基于S-RNase的崖兰（Aquilaria sinensis）自交不亲和性的分子特性研究及其对种质改良的启示

《Industrial Crops and Products》：Molecular characterization of S-RNase-based self-incompatibility in Aquilaria sinensis and implications for germplasm improvement

　　马光耀|李家文|陈波|吕菲菲|李思鹏|曹晓璐|黄亮明|杨云|魏建和
海南省南方医药资源保护与开发重点实验室 & 中医药管理局沉香可持续利用重点实验室，中国医学科学院药用植物研究所海南分所，海口570311

**摘要**
自交不亲和（SI）是开花植物中的一种重要繁殖策略，它可以防止自花授精并促进遗传多样性。沉香（Aquilaria sinensis）是一种濒危的树种，具有极高的经济价值，其所产生的沉香广泛用于医药、香水及宗教仪式中。在本研究中，我们证明了沉香具有配子体自交不亲和（GSI）系统：自花授粉后72小时内，花粉管无法进入子房，并在柱头基部停止移动。我们克隆并鉴定了S-位点基因AsS-RNase，该基因编码一种含有典型T2 RNase结构域的229氨基酸蛋白质。AsS-RNase在柱头上表现出特异性表达，并且在自花授粉后显著上调。功能实验证实了其抑制花粉萌发和花粉管生长的能力；亚细胞定位分析显示它存在于质膜上以及细胞核周围，暗示其在识别和信号传导过程中起作用。我们发现了19个AsS-RNase等位基因变体，这些变体具有典型的S-RNase高变异性区域。杂交实验表明，具有相同S-单倍型的植株之间不亲和，而不同单倍型的植株具有更高的结实率。这些发现为沉香的GSI系统提供了首个分子证据，有助于深入理解沉香的繁殖机制，并为未来的育种和保护工作奠定基础。

**1. 引言**
自交不亲和（SI）是指正常可育的雌雄同体植物在自花授粉后无法形成合子的现象。这是一种关键的繁殖障碍，能够促进异花授精，从而维持遗传多样性并防止植物种群内的近亲繁殖（Takayama和Isogai，2005；De Nettancourt，2013）。SI是被子植物中普遍存在的繁殖策略，存在于一百多个科中约40%的物种中。根据遗传调控类型和花粉管停止发育的阶段，SI通常被分为孢子体型、配子体型和晚作用型（Igic等，2008；Gibbs，2014）。在核心双子叶植物中，SI通常由一个高度多态性的S-位点控制，该位点包含紧密连锁的雌蕊和雄蕊S基因，共同构成一个非重组的S-单倍型（Franklin-Tong，2008；Fujii等，2016）。匹配的S-单倍型之间的等位基因特异性识别会导致自花花粉被排斥，而不同S-单倍型之间的识别则允许成功杂交（Zhao和Xue，2024）。SI系统在多个被子植物谱系中独立演化并多样化。迄今为止，已鉴定出六种主要的SI分子机制（Zhao等，2022）。其中，研究最为透彻的GSI类型是基于S-RNase的系统：S-位点通常编码一个仅在雌蕊中表达的S-RNase基因和多个在雄蕊中表达的S-位点F-box（SLF）基因。作为T2核糖核酸酶家族的一员，S-RNase作为雌性决定因子，在排斥自花花粉中起关键作用。它通过降解自花花粉管中的核糖体RNA、形成S-RNase凝集体（SRCs）、破坏肌动蛋白细胞骨架以及调节花粉管顶端的钙离子流动等多种机制实现这一功能（Chen等，2018；McClure等，1990；Yang等，2018）。S-RNase最初在自交不亲和的烟草属（Nicotiana）物种中被发现，研究表明它编码一种32 kDa的蛋白质，该蛋白质与SI表型相关的S-单倍型共分离（Anderson等，1989）。此后，这一系统已在至少七个被子植物科中被发现并得到广泛研究，包括茄科（Solanaceae）、蔷薇科（Rosaceae）、车前科（Plantaginaceae）、芸香科（Rutaceae）、山茶科（Theaceae）和仙人掌科（Cactaceae）（Liang等，2020；Asquini等，2011；Ramanauskas, Igi?，2021；Ma等，2023；Erez等，2024）。

沉香属（Aquilaria spp.）属于檀香科（Thymelaeaceae），是沉香的主要来源。几个世纪以来，由于沉香在医药、香水、香料和装饰品中的广泛应用，其在全球范围内需求量巨大（Naef，2011；Wang等，2021）。全球沉香产业年产值超过300亿美元。由于高需求和经济价值，野生沉香物种遭到过度开发，已被列为濒危物种（CITES，2019）。近年来，在适宜地区（如东南亚）建立了大规模的沉香人工种植园以满足不断增长的需求，但基因资源的来源不清和树脂产量低仍然是限制产业发展的主要瓶颈（Tan等，2019）。自2014年以来，市场出现了“唐杰”（Tangjie）、“优叶子”（Youyezi）和“金沙叶”（Jinshaye）等100多个优质沉香克隆株，这些克隆株统称为“Chi-Nan”类型。这些克隆株源自中国广东和海南的野生沉香资源（Yu等，2021）。系统发育和代谢组学研究表明，Chi-Nan基因资源属于沉香（Aquilaria sinensis）中的一个遗传上独立的谱系，该谱系大约在10万年前分化，并产生化学性质不同的沉香（Hou等，2022；Kang等，2022；Lv等，2025）。虽然克隆繁殖保证了优良性状的统一性，但也导致遗传基础狭窄，因此需要通过有性繁殖来更新基因资源、实现遗传多样性和长期育种改进。

