富含槲皮素的壳聚糖纳米颗粒用于增强对麻黄锈病（Zanthoxylum armatum rust）的控制效果：抗真菌作用及诱导的植物抗性

《Industrial Crops and Products》：Quercetin?loaded chitosan nanoparticles for enhanced control of Zanthoxylum armatum rust: Antifungal action and induced resistance

　　李 Zhao | 林 Lan | 姚 元 | 刘 星然 | 刘 星宇 | 周 自辰 | 赖 英明 | 陈 广艳 | 杨 春琳 | 叶 芒 | 李 莉英 | 李淑江 | 朱 天辉 | 汉 山
四川农业大学林学院，四川成都 611130，中国

**摘要**
Zanthoxylum armatum DC. 是一种具有经济价值的工业作物，但其上由 Coleosporium zanthoxyli 引起的锈病严重限制了其生产力。目前依赖化学杀菌剂存在抗药性和环境污染的风险。本研究通过将从生物防治真菌 Ramularia collo-cygni 中筛选出的关键抗真菌代谢物槲皮素（quercetin）采用离子凝胶化方法装载到壳聚糖（CS）纳米颗粒（QUE-NPs）中，开发出一种环保型纳米农药。通过单因素实验和人工神经网络建模优化了制备工艺，实现了84.85%的包封效率，并获得了粒径为207.4纳米的球形颗粒。槲皮素的装载通过氢键和静电相互作用实现，在pH 4–6条件下稳定性最佳，4℃下的储存期为13天。体外实验表明，0.8 mg/L的QUE-NPs可抑制88.81%的锈菌夏孢子萌发。盆栽和田间试验显示，预防性叶面施用0.6–0.8 mg/L的QUE-NPs显著降低了病害发生率和指数，效果优于治疗性处理。该制剂持续提升了防御酶（SOD、POD、PAL、CAT）的活性，证实诱导抗性是其主要作用机制。QUE-NPs具有制备简单、生物相容性高以及双重抗真菌和免疫增强效果，为防治 Zanthoxylum armatum 锈病提供了可持续且有效的策略，符合绿色农业和工业作物保护的目标。

**1. 引言**
Zanthoxylum armatum DC. 是一种重要的经济作物，可作为香料、油料和药用材料，种植历史已有2000多年（Fan等人，2025；Feng等人，2020；Luo等人，2022；Zhang等人，2021）。截至2024年，中国 Zanthoxylum armatum 的种植面积约为412万亩，年产值约为42-56亿美元（Chruma等人，2018；Luo等人，2022；Zhang等人，2021）。由 Coleosporium zanthoxyli 引起的锈病是该作物的主要且普遍存在的真菌病害，严重阻碍了产业健康发展（Han等人，2025；Shin等人，2019；Yang等人，2025）。该病害主要侵染叶片；在有利条件下，病叶率可超过90%，导致当年产量减少20%-60%，同时产品质量显著下降（Shin等人，2019；Yang等人，2025）。目前，防治 Zanthoxylum armatum 锈病仍主要依赖化学杀菌剂（Yang等人，2025）。虽然农药能快速控制病害，但长期依赖单一化学方法存在明显缺点：一方面，锈菌病原体在持续使用农药的选择压力下容易产生抗药性（Diao等人，2025；Han等人，2025；Yang等人，2025）；另一方面，化学残留物在环境中难以降解，破坏生态平衡并对食品安全构成潜在威胁（El-Abeid等人，2024；Kah和Hofmann，2014；Lowry等人，2019）。因此，在绿色农业的发展趋势下，迫切需要探索更可持续的预防和控制策略。

