内皮细胞中miR-126的缺失会促进与年龄相关的造血功能衰退

《Haematologica》：Loss of endothelial miR-126 drives age-related decline in hematopoiesis

　　赵丹丹 | 阮乐轩 | 郭旭波 | 陈芳 | 赵小丽 | 陈敏轩 | 马库奇·圭多 | 张斌
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城国家医疗中心Gehr家族白血病研究实验室血液系统恶性肿瘤转化科学系及贝克曼研究所

衰老会显著改变骨髓（BM）的微环境，并损害造血干细胞（HSC）的功能。在这里，我们发现动脉内皮细胞（EC）产生的miR-126水平下降是导致HSC自我更新能力受损的关键机制。在年轻的BM中，动脉内皮细胞表达高水平的miR-126，这种miR-126传递给HSC，支持其稳态和功能完整性。通过使用年轻的和衰老的野生型内皮细胞特异性miR-126敲除（EC-miR-126 KO）小鼠、EC-Spred1敲除小鼠（一种EC-miR-126过表达的功能模型）以及EC/Sca-1双重荧光报告基因小鼠，我们发现与年龄相关的炎症细胞因子（如TNFα）增加会降低EC中的miR-126表达，进而导致衰老BM微环境中miR-126高表达的CD31+Sca-1高表达动脉内皮细胞减少。动脉内皮细胞的减少又进一步减少了向HSC提供的miR-126，导致HSC扩增但自我更新能力受限。值得注意的是，给予合成的miR-126模拟寡核苷酸可以恢复EC与HSC之间的通讯，并缓解与年龄相关的HSC功能障碍。我们的发现揭示了一种新的、非细胞自主性的HSC衰老机制，并强调了EC来源的miR-126作为恢复造血功能的有希望的治疗靶点。

**引言**
成年人的造血功能由驻留在骨髓（BM）中的造血干细胞（HSC）维持。这些原始细胞具有自我更新、扩增和分化能力。尽管HSC在形态和免疫表型上相似，但越来越多的证据表明它们在功能上是异质性的，包含具有不同谱系偏向的转录组特征。这些子集最终会产生定向分化的前体细胞，进而分化为成熟的血液和免疫细胞。

衰老的造血系统表现为髓系生成增加、适应性免疫功能下降以及HSC功能衰退，尽管其频率比年轻时更高。HSC功能的衰退表现为再生潜力降低、归巢能力受损、细胞极性丧失以及向髓系分化的偏向，从而削弱了淋巴系生成。导致这些与年龄相关变化的机制尚未完全明了，但可能涉及多种因素，包括DNA损伤、线粒体功能障碍、炎症、复制应激反应的失调、DNA修复通路的紊乱以及代谢过程的改变等。

造血干细胞位于一个称为“HSC微龛”的特殊BM微环境中，该微环境由各种基质细胞类型组成，包括内皮细胞（EC）、间充质基质细胞（MSC）、成骨细胞和细胞外基质成分；这些成分共同调节HSC的功能和稳态。随着年龄的增长，HSC的功能可能会因内在细胞过程的改变（例如从年轻HSC的糖酵解代谢向衰老HSC的氧化代谢转变）以及HSC微龛中其他成分的变化而退化。这些变化可能导致HSC功能下降，包括自我更新能力减弱、分化能力受损以及恶性转化的风险增加。值得注意的是，将衰老的HSC移植到年轻的受体中，其髓系生成能力会降低，这表明衰老的BM微环境会偏向髓系分化。