沉香在自然种群中能够开花结果；然而，孤立的个体或遗传上同质的群体往往几乎不结实，这表明存在自交不亲和系统。最近的研究通过控制授粉实验和花粉管生长分析直接证实了这一现象（Chen等，2016；Wang等，2024）。此外，杂交实验也证实了其他沉香物种（如Aquilaria crassna、Aquilaria filaria、Aquilaria malaccensis和Aquilaria microcarpa）也存在自交不亲和现象（López-Sampson和Page，2019）。不过，沉香属中具体的SI类型尚未确定，调控交配亲和性的分子机制仍不清楚。此外，Chi-Nan基因资源包含多个独立的克隆谱系，尽管它们通常被一同栽培，但自交不亲和是否会影响结实率并限制杂交仍不清楚。这些知识空白对沉香基因资源的保护和遗传改良构成了重大挑战。

**2. 材料与方法**
2.1. 植物材料
实验材料为20年生的沉香植株，这些植株通常在3月至5月开花，7月至8月结果实。所有植株均由中国医学科学院药用植物研究所海南分所的XINGLONG南方药用园实验基地栽培（纬度18°43′50″N，经度110°11′55″E，海拔28米）。
2.2. 样本采集与处理
在沉香开花高峰期进行人工授粉。从三株植株中采集柱头和子房样本，分别在授粉前（0 h）以及授粉后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h采集样本（SP或CP）。这些样本分别标记为SP0h–SP72h和CP0h–CP72h。用于显微镜分析的样本用Carnoy固定液（3:1乙醇：乙酸）保存直至观察（Ma等，2021）。用于RNase活性测试和qRTPCR的样本快速冷冻在液氮中并储存在-80°C。用于体外花粉萌发测试的雄蕊则在开花当天清晨采集。
2.3. 沉香花粉管生长的观察
将柱头沿基部纵向切开，置于4°C的70%乙醇中超过2小时，随后依次用50%乙醇、20%乙醇和蒸馏水冲洗5分钟，再用0.5%苯胺蓝溶液染色2小时（Liu等，2023）。染色的柱头轻轻压在玻璃载玻片上，并使用奥林巴斯BX53荧光显微镜观察，图像由奥林巴斯DP74数码相机记录。
2.4. 沉香中RNase T2浓度测定
使用Plant RNase T2 ELISA试剂盒（96 T；Mmbio Biotechnology，中国）测定沉香茎、叶、柱头和花瓣中的RNase活性。该检测基于双抗体夹心法，其中RNase T2被固相单克隆抗体捕获，并通过HRP标记的二次抗体检测。加入TMB底物后，使用微孔板读取仪在450 nm处测量吸光度（Liang等，2020）。通过将试剂盒提供的RNase T2标准品浓度与其对应的OD450值绘制标准曲线来确定样品浓度。样品浓度可通过插值法或标准曲线得出的线性回归方程进行计算。计算出的浓度再乘以适当的稀释因子得到最终的RNase T2浓度。检测范围为2–90 pg/mL，相关系数（R2）>0.95。检测内和检测间的变异系数分别小于10%和12%。
2.5. 沉香中RNase T2家族的鉴定与表征
从NCBI数据库下载沉香的基因组数据（GCA_005392925.1）。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）的RNase T2蛋白序列作为查询，使用TBtools的BLAST功能初步鉴定RNase T2基因家族（Chen等，2020）。根据Pfam数据库获得的RNase T2家族的隐马尔可夫模型（HMM）谱谱进一步验证候选基因。所有候选蛋白序列同时提交至Pfam数据库和NCBI保守结构域数据库（CDD），以确认典型的RNase T2结构域的存在。使用ExPASy软件预测候选蛋白的理化性质。使用DNAMAN进行氨基酸序列的多序列比对，并在MEGA 11中使用邻接连接（NJ）方法构建系统发育树（Saitou和Nei，1987）。使用MEME进行保守基序分析，并使用NCBI CDD标注结构域。所有可视化操作均使用TBtools完成。
2.6. RNA提取与qRTPCR分析
使用Plant Total RNA Extraction Kit（Fujibio，中国）从沉香的茎、叶、根、花和柱头组织（包括SP0h–SP72h和CP0h–CP72h）中提取总RNA。利用MonScript? RTIII All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（Monad Biotech，中国）从1 μg总RNA中合成第一链cDNA。
定量实时PCR（qRTPCR）用于评估不同处理对AsS-RNase表达水平的影响。每个样本包含三个生物学重复和一个技术重复。qPCR反应体积为10 μL，其中包含0.5 μL cDNA、每种引物0.5 μM和5 μL SYBR qPCR Master Mix（Monad Biotech）。扩增反应在CFX Connect? Real-Time PCR System（Bio-Rad）中进行。PCR程序如下：95°C预变性30秒，随后进行40个循环，每次95°C 10秒、60°C 30秒。熔解曲线分析条件为：95°C 10秒、60°C 60秒、95°C 15秒。以内参基因GADPH作为内参（表S1）。
2.7. AsS-RNase的克隆与系统发育分析
使用专为AsS-RNase设计的特异性引物（表S1）扩增全长AsS-RNase编码序列，以cDNA为模板。PCR反应体积为50 μL，包含25 μL 2×Phanta Max Master Mix、每种引物2 μM（10 μM）、3 μL cDNA模板（约100 ng）和18 μL ddH?O。PCR的条件如下：初始变性在95°C下进行3分钟，然后是35个循环，每个循环中变性95°C 15秒，退火55°C 15秒，延伸72°C 30秒，最后再次延伸72°C 5分钟。反应后保持在16°C。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行确认，然后通过凝胶纯化，并进行克隆和测序。为了构建系统发育树，我们从UniProt数据库中下载了其他物种的S-RNase蛋白序列。系统发育分析使用MEGA 11软件，并基于邻接法（Liang等人，2017年）进行。