生物防治因环保性成为绿色控制领域的研究热点（Mapuranga和Yang，2026；Li等人，2025）。这项技术的核心是利用自然界中存在的有益微生物或其代谢物来抑制病原体（Mapuranga和Yang，2026）。迄今为止已鉴定出1000多种生物防治微生物，包括细菌、放线菌和真菌，为绿色控制提供了丰富的资源储备（Li等人，2025；Yang等人，2018；Zhang等人，2025；Zhao等人，2018）。然而，活生物防治剂在田间应用的效果往往不稳定且效率低下（Ahn等人，2025；Li等人，2025；Sui等人，2025）。这是因为复杂的田间条件（如温度、湿度、紫外线）会降低生物防治微生物的存活率和定殖能力（El-Abeid等人，2024；Lowry等人，2019；Sui等人，2025）。相比之下，生物防治微生物的代谢物具有更稳定的理化性质，受环境波动影响较小，应用效果更可靠，是目前生物防治产品中最成功的类型（Ahn等人，2025；Ma等人，2025；Schirra等人，2010；Yang等人，2018）。例如，广泛存在于植物和某些真菌中的黄酮类化合物能强烈抑制多种植物病原体，是优秀的绿色病害控制剂候选物质（Shen等人，2022；Wang等人，2022；Yang等人，2025）。尽管利用生物防治微生物及其代谢物进行植物保护是一个明确的研究方向，但针对 C. zanthoxyli 引起的 Zanthoxylum armatum 锈病的生物防治资源研究和应用几乎尚未展开（Yang等人，2025）。因此，系统筛选针对 Zanthoxylum armatum 锈病的生物防治微生物及其抗真菌代谢物至关重要，以突破化学控制的瓶颈，实现绿色、可持续的病害防治。

近年来，纳米技术在农业中的应用不断深入（Lowry等人，2019）。其中，将纳米材料设计为农药活性成分的智能控释载体已成为新一代环保农药研发的核心方向（Ma等人，2024；Ma等人，2025；Marmiroli等人，2021；Wang等人，2022；Zhao等人，2020）。与传统制剂相比，纳米载体体积小、表面积大、具有独特的量子效应，能显著提高活性成分的稳定性，实现靶向递送和控释，增强农药的抗光降解和抗氧化能力（Lowry等人，2019；Ocsoy等人，2013；Zhao等人，2020；Zhao等人，2018）。某些纳米材料可作为“免疫激活剂”，模拟植物细胞表面受体识别的病原体相关分子模式，从而激活基本免疫反应并触发一系列防御信号通路（El-Batal等人，2024；Narasimhamurthy等人，2022；Zhao等人，2020；Zhao等人，2018）。壳聚糖（CS）是一种天然多糖衍生物，作为纳米载体具有很好的生物相容性、可降解性和低毒性，能稳定地静电装载活性成分，并可作为植物防御诱导剂（El-Wahab等人，2025；Muthukrishnan等人，2019；Riolo等人，2026）。先前的研究表明，基于CS的纳米制剂能激活植物防御酶并促进抗病物质的合成，通过载体效应和诱导剂活性同时发挥作用，成功控制小麦条锈病等病害（Alabdallah等人，2023；Hembade等人，2022；Mapuranga和Yang，2026；Masmoudi等人，2023）。这为其在 Zanthoxylum armatum 锈病防治中的应用提供了重要理论基础。然而，尽管前景广阔，基于CS纳米载体的控释技术研究仍处于初期阶段（Shin等人，2019；Yang等人，2025）。目前尚缺乏关于优化 Zanthoxylum armatum 药物装载纳米颗粒的制备、理化特性和双重作用机制的系统报道，其防治效果仍需通过盆栽和田间试验验证（Shin等人，2019；Yang等人，2025）。深入探索这一领域将是将纳米技术的先进理念与 Zanthoxylum armatum 行业绿色控制实际需求联系起来的关键桥梁。

基于此背景，本研究选择了从生物防治真菌代谢物中筛选出的关键抗真菌代谢物槲皮素作为纳米制剂的有效成分。通过交叉链接方法制备壳聚糖纳米颗粒，并通过单因素实验结合人工神经网络模型优化了制备工艺，以包封效率（EE）、浊度和离心稳定性为核心指标。系统表征了纳米颗粒的理化性质，分析了其pH值和储存稳定性，通过体外抗真菌试验验证了其对 C. zanthoxyli 夏孢子萌发的抑制效果，并通过盆栽和田间试验评估了其对 Zanthoxylum armatum 锈病的实际防治效果。同时，通过检测叶片中的防御酶活性探讨了纳米颗粒诱导 Zanthoxylum armatum 病害抗性的机制。本研究旨在开发一种高效、环保的 Zanthoxylum armatum 锈病防治纳米制剂，明确其制备方法和效果，并为该病的生物防治提供理论和技术支持。