**方法**
除非另有说明，2-3个月大的C57Bl/6J（B6, CD45.2）小鼠和18-24个月大的C57Bl/6J小鼠分别被归类为年轻和衰老小鼠。Tie2-CreER/TdTomato/Tg(Ly6a-GFP)双荧光报告基因小鼠用于可视化CD31+Sca 1高表达（tdTomato+GFPhigh）和CD31+Sca 1低表达（tdTomato+GFPlow）的血管内皮细胞。Mir126floxf/f fTie2-cre+（即EC-miR-126敲除[KO]）和Spred1f/f Tie2-cre+（EC-Spred1 KO，代表EC-miR-126过表达[OE]的功能模型）小鼠被用于研究EC中的miR-126敲除或过表达情况。为了获得条件性EC-miR-126敲除报告基因小鼠，我们还将Tie2-CreER/ TdTomato报告基因小鼠与Mir126f/f小鼠杂交，获得了诱导性EC-miR-126敲除报告基因小鼠（即Mir126f/f/Tie2-CreER/TdTomato，在他莫昔芬作用下EC中miR-126敲除）。小鼠的饲养和实验程序均遵循联邦指南和协议，且获得了希望之城机构动物护理和使用委员会的批准（协议号IACUC 15005）。

**实验步骤**
- **小鼠品系**：
- 除非另有说明，2-3个月大和18-24个月大的C57Bl/6J（B6, CD45.2）小鼠分别被归类为年轻和衰老小鼠。
- **内皮细胞miR-126表达**：
Mir126floxf/f fTie2-cre+（即EC-miR-126敲除[KO]）和Spred1f/f Tie2-cre+（EC-Spred1 KO，代表EC-miR-126过表达[OE]）小鼠被用于研究EC中的miR-126表达变化。
- **共培养和输注**：
年老和年轻的EC与HSC的体外共培养，以及在骨髓抑制后老年EC的体内输注被用于研究它们之间的相互作用。
- **免疫荧光染色和3D共聚焦成像**：
如前所述，处理小鼠的长骨（胫骨），切片并成像。
- **流式细胞术分析**：
从外周血或骨髓（来自胫骨和股骨）中获取细胞。
- **RNA测序**：
使用miRNeasy微试剂盒从年轻（2-3个月大）和衰老（18-24个月大）小鼠的骨髓HSC中提取总RNA。通过Illumina NovaSeq 6000平台和S4 Reagent Kit v1.5进行测序。

**结果**
- **衰老HSC的自我更新和再生能力**：
研究发现，衰老与促炎细胞因子（如TNFα）水平升高有关，这导致EC中miR-126表达下降，动脉内皮细胞减少，进而减少了向HSC提供的miR-126。因此，HSC虽然扩增，但其自我更新能力受损。通过向衰老的BM微环境中补充合成的miR-126模拟剂，可以恢复与年龄相关的造血变化。

**讨论**
衰老过程导致内皮细胞中miR-126的产生发生变化，这是引起HSC功能障碍的关键因素。年龄增长还伴随着炎症细胞因子的增加，从而降低EC中的miR-126水平，导致动脉内皮细胞减少，进而减少向HSC提供的miR-126。虽然HSC数量增加，但自我更新能力减弱。因此，补充合成的miR-126模拟剂可以恢复与年龄相关的造血变化。这些结果强调，造血和再生能力不仅取决于造血干细胞（HSC）的年龄，还取决于骨髓（BM）微环境的年龄。衰老骨髓微环境中的血管重塑已经显示会影响HSC的功能。为了确定骨髓微环境血管成分的年龄相关变化，我们对2个月、10个月和20个月大的野生型（wt）小鼠的胫骨中的血管进行了免疫荧光染色和3D共聚焦成像，这些小鼠分别代表年轻、中年和老年组。Sca-1高表达的EC谱系的动脉和细动脉，而Sca1低表达的EC谱系的窦状血管；H型血管以CD31和Emcn的高表达为特征，位于长骨的干骺端和内骨膜中。在这里，我们使用了简化的CD31+Sca-1高、CD31+Sca-1低和CD31+Emcn高的染色方法，并结合形态学检查和解剖位置来识别BM中的动脉、窦状血管和H型血管（在线补充图S2A），正如我们和其他研究者所报告的那样。与之前的研究结果一致，即老年小鼠中的H型血管数量减少，我们还观察到老年小鼠长骨干骺端CD31+Emcn高表达的H型血管数量减少（在线补充图S2B），这一点通过流式细胞术得到了证实（在线补充图S2C）。值得注意的是，对股骨干骺端区域的流式细胞术分析显示，在年轻和老年小鼠中，几乎所有的Emcn高表达的EC都是Sca-1高表达的（在线补充图S2C，左侧）。值得注意的是，我们发现老年小鼠长骨干骺端和骨干中的CD31+Sca-1高表达的EC数量显著减少（图2A、B和在线补充图S3）。这些结果得到了流式细胞术分析的支持，显示老年小鼠的总BM EC（CD45-Ter119-CD31+）数量普遍减少，其中主要衬里的动脉中的CD31+Sca-1高表达的EC频率显著降低，而衬里的窦状血管中的CD31+Sca-1低表达的EC频率增加（图2C-E）。在经过他莫昔芬诱导的Tie2-CreER/TdTomato/Tg(Ly6a-GFP)双荧光报告基因改造的模型中也获得了类似的结果，该模型使我们能够追踪EC（EC-TdTomato+，Sca1-GFPhigh）。我们观察到老年双荧光报告基因小鼠中的BM CD31-tdTomato?Sca1-GFPhigh表达的EC数量减少（图3A、B）。与这些结果一致，流式细胞术分析显示老年小鼠与年轻小鼠相比，Sca1高表达的EC（即 tdTomato+ GFPhigh）减少，而Sca1低表达的EC（即 tdTomato+ GFPlow）增加（图3C-E）。

这些结果表明，造血和再生能力不仅取决于HSC的年龄，还取决于BM微环境的年龄。衰老骨髓微环境中的血管重塑已经显示出会影响HSC的功能。为了确定骨髓微环境血管成分的年龄相关变化，我们对2个月、10个月和20个月大的野生型小鼠的胫骨中的血管进行了免疫荧光染色和3D共聚焦成像，这些小鼠分别代表年轻、中年和老年组。Sca-1高表达的EC谱系的动脉和细动脉，而Sca1低表达的EC谱系的窦状血管；H型血管以CD31和Emcn的高表达为特征，位于长骨的干骺端和内骨膜中。我们采用了简化的CD31+Sca-1高、CD31+Sca-1低和CD31+Emcn高的染色方法，并结合形态学检查和解剖位置来识别BM中的动脉、窦状血管和H型血管（在线补充图S2A）。与之前的研究结果一致，即老年小鼠中的H型血管数量减少，我们还观察到老年小鼠长骨干骺端CD31+Emcn高表达的H型血管数量减少（在线补充图S2B），这一点通过流式细胞术得到了证实（在线补充图S2C）。值得注意的是，对股骨干骺端区域的流式细胞术分析显示，在年轻和老年小鼠中，几乎所有的Emcn高表达的EC都是Sca-1高表达的（在线补充图S2C，左侧）。值得注意的是，我们发现老年小鼠长骨干骺端和骨干中的CD31+Sca-1高表达的EC数量显著减少（图2A、B和在线补充图S3）。这些结果得到了流式细胞术分析的支持，显示老年小鼠的总BM EC（CD45-Ter119-CD31+）数量普遍减少，其中主要衬里的动脉中的CD31+Sca-1高表达的EC频率显著降低，而衬里的窦状血管中的CD31+Sca-1低表达的EC频率增加（图2C-E）。在经过他莫昔芬诱导的Tie2-CreER/TdTomato/Tg[Ly6a-GFP]双荧光报告基因改造的模型中也获得了类似的结果，该模型使我们能够追踪EC（EC-TdTomato+，Sca1-GFPhigh）。我们观察到老年双荧光报告基因小鼠中的BM CD31-tdTomato?Sca1-GFPhigh表达的EC数量减少（图3A、B）。与这些结果一致，流式细胞术分析显示老年小鼠与年轻小鼠相比，Sca1高表达的EC（即 tdTomato+ GFPhigh）减少，而Sca1低表达的EC（即 tdTomato+ GFPlow）增加（图3C-E）。

这些结果强调，造血和再生能力不仅取决于造血干细胞（HSC）的年龄，还取决于骨髓（BM）微环境的年龄。衰老骨髓微环境中的血管重塑已经显示出会影响HSC的功能。为了确定骨髓微环境血管成分的年龄相关变化，我们对2个月、10个月和20个月大的野生型小鼠的胫骨中的血管进行了免疫荧光染色和3D共聚焦成像，这些小鼠分别代表年轻、中年和老年组。Sca-1高表达的EC谱系的动脉和细动脉，而Sca1低表达的EC谱系的窦状血管；H型血管以CD31和Emcn的高表达为特征，位于长骨的干骺端和内骨膜中。我们采用了简化的CD31+Sca-1高、CD31+Sca-1低和CD31+Emcn高的染色方法，并结合形态学检查和解剖位置来识别BM中的动脉、窦状血管和H型血管（在线补充图S2A）。与之前的研究结果一致，即老年小鼠中的H型血管数量减少，我们还观察到老年小鼠长骨干骺端CD31+Emcn高表达的H型血管数量减少（在线补充图S2B），这一点通过流式细胞术得到了证实（在线补充图S2C）。值得注意的是，对股骨干骺端区域的流式细胞术分析显示，在年轻和老年小鼠中，几乎所有的Emcn高表达的EC都是Sca-1高表达的（在线补充图S2C，左侧）。值得注意的是，我们发现老年小鼠长骨干骺端和骨干中的CD31+Sca-1高表达的EC数量显著减少（图2A、B和在线补充图S3）。这些结果得到了流式细胞术分析的支持，显示老年小鼠的总BM EC（CD45-Ter119-CD31+）数量普遍减少，其中主要衬里的动脉中的CD31+Sca-1高表达的EC频率显著降低，而衬里的窦状血管中的CD31+Sca-1低表达的EC频率增加（图2C-E）。在经过他莫昔芬诱导的Tie2-CreER/TdTomato/Tg[Ly6a-GFP]双荧光报告基因改造的模型中也获得了类似的结果，该模型使我们能够追踪EC（EC-TdTomato+，Sca1-GFPhigh）。我们观察到老年双荧光报告基因小鼠中的BM CD31-tdTomato?Sca1-GFPhigh表达的EC数量减少（图3A、B）。与这些结果一致，流式细胞术分析显示老年小鼠与年轻小鼠相比，Sca1高表达的EC（即 tdTomato+ GFPhigh）减少，而Sca1低表达的EC（即 tdTomato+ GFPlow）增加（图3C-E）。CD31+Sca-1high内皮细胞排列的动脉在Mir126f/fTie2-cre+小鼠（EC-miR-126敲除）中减少，在Spred1f/fTie2-cre+小鼠（EC-miR-126过表达）中增加。（A和B）2个月大的Mir126f/fTie2-cre-（野生型[wt]）或Mir126f/fTie2-cre+（EC-miR-126敲除[KO]）小鼠胫骨中CD31-FITC和Sca-1-PE免疫荧光染色及3D共聚焦成像（A）和CD31+Sca-1high内皮细胞（EC）排列的动脉定量（B）。（C和D）2个月大的Mir126f/fTie2-cre-或Mir126f/fTie2-cre+小鼠骨髓（BM）中Sca-1high和Sca-1low EC亚群的联合结果（C）和代表性图表（D），通过流式细胞术进行分析。（E和F）2个月大的Mir126f/fTie2-cre-或Mir126f/fTie2-cre+小鼠胫骨中CD31-FITC和Sca-1-PE免疫荧光染色及3D共聚焦成像（E）和CD31+Sca-1high内皮细胞排列的动脉定量（F），以及miR-126生物生成的下调因子。Spred1f/fTie2-cre+小鼠（即EC-Spred1 KO小鼠），因此表达恒定较高水平的EC-miR-126，比Spred1f/fTie2-cre-（wt）对照小鼠更高（在线补充图S10C），并代表EC-miR-126过表达的功能模型。因此，年轻的Spred1f/fTie2-cre+小鼠的骨髓动脉中CD31+Sca-1high EC比年轻的wt对照小鼠更多（在线补充图S10D）。相反，老化的Spred1f/fTie2-cre+小鼠没有显示出像老化wt对照小鼠那样的CD31?Sca-1high内皮细胞排列的动脉损失（图5E-H）。综上所述，这些结果支持了一个模型，即“炎症”抑制内皮miR-126的表达，导致CD31?Sca-1high EC减少和老化骨髓微环境中动脉密度降低。miR-126在老化骨髓内皮细胞中的下调导致造血干细胞的再生能力丧失。miR-126调节HSC的自我更新能力。在正常wt小鼠的骨髓微环境中，我们发现内皮细胞表达的miR-126水平至少比HSC（Fit3-CD150+CD48-LSK）高一个数量级。虽然HSC可能产生内源性miR-126，但miR-126high的内皮细胞排列的骨髓动脉血管也向骨髓微环境中的周围细胞（包括HSC）提供miR-126。我们之前证明，骨髓内皮细胞通过细胞外囊泡向白血病干细胞（LSC）和HSC传递成熟的miR-126。因此，在老化骨髓微环境中观察到的CD31?Sca-1high内皮细胞排列的动脉减少可能会减少内皮细胞来源的miR-126对HSC的外源性供应，最终通过促进HSC扩增而损害其自我更新能力。相应地，虽然年轻和老化骨髓HSC中的pri-和pre-miR-126水平相似，但老化小鼠的HSC中成熟的miR-126水平显著降低（图6A），这些HSC还显示出miR-126high CD31+Sca-1high动脉的减少（图2A, B）和HSC自我更新能力的降低（图1A, B及在线补充图S1A, B）。我们观察到这些特征与年轻的EC-miR-126 KO小鼠（Mir126f/fTie2-cre+）非常相似，后者像老化wt小鼠一样具有低miR-126水平（在线补充图S8A）、CD31+Sca-1high动脉的减少（图5A-D）和骨髓HSC的扩增（图6B），然而，尽管它们年轻，其长期再生能力显著受损（移植后20周的Mir126f/fTie2-cre+ HSC与Mir126f/fTie2-cre+ HSC的植入率：41%对比62%，P=0.0385）（图6C, D）。相反，老化的EC-miR-126 OE小鼠（Spred1f/fTie2-cre+）具有更高的骨髓CD31+Sca-1high内皮细胞和动脉密度（图5E-H）和更低的HSC频率（图7A），其自我更新能力比老化wt对照小鼠增强（移植后20周的Spred1f/fTie2-cre+ HSC与Spred1f/fTie2-cre+ HSC的植入率：42%对比9%，P=0.0016）（图7B, C）。最后，与年轻内皮细胞共培养的20个月大的CD45.2小鼠的老化HSC具有较低的miR-126水平，并且在同基因型CD45.1受者中的长期植入率降低（移植后16周的植入率：46.2%对比65.7%，P=0.0003）（图7D）；这种减少可以通过共治疗miR-126模拟物得到恢复（移植后16周的植入率：46.2%对比57.2%，P=0.03）（图7D）。这些发现进一步支持了这样的假设，即内皮细胞miR126的减少，无论是由于老化还是基因删除，都会以牺牲长期自我更新能力为代价促进HSC的扩增。为了了解老化HSC中自我更新能力降低的内在分子机制，我们对年轻（N=3个样本，来自30只年轻小鼠）和老化（N=3个样本，来自3只老化小鼠）小鼠的骨髓HSC进行了RNA-seq分析。我们发现了388个上调基因和127个下调基因。GSEA显示，与年轻HSC相比，老化HSC中炎症反应基因集（例如，干扰素α反应、IL2-STAT5信号传导、干扰素γ反应、IL6-JAK-STAT3信号传导、炎症反应）上调，而与DNA修复、有丝分裂纺锤体、G2M检查点和E2F靶标相关的基因集下调（在线补充图S11A, B和S12A, B）。老化HSC似乎获得了偏向于髓系（即Cebpd、Itgam、Csf3r、Hk3、Elane、Csf2ra）和巨核细胞（即Mpl、Vwf、Slamf1）相关标记基因的谱型。老化HSC还表达更高水平的miR-126靶基因（即Adam9、Cdk3、Itga6、Cd84、Hoxb6和PLK2），这与它们较低的miR-126水平一致（在线补充图S13B）。值得注意的是，老化HSC表现出参与氧化磷酸化（OXPHOS）的基因集显著下调（在线补充图S11B, S14A, B和S15A, B）。与这种转录谱型一致，老化HSC显示出OXPHOS（通过氧气消耗率[OCR]测量）和糖酵解（通过细胞外酸化率[ECAR]测量）活性降低，以及使用Seahorse测定法测得的ATP产量降低，并且通过电子显微镜评估的线粒体融合受损（在线补充图S16A-D）。为了确认老化HSC中发生的这些代谢变化是由miR-126表达降低驱动的，我们用miR-126模拟物（2 μM）处理老化HSC。与随机对照相比，miR-126模拟物部分恢复了与miR-126耗竭相关的变化，因为它增加了OXPHOS、糖酵解和ATP，并恢复了线粒体融合（在线补充图S17A-D）。在老龄小鼠中，骨髓（BM）的微环境据报道与促炎细胞因子的增加以及造血干细胞（HSC）向髓系分化的偏移有关。我们发现，在老龄骨髓微环境中，炎症细胞因子的水平升高，尽管HSC数量会增加，但其再生能力显著降低，同时还会出现髓系/巨核细胞的偏移。成熟的髓系/巨核细胞是炎症细胞因子的主来源，这些因子会进一步加剧髓系/巨核细胞的分化，从而加剧骨髓的“炎症老化”过程。虽然已有研究指出多种炎症细胞因子参与了这一过程，但我们重点关注了TNFα，因为它在正常和恶性造血过程中都扮演着重要角色。Yamashita和Passegue最近的研究表明，TNFα可能导致HSC过度增殖并加重衰老过程中的造血作用。在此研究中，我们发现TNFα可诱导EC-miR-126的表达下调，导致miR-126高表达的CD31+Sca-1高表达的内皮细胞（EC）减少，而miR-126低表达的CD31+Sca-1低表达的EC增加，进而导致小动脉数量减少和窦状血管增多。这种与年龄相关的骨髓血管重塑减少了EC向HSC传递miR-126的量，使HSC虽然数量增加，但长期再生能力下降。值得注意的是，在年轻的EC-miR-126敲除（KO）小鼠中也观察到了类似的现象：CD31+Sca-1高表达的EC和小动脉减少以及再生能力降低的HSC扩增。通过合成miR-126类似物上调miR-126的表达，可以恢复老龄HSC与老龄EC共培养时的长期造血再生能力，这一效果优于与年轻EC共培养的情况。综上所述，我们的研究结果表明miR-126是调控衰老过程中骨髓血管完整性和HSC维持的关键因子。在我们的模型中，老龄HSC会增殖并产生分泌包括TNFα在内的炎症细胞因子的髓系细胞。衰老骨髓微环境中升高的TNFα会抑制EC-miR-126的表达，破坏小动脉结构，并减少HSC对miR-126的获取，从而导致其功能衰退。使用合成miR-126类似物进行治疗性恢复可能是一种有前景的策略，用于对抗与衰老相关的造血功能障碍并恢复造血功能。

**数据共享声明**
本研究生成的真核RNA测序（RNA-seq）数据（GSE296123）可在美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基因表达组学数据库（GEO）中获取（网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?&acc=GSE296123；审核令牌：gxijyayutjatzux）。其他相关信息，包括在线补充方法和在线补充图表，均包含在本文的在线版本中。本研究中生成的所有其他数据集可向相应作者提出合理请求后获取。