2.8 AsS-RNase的亚细胞定位
随后将AsS-RNase的编码序列与GFP融合，并插入pBinGFP2载体中以构建重组表达质粒。通过冻融法将质粒转化到Agrobacterium tumefaciens GV3101中。将一个阳性菌落接种到液体YEB培养基中，培养直至600纳米处的光密度（OD???）达到约0.6。健康的Nicotiana benthamiana植物在6周生长阶段接受农杆菌渗透。使用无针注射器将细菌悬浮液注入叶片的背侧，并标记渗透区域以确保准确取样。渗透后，植物在低光条件下培养约48小时（Murase等人，2004年）。然后从渗透部位切下叶片样本，并在暗处用Nikon C2-ER共聚焦激光扫描显微镜观察。捕获荧光图像以评估AsS-RNase-GFP融合蛋白的亚细胞定位。

2.9 AsS-RNase的重组表达及其对花粉萌发的抑制作用
将AsS-RNase的编码序列克隆并插入含有N端His标签的pET-30a(+)载体中，然后转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中。在37°C和220 rpm下，将阳性克隆在添加了50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中过夜培养，然后以1:100的比例稀释到新鲜培养基中，培养至OD???为0.6–0.8。在16°C下用0.5 mM IPTG诱导蛋白质表达12–16小时。收集细胞，重新悬浮在20 mL裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物中，并在冰上超声裂解。离心后，将上清液加载到预先用结合缓冲液平衡的Ni-NTA亲和柱上。随后用20 mM和250 mM咪唑缓冲液洗涤柱子。收集洗脱液，并使用BSA作为标准物通过Bradford测定法测定蛋白质浓度。为了评估重组AsS-RNase对花粉萌发的影响，将纯化的蛋白以最终浓度10、20和50 μg/mL加入液体培养基（20 g/L蔗糖，0.05 g/L硼酸）中（Liang等人，2017年）。使用相应的热失活蛋白和空白缓冲液作为对照。将培养基的等分样品分配到凹面玻璃 slides上，并加入新鲜收集的A. sinensis花粉。将 slides放在湿润的Petri dish中，在25°C下培养4小时。对于每个处理，使用三个独立的生物学重复样品分析花粉萌发和花粉管生长情况，并对每个重复样品随机选择三个显微视野进行成像，以计算花粉萌发率和花粉管长度。

2.10 AsS-RNase的多态性及其与A. sinensis结实性的关联
选择了十个A. sinensis样本，包括六个Chi-Nan种质和四个常见种质，用于收集柱头。提取总RNA并反转录为cDNA。使用基因特异性引物对全长AsS-RNase进行PCR扩增（表S1）。PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后纯化、克隆和测序。获得的序列使用DNAStar软件进行组装和分析，以鉴定开放阅读框（ORFs）并将其翻译为氨基酸序列。为了评估AsS-RNase多态性与结实性的潜在关系，在田间使用这十个种质进行了自花授粉和成对异花授粉实验。对于每种授粉处理，每棵树选择50个处于松散花蕾期的花蕾。将花朵套上袋子，标记后授粉，三天后取下袋子。授粉一周后记录结实情况。

3. 结果
3.1 A. sinensis自花授粉和异花授粉下的花粉管生长和结实性
田间实验显示，A. sinensis的自花授粉（SP）和异花授粉（CP）处理在柱头和子房发育方面存在显著差异。在SP组中，柱头在授粉后72小时开始枯萎并失去授粉能力，随后子房发生退化和脱落。相比之下，CP组的子房在72小时后逐渐增大。CP组的平均结实率为70.3%，而SP组的结实率低于1%，表明存在自交不亲和（SI）机制。为了研究不同授粉处理下的花粉管行为，在授粉后0至72小时的不同时间点采集SP和CP花朵的柱头样本，并使用荧光显微镜观察（图1）。花粉管在荧光照射下表现出内在的绿色自发荧光。授粉后的前24小时内，SP样本中的花粉管生长到柱头的中间或下部区域，而CP样本中的花粉管则进一步延伸到柱头的基部区域。此时，在SP或CP样本的子房内部均未检测到绿色荧光，表明花粉管尚未进入子房（图1A, D）。到48小时时，SP和CP样本的子房外围区域都观察到了绿色荧光；然而，子房内部仍然没有荧光，表明花粉管虽然到达了子房表面但未穿透子房组织（图1B, E）。授粉后72小时，在CP样本的子房内部检测到明显的绿色荧光，而SP样本的子房内则没有荧光。这些观察结果表明，SP样本中的花粉管停止生长未能进入子房，而CP样本中的花粉管成功穿透子房并继续向受精方向生长（图1C, F）。

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图1. A. sinensis自花授粉和异花授粉后的花粉管生长差异
注：A：SP24h，B：SP48h，C：SP72h，D：CP24h，E：CP48h，F：CP72h；Pt：花粉管，Ov：子房。
这些结果表明，A. sinensis的花粉管在自花授粉和异花授粉条件下都能在柱头上萌发并生长进入柱头。然而，在自花授粉条件下，花粉管在柱头内的生长受到抑制，无法到达子房，这与自交不亲和（SI）系统的特征一致。

3.2 A. sinensis柱头中RNase T2浓度在不同授粉处理下的动态变化
在自花授粉、异花授粉和未授粉处理后，分别在多个时间点测量了A. sinensis柱头中的RNase T2浓度，-24小时和0小时作为授粉前的对照时间点（图2）。

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图2. A. sinensis柱头中RNase T2浓度的动态变化
结果显示，尽管所有处理下的RNase T2水平随时间增加，但其时间表达模式存在显著差异。在自花授粉组中，浓度从0到12小时相对稳定，随后持续增加，在72小时达到92.82 ± 0.52 pg/mL的峰值。在异花授粉组中，RNase T2水平在12小时增加，在12到48小时之间保持相对稳定（均低于90 pg/mL），而在72小时显著下降。在未授粉组中，RNase T2水平在整个时间过程中逐渐且持续增加；然而，其水平始终低于自花授粉组的柱头。这些结果表明，RNase T2的丰度以授粉类型依赖的方式进行动态调节。自花授粉后RNase T2的持续积累可能与A. sinensis的自交不亲和反应有关。但需要注意的是，RNase T2 ELISA测定可能检测到多种RNase T2家族成员，包括非S-RNases。因此，这些ELISA数据为S-RNase丰度的变化提供了支持性但间接的证据，关于SI特异性的结论应结合本研究中的遗传学、表达和亲和性分析进行解释。

3.3 A. sinensis中RNase T2家族成员和假定S-RNases的分子特性
在A. sinensis基因组中鉴定了总共13个假定RNase T2家族基因。其中10个基因位于1至8号染色体上，其余3个基因位于非锚定支架上。这些基因按顺序标记为AsRNS1至AsRNS13（表S2）。编码序列（CDSs）长度从684到1332 bp不等，预测的等电点（pI）介于4.70到9.72之间。大多数编码蛋白的分子量在24到34 kDa之间，这与RNase T2酶的典型大小范围一致，除了AsRNS8的分子量为49.21 kDa。对13个AsRNS蛋白的多重序列比对显示，所有成员都含有两个高度保守的基序（Motif I和Motif II），每个基序至少包含一个对RNase催化活性至关重要的组氨酸残基。值得注意的是，AsRNS4只含有一个组氨酸残基，而其他所有成员都含有两个组氨酸残基，这与功能性RNase T2酶中典型的活性位点残基一致（图S1）。为了进一步表征AsRNS基因家族，基于全长氨基酸序列构建了系统发育树，并进行了保守基序和结构域分析（图3）。MEME分析揭示了三个保守的基序（Motif 1–3），其中Motif 1和Motif 2对应于核心催化区域，而Motif 3通常位于N端。虽然大多数AsRNS蛋白具有保守的基序结构，但AsRNS8显示出重复的基序排列，AsRNS4显示出了略微不同的模式，表明可能存在功能多样性。使用NCBI保守结构域数据库（CDD）进行结构域预测，所有13个蛋白都具有RNase T2相关的结构域。具体而言，AsRNS1、AsRNS3、AsRNS7和AsRNS13含有典型的RNase T2结构域，表明它们是典型的RNase T2酶。这些结果表明AsRNS1、AsRNS3、AsRNS7和AsRNS13在结构上是保守的，并且可能是参与A. sinensis SI反应的强候选S-RNase基因。

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图3. AsRNS蛋白的保守基序和结构域分析

3.4 A. sinensis中RNase T2基因的组织特异性表达
分析了13个AsRNS基因在根、茎、叶和花组织中的表达谱，显示出不同的组织特异性模式（图4）。其中，AsRNS3的表达水平最高，在花中的相对表达值超过40，表明其具有强烈的花特异性表达（P < 0.01）。同样，AsRNS6和AsRNS12主要在花中表达，而AsRNS6和AsRNS10在叶中也表现出高水平表达，表明它们可能在花和营养器官发育中发挥作用。大多数其他AsRNS基因在组织中的表达水平较低或中等，AsRNS4、AsRNS8和AsRNS13几乎不表达，这可能表明它们具有条件性或发育阶段特异性的表达模式。

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图4. 不同组织中AsRNS的相对表达
实验结果表明，只有AsRNS3在柱头中表现出高且特异性的表达。这种表达模式与S-RNase基因的典型特征一致，这些基因在柱头中特异性表达并参与调节植物的SI反应。因此，AsRNS3可能是参与A. sinensis SI机制的候选S-RNase基因。

3.5 全长AsS-RNase cDNA的克隆和系统发育分析
使用同源性方法从A. sinensis中克隆了AsRNase3基因。获得了大约700 bp的独特PCR条带（图5）。克隆片段的测序产生了690 bp的cDNA，对应于AsS-RNase（图S2）。预测的蛋白质包含229个氨基酸，分子量为25.96 kDa，等电点（pI）为4.70。鉴定出典型的RNase T2家族的保守基序和催化组氨酸残基，确认了其核酸酶特性。

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图5. AsS-RNase cDNA片段的PCR扩增
系统发育分析显示，AsS-RNase形成了一个与蔷薇科物种（如苹果（Malus）、梨（Pyrus）和李子（Prunus）的S-RNase组明显分离的独特分支，表明其序列与这些谱系有显著差异。值得注意的是，AsS-RNase 与 Citrus 和 Camellia 中的 S-RNases 密切聚集，形成了一个得到充分支持的独立分支。这些发现表明，这三个属可能具有保守的结构特征或功能机制。聚类模式表明，AsS-RNase 在系统发育上与 Citrus 和 Camellia 的 S-RNases 关系更密切，并可能通过类似的 SI 机制发挥作用。

图 6. AsS-RNase 和另一种植物 S-RNase 的系统发育树。

3.6. A. sinensis 中 AsS-RNase 的空间和时间表达谱分析
为了研究 AsS-RNase 的组织特异性表达模式，对 A. sinensis 的各种器官（包括根、叶、茎、花柱和花瓣）进行了 qRTPCR 分析。如图 7 所示，AsS-RNase 在花柱中的表达量极高，相对表达水平约为 91.15 倍（P < 0.01），而在其他组织中的表达量则很低。这种花柱特异性表达与 S-RNase 基因的典型特征一致，因为它们在 GSI 系统中作为雌性 S-决定因子，并且已知仅在花柱中表达以介导自身花粉管的识别和排斥。

图 7. A. sinensis 不同组织中 AsS-RNase 的相对表达水平。

为了进一步研究 AsS-RNase 是否对授粉有特异性反应，并参与 SI 应答，我们检查了其在三种授粉处理下的时间表达模式：自花授粉、异花授粉和未授粉（图 8）。在授粉后的前 6 小时内，所有处理组中的 AsS-RNase 表达量都较低，没有观察到统计学上的显著差异（P > 0.05）。然而，在 12 小时时，自花授粉组的 AsS-RNase 表达量显著上调（P < 0.01），并在 48 小时时达到峰值 4.34，远高于同一时间点的异花授粉和未授粉组。尽管随后表达量下降，但在 72 小时内仍保持较高水平。相比之下，异花授粉组的 AsS-RNase 表达量没有显著变化，始终保持在较低水平。未授粉组在 12 到 24 小时之间表现出中等程度的表达升高，但上调幅度明显低于自花授粉组。

图 8. A. sinensis 在不同授粉处理和时间点下的 AsS-RNase 相对表达。

这些结果表明，AsS-RNase 的表达不仅具有花柱特异性，而且在自花授粉后迅速且强烈地被诱导，其峰值比异花授粉或未授粉处理更高、更早。这种表达模式强烈表明，AsS-RNase 在 A. sinensis 的 SI 应答中起核心作用，可能作为参与花粉识别和排斥的潜在 S-决定因子。

3.7. AsS-RNase 的亚细胞定位
使用瞬时表达系统结合共聚焦显微镜技术，对烟草表皮细胞中的 AsS-RNase-GFP 融合蛋白进行了亚细胞定位分析（图 9）。结果表明，AsS-RNase-GFP 主要定位于质膜；在细胞核和核周区域也观察到一些信号。这种定位模式表明，AsS-RNase 可能在细胞外信号感知和细胞内信号转导中发挥作用。此外，与质膜标记物的共定位支持了其膜相关的作用，这与 S-RNase 蛋白在 SI 应答中介导细胞间识别的功能一致。

3.8. AsS-RNase 的重组表达及其对花粉萌发的抑制作用
在 IPTG 诱导下，观察到了一个与预期融合蛋白大小相符的诱导条带（图 10A）。随后纯化了目标蛋白并进行了透析，得到了一条约 25 kDa 的条带，这与其预测的分子量一致（图 10B）。此外，与 0.5 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）标准品比较显示，目标条带的强度更高（图 10C），表明成功获得了浓度超过 0.5 mg/mL 的高质量重组 AsS-RNase 蛋白。

图 10. AsS-RNase 表达和纯化的 SDSPAGE 分析：A. 在诱导前后大肠杆菌中的表达情况，以及可溶性和不可溶性分数；B. 亲和纯化后的洗脱分数；C. 纯化的 AsS-RNase 与 BSA 标准品的比较。

为了研究 AsS-RNase 的功能作用，通过在萌发培养基中添加活性重组蛋白（浓度分别为 10、20 和 50 μg/mL）以及相应的热失活对照进行了体外花粉萌发试验（图 11A）。在未添加蛋白的对照组（CK）中，花粉萌发率为 86.67 ± 1.87%，平均花粉管长度为 253.35 ± 4.23 μm，表明花粉具有正常的存活能力和管生长能力。然而，添加活性 AsS-RNase 蛋白显著抑制了花粉萌发和管伸长，且这种抑制作用具有剂量依赖性。在 10 μg/mL 时，萌发率降至 31.06 ± 1.06%，平均管长度降至 148.66 ± 1.53 μm。在 20 μg/mL 时，萌发率进一步降低；在 50 μg/mL 时，花粉萌发完全被抑制，未检测到管形成（萌发率和管长度 = 0）。相比之下，热失活蛋白在任何测试浓度下对花粉萌发或管生长均无显著影响，其值与对照组相当（图 11B）。

这些结果表明，活性 AsS-RNase 蛋白强烈抑制 A. sinensis 中的花粉萌发和管伸长。失活蛋白缺乏抑制作用证实了这种活性依赖于 RNase 的催化功能。这些发现支持 AsS-RNase 作为 A. sinensis 中 SI 的潜在 S-决定因子的功能作用。

3.9. AsS-RNase 的多态性及其对 A. sinensis 交叉兼容性的影响
从六个 Chi-Nan 副系（TJ、JSY、YYZ、QLX、BHL 和 LYW）和四个常见 A. sinensis 副系中克隆并测序了 AsS-RNase 的全长 cDNA，得到了 19 个多态性基因序列（图 12）。所有序列都显示出高度保守的信号肽区域和催化核心基序，这与典型 S-RNase 的特征一致。

图 12. A. sinensis 中 AsS-RNase 蛋白的多个序列比对。
对 19 个 AsS-RNase 等位基因的系统发育分析将变体分为三个主要进化谱系（图 S3）。Chi-Nan 和常见副系的等位基因分布在所有谱系中，表明 AsS-RNase 多态性是在物种水平上维持的，而不是与特定副系类型相关。谱系间的显著分化与长期平衡选择一致，这是 GSI 系统中 S-位点进化的特征。

尽管整体结构保守，但在蛋白质的 N 末端区域和中心部分仍存在几个高度变异的区域（HVs），这些区域通过不同的氨基酸替换或缺失而突出显示，可能导致 A. sinensis 基因型间在 S-等位基因识别和 SI 特异性方面的功能差异。值得注意的是，变异性集中在假定高度变异的位点（例如 40–70 和 130–160 位点），这些位点通常与 S-RNases 的等位基因特异性相关。这种多态性对于确定花粉-柱头识别过程中的等位基因特异性相互作用至关重要。尽管存在这些变异，但对 RNase 催化活性至关重要的保守组氨酸残基保持不变，表明这些多态性蛋白可能仍保留酶活性。

为了评估不同 A. sinensis 副系之间的兼容性，进行了包括自花授粉和异花授粉在内的对照授粉实验（表 1）。结果表明，果实结实率因花粉供体和受体的组合而显著不同。特别是，JSY、YYZ 和 TJ 副系在自花授粉下的结实率极低（<3%），表明它们具有强烈的 SI。这三个副系之间的异花授粉也未能产生果实，表明它们可能具有相同的 S-单倍型，因此相互不兼容。相比之下，QLX 和 PT08 也表现出相互不兼容，在相互杂交中未结实。所有其他副系组合均成功实现了异花授粉，结实率在 60% 到 80% 之间，表明具有广泛的兼容性和不同的 S-单倍型。这些结果表明，一些 Chi-Nan 和常见副系是交叉兼容的，AsS-RNase 多态性在决定副系之间的授粉兼容性中起着核心作用。

表 1. A. sinensis 不同 S-基因型在自花授粉和异花授粉处理下的结实率。

这些结果表明，活性 AsS-RNase 蛋白强烈抑制 A. sinensis 中的花粉萌发和管伸长。失活蛋白缺乏抑制作用证实了这种活性依赖于 RNase 的催化功能。这些发现支持 AsS-RNase 作为 A. sinensis 中 SI 的潜在 S-决定因子的功能作用。

4.1. A. sinensis 表现出 S-RNase 介导的 GSI
SI 是开花植物中最普遍的 SI 机制，主要由称为 S-RNase 的糖蛋白——花柱中的 S-决定因子介导。该因子被主动运输到生长中的花粉管中，在那里行使细胞毒性核糖核酸酶活性以抑制花粉管生长。当花粉管与柱头具有相同的 S-单倍型时，S-RNase 保持活性并诱导程序性细胞死亡。相反，如果花粉和柱头具有不同的 S-单倍型，则会触发一系列解毒机制来中和细胞毒性，从而实现成功受精（McClure 等人，1990；Franklin-Tong 和 Franklin，2003；Sassa，2016）。在这些机制中，“S-RNase 降解模型”是目前最广泛接受的非自我 S-RNase 在兼容花粉管中被失活的解释（McClure 等人，2011）。在这个模型中，非自我 S-RNase 被 SCF/SLF 复合物识别，并通过 K48 连接的链在多个赖氨酸残基处多聚泛素化，随后通过 26S 蛋白酶体进行蛋白酶体降解。相比之下，自我 S-RNase 由于与 SLF 库不兼容而逃避泛素化，因此会在自我花粉管中积累，并在那里抑制生长（Qiao 等人，2004；Zhao 等人，2021）。在 A. sinensis 中，授粉后花柱中 RNase T2 蛋白的时间丰度支持它们在 SI 应答中的功能作用。在自花授粉下，AsS-RNase 水平随时间增加，而在异花授粉条件下，蛋白质丰度显著降低。这些模式表明，兼容的花粉可以特异性地降解或失活非自我 S-RNase，从而允许花粉管成功进入子房。功能实验进一步证实了这一作用：重组 AsS-RNase 蛋白在体外显著且剂量依赖性地抑制了 A. sinensis 的花粉萌发和管伸长，而热失活的 AsS-RNase 则没有效果，突出了 RNase 酶活性在介导花粉排斥中的关键作用。

尽管不同植物科的 S-RNase 基因之间存在结构多样性，但证据支持它们具有共同的祖先起源，基于 S-RNase 的 SI 可能在这些谱系的最后一个共同祖先中就已存在（Igic 和 Kohn，2001）。在茄科和车前科中，S-RNases 通常具有五个保守区域（C1–C5）和两个高度可变域（HVa 和 HVb），而在蔷薇科 S-RNases 中通常只包含一个与 HVa 同源的高度可变域（Ishimizu 等人，1998；IDA 等人，2001）。S-RNase 的酶活性也可能受到氧化还原调节的影响。例如，NaTrxh（Nicotiana alata 的硫氧还蛋白 h 类型）通过破坏保守半胱氨酸残基之间的二硫键来增强 S-RNase 活性，从而微调 SI 应答（Torres-Rodríguez 等人，2020）。A. sinensis 的 AsS-RNase 包含一个高度保守的 T2 RNase 结构域、典型的催化残基和一个多态性高度可变区域。这些分子特征与茄科和其他 GSI 种类中功能验证的 S-RNases 一致。AsS-RNase 还具有高度的组织特异性，仅在花柱中表达，并定位于质膜和花柱细胞的细胞外基质中，这种表达和定位模式与 GSI 系统中雌性 S-决定因子的空间特征高度一致（Liang 等人，2020）。A. sinensis 的 SI 机制符合基于 S-RNase 的配子体 SI 模型。AsS-RNase 作为关键的雌性识别因子，介导自我花粉的排斥，提供了这一机制在 Thymelaeaceae 科中的首个直接分子证据。

4.2. Aquilaria 中 SI 的起源和进化
认为 S-RNase 起源于最近的共同真双子叶植物祖先，其在不同谱系中的进化轨迹表现为频繁的独立丢失和获得（Lv 等人，2022；Zhao 等人，2022）。到目前为止，由 S-RNase 控制的 GSI 系统已在多个植物科中得到实验验证，包括茄科、车前科、蔷薇科和 Rutaceae。此外，Malvaceae、Rubiaceae、Euphorbiaceae、Cucurbitaceae、Fabaceae、Oleaceae 和 Rhamnaceae 等科的 T2 类型 RNases 在系统发育上与典型的 S-RNases 聚类，表明它们具有共同的进化起源（Ramanauskas 和 Igi?，2017）。作为合欢属（Aquilaria）的代表性物种，中国乳香（A. sinensis）编码的S-RNase蛋白在结构、功能和表达模式上与已知的GSI系统存在显著相似性，表明该属中的SI机制可能是通过进化趋同形成的，或者是从祖先SI系统延续下来的。系统发育分析支持了这一假设，结果显示AsS-RNase与已知的GSI谱系中的S-RNase聚类在一起，并保留了高度保守的T2 RNase结构域和关键的信号肽基序。这强烈表明合欢属中的S-RNase并非全新创新，而是继承自一种古老的、广泛保守的SI系统。SI特征的进化与群体遗传结构密切相关：在受GSI控制的群体中，携带罕见S-RNase等位的个体更有可能在多样化的花粉库中实现受精，从而获得繁殖优势；而常见等位基因则因较高的不相容性率而受到负频率依赖的选择（Lawrence, 2000; Stoeckel et al., 2012; Maenosono et al., 2024）。这种动态机制有助于维持S-位点的高等位基因多样性，并促进群体的繁殖成功。包括中国乳香（A. sinensis）、粗叶合欢（A. crassna）和马来合欢（A. malaccensis）在内的多种合欢属物种都表现出明显的SI现象——自花授粉会导致受精失败，而种间杂交则可以产生可育种子（López-Sampson and Page, 2019）。这些发现进一步证明了整个合欢属中SI机制的保守性。本研究对中国乳香中AsS-RNase的分子分析揭示了其特征性的多态性氨基酸位点，共鉴定出19个不同的等位基因变异体，这与GSI系统中S-RNase的高等位基因多样性一致（McClure et al., 1990; Sassa, 2016）。此外，在AsS-RNase蛋白中还发现了高度可变的区域（HVs），这些区域对于识别花粉单倍型和维持自花排斥的特异性及有效性至关重要（Fujii et al., 2016; Barnes et al., 2017）。综合这些结果，可以强烈推断合欢属中的S-RNase介导的GSI机制很可能起源于一个古老的真双子叶植物系统，并在其进化过程中得到稳定保留。这一机制不仅有助于该属的强制性异花授粉策略和遗传多样性维持，还可能在生态适应和群体可持续性方面发挥关键作用。未来的全基因组比较研究将有助于进一步阐明合欢属中SI基因的进化路径，并明确其在茶梅科（Thymelaeaceae）谱系中的位置和多样化。