**2. 材料与方法**
2.1. 试验病原体和培养基
试验病原体 C. zanthoxyli 菌株 Cz03（GenBank登录号：NL4: MN608178.1；ITS：MN611081.1）从中国四川省锈病感染的 Zanthoxylum armatum 叶片分离获得，并在四川农业大学森林病理学实验室用20%（v/v）甘油于-80℃长期保存。实验前，该菌株在控制条件下（25±1℃、12小时光照/12小时黑暗、75±5%相对湿度）在健康的 Zanthoxylum armatum 幼苗上恢复生长。从大学 Zanthoxylum armatum 基地分离并纯化具有白色菌丝的锈病感染叶片中的拮抗菌株，通过水琼脂平板萌发法和无菌发酵液抗菌活性测定进行初筛和复筛，获得有效的生物防治菌株（命名为 HJ01，Ramularia collo-cygni）。通过形态学和分子生物学分析鉴定 HJ01（Ramularia collo-cygni）：扩增 ITS 基因并测序，通过 NCBI-BLAST 进行同源性比对（见补充图1A-E）。使用两种培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）用于 C. zanthoxyli Cz03 的分离、纯化和营养生长（pH 5.6–5.8，121℃/0.1 MPa灭菌20分钟）；水琼脂（WA）用于病原体孢子萌发，使用琼脂和无菌水配制并在相同条件下灭菌后倒入90毫米无菌培养皿中（45–50℃）。

2.2. 化学试剂和仪器
化学试剂和仪器的详细信息见补充文本1。

2.3. 药物筛选
使用实验室分离的生物防治菌株 HJ01 对 C. zanthoxyli 进行药物筛选。首先将 HJ01 接种到液体培养基中，在25℃、180 rpm条件下培养14天以获得发酵液；向发酵液中加入0.5 g夏孢子粉，然后转移到200 mL PDB培养基中，在25℃、130 rpm条件下培养7天，以无夏孢子的组作为对照进行代谢物差异筛选。LC-MS/MS分析在 Thermo Q-Exactive/plus 质谱仪上进行，使用 ACQUITY UPLC HSS T3 柱进行梯度洗脱；ESI 源用于正/负模式采集全扫描+DDA模式。数据通过 XCMS 软件预处理，代谢物通过 KEGG、HMDB 和内部数据库鉴定（质量偏差 < 10 ppm）。R 软件用于数据处理，显著差异代谢物通过 t 检验（P < 0.05）、FC > 1.2 和 PLSDA（VIP ≥ 1）进行筛选，随后进行富集分析。通过孢子萌发试验评估筛选出的代谢物的抗真菌活性：制备2×10?个/mL 的新鲜 Zanthoxylum armatum 锈病夏孢子悬浮液，将0.4 mg/L和4 mg/L的代谢物在1.3% WA平板上初筛。每个平板方格加入10 μL孢子悬浮液和20 μL代谢物；培养6小时后显微镜计数萌发的孢子以计算抗真菌率。

2.4. 槲皮素装载壳聚糖纳米颗粒（QUE-NPs）的制备
基于第2.3节筛选出的有效载体槲皮素，按照 Ahmadi 等人（2018）的方法制备 QUE-NPs，除非另有说明，所有操作均在室温（25±1℃）下进行。如图1所示，将壳聚糖溶解在1%（v/v）冰醋酸中，以600 rpm搅拌8小时，通过0.45 μm醋酸纤维素膜过滤，然后用0.1 mol/L NaOH调节pH至5.0进行质子化。将槲皮素制备在50%（v/v）乙醇中至0.5 g/L，与壳聚糖溶液混合，搅拌5分钟，在冰浴中间歇超声处理（200 W、40 kHz）2分钟，再搅拌30分钟。以1 mL/min的速度滴加2.0 g/L的三聚磷酸钠（TPP）溶液，继续搅拌45分钟形成淡蓝色的 QUE-NPs，随后在4℃下避光储存以供进一步使用。

**图1. QUE-NPs 的制备原理示意图**CS在冰醋酸中溶解时，其氨基proton化形成带正电荷的-NH??；槲皮素通过氢键与CS结合，随后TPP提供PO?3?，这些离子通过静电作用与CS的-NH??交联，从而将QUE包裹形成规则的球形QUE-NPs。2.5. QUE-NPs的浊度测定通过测量600 nm处的吸光度来确定QUE-NPs悬浮液的浊度。在测量之前，悬浮液在25 ± 1℃下进行间歇性超声处理（200 W，40 kHz）5分钟，以防止颗粒聚集和沉淀，并确保均匀分散。使用1 cm的光学路径石英比色皿，并用50%乙醇水溶液作为吸收度零点校准的空白对照。每个样品测量三次，平均吸光度作为QUE-NPs悬浮液的最终浊度指数。2.6. QUE-NPs的离心稳定性测定以50%乙醇水溶液作为空白对照，在25 ± 1℃下进行超声分散（200 W，40 kHz）5分钟后，将8 mL均匀悬浮液转移到10 mL无菌离心管中，在相同温度下以3000 rpm离心10分钟，然后吸取上层1 mL悬浮液进行吸光度测量。离心稳定性系数（K）通过公式计算：K = (A?/A?) × 100%（1），其中A?是离心前的悬浮液吸光度，A?是离心后的上层悬浮液吸光度。2.7. QUE-NPs的EE测定QUE-NPs的EE通过两个核心步骤确定：建立槲皮素标准曲线和定量游离槲皮素。标准曲线根据Qian等人的方法（Qian et al., 2025a）进行了修改。扫描槲皮素的UV吸收光谱，选择255 nm作为最佳检测波长（补充图2A）；将50%乙醇中的槲皮素标准品依次稀释至2.5–20 μg/mL，在255 nm处测量吸光度，得到线性回归方程y = 0.1778x + 0.222（R2 = 0.9952，补充图2B）。将5 mL的QUE-NPs悬浮液在4 ℃下以8000 rpm离心20分钟。测量上清液在255 nm处的吸光度，通过标准曲线确定游离槲皮素的质量（M?）。根据初始剂量计算总槲皮素质量（M?）。EE使用以下公式计算：（2）EE = [(M?? M?)/M?] × 100%。2.8. QUE-NPs的优化2.8.1. 单因素实验选择了三个因素进行单因素实验，包括CS质量浓度（A）、CS与TPP的比例（B）和槲皮素的装载能力（C）。每个因素的水平设置为：CS质量浓度（A）为0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 g/L；CS与TPP的质量比（B）为3:1、4:1、5:1、6:1和7:1；槲皮素的装载能力（C，定义为槲皮素与纳米粒子总质量的比值）为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5（通过调整纳米粒子系统的总质量并在槲皮素浓度固定为1 g/L的情况下确定）。根据第2.4节描述的协议制备QUE-NPs纳米粒子，默认固定参数如下：磁力搅拌速度为600 rpm，添加TPP后搅拌时间为45分钟，槲皮素浓度为1 g/L，CS与TPP的质量比为5:1（对于因素A），CS浓度为从因素A中筛选出的最佳值（对于因素B），CS浓度和CS与TPP的质量比为从因素A和B中筛选出的各自最佳值（对于因素C）。当改变一个因素时，其他参数保持不变。纳米粒子制备后，确定三个关键性质：EE、浊度和离心稳定性。2.8.2. 人工神经网络（ANN）建模从单因素实验获得的数据集进一步用于在Matlab R2024a中开发神经网络模型。通过使用ANN，我们分析了自变量（CS质量浓度、CS与TPP的质量比和槲皮素的装载能力）与因变量（包括EE、浊度和离心稳定性）之间的非线性关系。来自响应表面实验的45组数据随机分为训练集（76%）、测试集（12%）和验证集（12%）。ANN架构包括一个具有三个节点的输入层（对应于三个自变量）、一个通过迭代试验确定的优化神经元数量的隐藏层，以及一个具有三个节点的输出层（对应于三个因变量）。隐藏层中的神经元数量从4增加到20，以2为增量进行测试，并选择在验证集上具有最小均方误差（MSE）的配置，结果为12个神经元。隐藏层使用tansig（双曲正切Sigmoid）激活函数，输出层使用purelin（线性）激活函数。网络使用Levenberg-Marquardt反向传播算法进行训练，学习率为0.01，最大迭代次数为1000次（epochs）。基于验证误差应用早期停止以防止过拟合。使用决定系数（R2）和MSE评估模型的性能。2.9. QUE-NPs的表征有关表征方法的详细信息见补充文本2。2.10. QUE-NPs的稳定性测试2.10.1. 储存稳定性在2.8节所述的优化条件下制备QUE-NPs悬浮液。在储存0天、3天、5天、7天、9天和11天时，从每个温度组随机选取三个小瓶。在检测之前，每个悬浮液轻轻倒置10次。通过600 nm处的吸光度测定浊度，通过计算系数K确定离心稳定性。记录储存时间内的浊度和系数K的变化，以评估悬浮液的长期稳定性。2.10.2. pH稳定性准备了两个批次的优化QUE-NPs悬浮液。使用1 mol/L NaOH和HCl将pH调节至3、5、7、9和11，用精密pH计监测。调节后，悬浮液在25 ℃的水浴中孵育30分钟，然后测定浊度（以pH匹配的50%乙醇为空白对照）和离心稳定性。2.11. QUE-NPs对C. zanthoxyli urediniospores的抑制作用为了验证纳米粒子对C. zanthoxyli urediniospores萌发的抑制作用，以无菌水为空白对照。将10 μL的2 × 10? spores·mL?1 urediniospores悬浮液滴在水琼脂板上并均匀涂抹。然后分别将20 μL的CS溶液（0.1 g/L）、空纳米粒子溶液（0.1 g/L）和QUE-NPs溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）滴在孢子涂抹区域。所有平板在25 ± 1 ℃和75 ± 5%相对湿度下黑暗条件下培养24小时。培养后，计数每个视野中的总孢子和萌发孢子数量（萌发标准：菌丝长度>孢子直径的一半），并使用公式3计算抑制率（IR）：（3）IR (%) = [(Ns ? Ng)/Ns] × 100%，其中Ns表示总孢子数，Ng表示萌发孢子数。2.12. QUE-NPs对Z. armatum锈病的预防效果为了评估QUE-NPs对Z. armatum锈病的预防效果及其对叶片防御酶活性的影响，在温室中进行了盆栽实验。在人工接种C. zanthoxyli之前，用0.2、0.4、0.6和0.8 g/L的QUE-NPs喷洒均匀的、无病的1年生Z. armatum幼苗。在喷洒后的第2天、第4天、第6天、第8天和第10天采集叶片样本，并在?80 ℃下储存。然后测量超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的活性，包括空白对照。为了进一步分析槲皮素和壳聚糖纳米载体对植物免疫激活的单独和协同贡献，还添加了游离槲皮素（0.4 g/L）和空CS-TPP（0.4 g/L）的处理，分别在喷洒后第2天测定防御酶活性。将新鲜的urediniospores用含有0.2‰ Tween-20的无菌水制备成悬浮液，涂抹在叶片上，并保持高湿度。接种的幼苗在18 ℃和100%相对湿度下培养48小时，然后转移到最佳生长条件下。每隔5天喷洒一次QUE-NPs，每次喷洒后7天调查疾病发生率（DIE）和疾病严重程度（DIX）（补充表1）。DIE（%）的计算公式为：（4）DIE(%) = (Nd/Ns)×100%，其中Nd表示总孢子数，Ng表示萌发孢子数。DIX使用以下公式计算：（5）DIX=[∑(N?×V?+N?×V?+I+N?×V?)/(N?×V????)]×100%，其中N?表示疾病等级n的叶片数量，V?是疾病等级n的代表值，N?是调查的叶片总数，V???是最高疾病等级的代表值。2.13. QUE-NPs对Z. armatum锈病的治疗效果在均匀、无病的1年生Z. armatum幼苗上人工接种新鲜的C. zanthoxyli urediniospores，出现疾病症状后，用预防实验中筛选出的最佳浓度的QUE-NPs溶液喷洒叶片。健康的未接种幼苗作为阳性对照，用无菌水喷洒的病害幼苗作为阴性对照，共五个处理组，包括空白对照。在喷洒后的第2天、第4天、第6天和第8天采集叶片样本，按照2.12节的方法测定叶片防御酶活性。每7天重新喷洒一次最佳浓度的QUE-NPs溶液，并在每次喷洒后7天调查DIE和DIX。2.14.QUE-NPs对Z. armatum锈病防控效果的田间实验在四川农业大学崇州现代农业研发基地的Z. armatum锈病种植园进行了田间实验，在锈病症状出现前预防性地喷洒QUE-NPs制剂。采用随机完全区组设计（RCBD）以减少土壤异质性和微环境变化的影响。每个处理包含三个独立的生物学重复（不同的实验地块）。每个地块宽3 m，长5 m，总面积为15 m2。相邻地块之间有一个1.0 m的缓冲区，以防止喷雾漂移和地块间干扰。设置了五种处理（0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的QUE-NPs和清水作为对照），每种处理都在单独的地块中进行。稀释后的QUE-NPs均匀喷洒在叶片两面，每14天重新喷洒一次，并在每次施用后7天调查疾病情况。对于每个地块，随机选取10株代表性的Z. armatum植株。每个植株的四个方向各选取一个次级分支；在第一次喷洒后每7天进行定点和固定植株的调查，以记录Z. armatum锈病的DIE和DIX。2.15. 数据分析所有实验都进行了三次生物学重复，所有测试均重复三次；实验数据表示为平均值±标准偏差。使用SPSS 26.0软件（IBM? