/100 μL。一旦通过生物发光成像确认白血病移植（第0天），将小鼠（N=10/组）随机分为4个治疗组：仅使用溶剂；仅使用venetoclax（Ven）；同时使用venetoclax和DS-1594b（Combo）。在0天、10天、18天和25天使用IVIS Lumina LT体内成像系统进行生物发光成像。(B) 每7至10天根据生物发光数据计算小鼠的总通量辐射。进行双向ANOVA以确定显著性（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001； ****P<0.0001）。(C) 在第10天、17天和23天测量体重。进行双向ANOVA以确定显著性（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001）。(D) 记录从每个治疗组随机选择的3只小鼠的脾脏重量。进行双向ANOVA以确定显著性（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001）。(E) 根据治疗组绘制小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（N=10/组）。治疗从第12天开始，持续到第40天。venetoclax以50 mg/kg剂量给药2周（2w），之后以100 mg/kg剂量给药2周；DS-1594b（DS）以50 mg/kg剂量给药4周。使用Kaplan-Meier方法估计总体生存率，并使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验评估组间差异（***P<0.001；****P<0.0001）。

接下来，我们测试了添加venetoclax是否进一步增强了与单独抑制menin相比的白血病分化效果。为此，我们使用全面的表面和细胞内标记物面板通过CyTOF分析了联合治疗对多个途径中蛋白质表达的变化，特别关注与髓系和单核细胞分化相关的标记物（图5A）。这种方法使我们能够详细表征体内治疗后的白血病细胞表型。对于这项分析，我们用针对分化标记物和白血病标记物的抗人类抗体对PDX脾脏中的细胞进行染色（在线补充表S2）。我们发现，单一使用DS-1594b以及联合治疗都导致了一组细胞（pop1）的出现，这些细胞中CD33、CD13和CD44的表达升高，这些是髓系细胞分化的已知标记物（图5B，C；在线补充图S5C）。重要的是，与单独使用DS-1594b相比，联合治疗中的这一细胞群体没有显著增加，这表明AML细胞的分化主要是由DS-1594b驱动的。

为了更好地理解联合venetoclax/menin治疗的分子机制，我们对携带NPM1c、DNMT3A和FLT3-ITD突变的PDX脾脏细胞进行了RNA测序，这些细胞在体内接受了4周的治疗。比较单独和联合治疗，大多数基因表达的变化是由DS-1594b介导的menin抑制引起的，联合治疗引起的额外基因表达变化很少（图6A）。经典的menin靶标，如MEIS1、FLT3和HOXA9的表达减少（在线补充图S5D）。Cluster 1和4基因（在DS-1594b和联合治疗中表达减少）与DNA复制、细胞分裂和RNA处理相关，而Cluster 5基因（在venetoclax和联合治疗中表达减少）与干扰素反应和病毒反应相关（在线补充图S5E）。有趣的是，有一小部分基因在联合治疗中进一步下调或上调，而在单独抑制menin时则没有（图6B，簇3和4）。基于此，我们假设menin抑制可能会驱动抗凋亡因子的下调，而这可能通过venetoclax的联合治疗得到进一步增强。为了探索这种可能性，我们关注了关键的抗凋亡基因，发现DS-1594b抑制了MCL-1的表达（图6C）。重要的是，这种效应在联合治疗中显著增强。鉴于MCL-1的上调是导致AML对venetoclax耐药性的一个明确因素，44这种治疗效果对MCL-1水平的显著影响可能解释了在测试的PDX模型中观察到的联合治疗的协同作用。我们在NPM1突变细胞系OCI-AML3和MLL-AF4细胞系MV4-11中进行了额外的RNA测序，同样观察到menin的抑制作用无论是单独使用还是与venetoclax联合使用，都能驱动大部分转录变化（在线补充图S6A、B），包括已知的menin靶基因的下调（在线补充图S6C、D）以及特定的抗凋亡基因。我们发现OCI-AML3细胞（在线补充图S6E）在menin抑制和联合治疗下特异性地下调了BCL2。MV4-11细胞（在线补充图S6F）在Menin抑制剂和联合治疗下BCL2和BCL2L10表现出统计学上的显著下调，同时BCL2L12和MCL1也有轻微（但不显著）的下降。这表明menin抑制影响的特定抗凋亡基因可能取决于AML的类型。Chromatin免疫沉淀测序（ChIP-seq）显示Menin直接结合到我们的两个PDX模型、NPM1突变AML的原发性患者细胞以及细胞系中的某些抗凋亡基因上（在线补充图S6G），MV4-11的数据来自公开可用的GEO数据集GSE196036），这表明这些基因直接受到menin结合的调控。

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图5. DS-1594b在患者来源的异种移植物模型中促进分化。（A）每个治疗组从3只小鼠的脾脏中收集患者来源的异种移植物（PDX）细胞，经过4周治疗后。然后对这些细胞进行飞行时间细胞术（CyTOF）分析。使用t分布随机邻域嵌入方法进行降维处理。处理后的数据经过负值修剪的反双曲正弦变换，并根据在线补充表S2中列出的所有细胞表面标记，基于PhenoGraph算法（k=22）进行聚类。X轴和Y轴分别代表第一和第二t-SNE维度（tSNE_1和tSNE_2），反映了单个细胞之间表面标记表达的相似性。（B）不同组治疗中pop1群体事件的百分比P值。（C）每个群体簇内每种蛋白质的表达水平。CD44、CD33、CD13分化标记被突出显示。NS：不显著；(*P<0.05；**P<0.01）；Combo：venetoclax/DS-1594b组合。

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图6. Menin抑制通过转录机制增强venetoclax的治疗效果。（A）不同表达基因（调整后的P值[P-adj] <0.05）的热图，这些细胞来自用载体对照（Veh）、venetoclax、menin抑制剂（MENi）或组合（Combo）治疗4周的小鼠来源的PDX衍生的脾脏白血病细胞。（B）箱线图表示用Veh、venetoclax、MENi或Combo治疗的PDX衍生脾脏白血病细胞中差异表达基因的表达模式（z评分）。（C）用Veh、venetoclax、MENi或Combo治疗的小鼠来源的PDX衍生脾脏白血病细胞中抗凋亡因子的表达水平（CPM）。统计显著性通过单因素ANOVA后跟Tukey的事后检验确定。显著性水平如下表示：***P adj <1×10?3；**P adj <1×10?2；*P adj <5×10?2；NS，不显著（P adj >5×10?2）。（D）与Veh对照相比，用venetoclax治疗的PDX衍生脾脏白血病细胞的RNA测序。标记了调整后P值最低的基因。（E）GO:BP富集分析显示venetoclax治疗下调的基因。

尽管menin抑制似乎驱动了联合治疗中的大部分转录变化，我们仍然想要确定是否有任何基因表达变化是由venetoclax单独引起的。为了更好地澄清menin单独使用、venetoclax单独使用以及联合使用之间的差异，我们比较了每对组合中的差异表达基因：venetoclax与载体、DS-1954b与载体、组合与载体（在线补充图S7A）。差异表达基因的最大重叠是在menin抑制和联合治疗下调的基因之间。在仅用联合治疗而非menin抑制下调的基因中，只有五个基因也仅用venetoclax下调，表明将venetoclax添加到DS-1954b中引起了这些变化。在载体与venetoclax治疗的细胞之间进行成对比较时，有76个基因下调，73个基因上调（图6D）。对venetoclax治疗下调的基因进行基因ontology（GO）富集分析显示，这些基因与凋亡相关，尽管这种调控可能是间接的（图6E），因为venetoclax主要作为BCL-2抑制剂起作用，而不是直接影响基因转录。这些数据表明，venetoclax和menin抑制剂通过不同的机制发挥作用，menin抑制主要影响转录程序，而两种药物的协同作用是通过调节抗凋亡途径实现的。总体而言，我们的发现支持将DS-1594b和venetoclax联合使用作为一种具有强烈抗白血病活性的有希望的治疗策略，适用于具有MLLr和NPM1突变的患者。

讨论
在这项研究中，我们探讨了将menin抑制剂DS-1594b与BCL-2拮抗剂venetoclax联合用于AML的潜力。我们评估了其在携带MLLr或NPM1突变的AML细胞系和原发性患者样本中促进分化和增强杀伤力的能力。此外，我们使用PDX小鼠模型评估了这种联合治疗的体内效果。总体而言，DS-1594b单独使用在体外和体内主要抑制了细胞生长并促进了分化。而且，当与venetoclax联合使用时，它在AML细胞系和NPM1突变AML的PDX小鼠模型中有效地诱导了细胞凋亡，为急性白血病患者提供了一种有前景的治疗方法。这些结果与先前的研究一致，这些研究表明venetoclax与其他menin抑制剂联合使用时具有协同的抗白血病效果。45,46 menin和BCL-2家族成员的表达减少，以及凋亡途径的激活，突出了观察到的效果的潜在机制。值得注意的是，MV4-11和MOLM-13细胞系对DS-1594b和venetoclax的治疗表现出更高的敏感性，强调了这种组合在具有FLT3-ITD突变的AML亚型中的治疗潜力。我们的研究扩展到了携带MLLr或NPM1突变的原发性AML患者样本。令人鼓舞的是，联合治疗在大多数测试样本中协同抑制了细胞增殖，尤其是在具有MLLr的样本中。这些结果强调了DS-1594b和venetoclax联合治疗的潜在临床意义。然而，我们也观察到某些患者样本没有反应，这表明需要进一步研究潜在的耐药机制，并强调了开发克服耐药性的策略以获得更有效的治疗结果的重要性。47我们使用PDX小鼠模型的体内研究证实了我们的体外发现，因为接受DS-1594b和venetoclax治疗的小鼠的AML负担显著减少，与仅接受单一药物或载体对照的小鼠相比。重要的是，联合治疗没有对小鼠体重产生不利影响，表明该方案耐受性良好。

RNA测序分析显示，虽然大多数基因表达差异是由menin抑制剂驱动的，但只有少量的基因在联合治疗时表现出进一步的调节。具体来说，我们在PDX模型中观察到抗凋亡基因MCL-1的显著下调，以及在抗凋亡因子位点直接结合menin，这表明两种治疗之间的协同作用具有额外的互补机制。此外，我们的CyTOF分析显示DS-1594b单独使用和联合治疗组的分化标记表达增加。48这一发现支持DS-1594b和venetoclax联合治疗可能对体内白血病细胞的分化产生积极影响。在体外和体内观察到的分化和凋亡的协同效应具有重要的临床意义。然而，尽管研究在部分患者样本中显示出疗效，但在某些情况下观察到的耐药性突显了AML克隆的异质性和找到普遍有效治疗的复杂性，特别是在疾病复发/难治期治疗的患者中。这些发现特别相关，因为最近的早期临床试验数据表明menin抑制剂/venetoclax组合在R/R设置中显示出有希望的效果49，并且在R/R和较老的一线AML患者中，阿扎胞苷/venetoclax和menin抑制剂的三联组合显示出高响应率。50因此，需要进一步的研究来探索这种协同作用的机制基础，并确定患者反应和耐药性的潜在生物标志物。总之，这些结果强调了DS-1594b和venetoclax作为靶向联合治疗的潜力，为具有MLLr和NPM1突变的AML患者提供了一种有希望的新方法，以特异性对抗生存和分化障碍，为这一患者群体制定了更加个性化和有效的治疗方案。

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