4.3. 中国乳香种质改良和育种中AsS-RNase的应用
在如水果树和药用树等多年生木本植物中，较长的幼年期和较大的植株尺寸显著限制了传统育种程序的效率（Zhang et al., 2024）。作为强制性异花授粉物种的中国乳香的生殖成功高度依赖于花粉的兼容性。然而，传统的育种方法（如控制授粉和花粉管追踪）劳动强度大、对环境敏感，且不适用于大规模或早期世代的选择。成功应用于果树的技术（如苹果、樱桃和李子中的基于等位基因PCR的S基因分型，Kivistik et al., 2022; Orlando Marchesano B et al., 2022）表明，AsS-RNase等位基因可作为分子标记，用于标记辅助选择（MAS），从而快速识别S基因型并指导亲本选择。通过建立AsS-RNase单倍型数据库，育种者可以有效预测亲本系间的兼容性，从而促进高效杂交并加速优良品种的培育（Da Silva M et al., 2016; Xiao et al., 2019）。这种策略类似于作物育种中使用的SNP和QTL方法，有望实现早期世代选择并缩短育种周期。近期基因组编辑技术（特别是CRISPR/Cas9）的发展进一步扩展了植物SI特征 manipulative 的可能性。与传统的诱变或经验选择方法相比，精确编辑马铃薯（Solanum tuberosum）中的S-位点成分（如S-RNase）或油菜（Brassica rapa）中的PR55/B已被证明可以有效逆转SI表型（Ye et al., 2018; Enciso-Rodriguez et al., 2019; Shin et al., 2022）。在这种情况下，AsS-RNase基因分型为评估中国乳香的SI机制提供了有价值的分子工具。在育种群体中鉴定S-等位基因可以帮助预测亲本间的兼容性，避免不兼容的杂交，这对于“Chi-Nan”等近缘优良克隆尤为重要。战略性地配对具有不同S基因型的个体可以克服SI障碍，提高种子结实率。此外，将S-位点信息纳入果园设计和花粉供体管理中，有助于维持栽培群体的遗传多样性。总体而言，AsS-RNase等位基因标记的应用不仅为加速合欢属育种提供了分子工具，也为未来针对木本多年生植物的SI机制的功能性研究和定向操作奠定了基础。

5. 结论
本研究首次提供了分子证据，证明中国乳香具有由S-RNase介导的GSI系统——这是真双子叶植物中的常见机制。从十个种质资源中鉴定出19个多态性的AsS-RNase等位基因，其表达模式及花粉管抑制实验结果证实了它们在自花排斥中的关键作用。基因分型和授粉测试表明，种质资源间的杂交兼容性与S-单倍型的相似性密切相关，尤其是在高产的“Chi-Nan”型和常见类型之间。AsS-RNase与茄科（Solanaceae）、芸香科（Rutaceae）和山茶科（Camellia）中的S-RNase在结构上的保守性表明，茶梅科中的SI机制具有古老且趋同进化的特征。这些发现加深了我们对合欢属生殖障碍的理解，并为旨在提高沉香产量的育种和保护工作提供了分子基础。

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杨云：写作、审稿与编辑，资源整理
黄亮明：资源整理
曹晓璐：资源整理
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吕菲菲：写作、审稿与编辑，数据管理
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李家文：初稿撰写，方法学设计
马广耀：写作、审稿与编辑，初稿撰写，方法学设计，数据整理
魏建和：写作、审稿，项目指导

### 资助
本研究得到了海南省自然科学基金 [324QN338]、海南省科技创新人才激励基金 [KJRC2023B17]、海南省第二批杰出人才团发展计划 [HNYT20240003]、中国医学科学院医学科学创新基金 (CIFMS) [2025-I2M-XHCL-060] 以及海南省“南海之星”项目 [NHXXRCXM202342] 的支持。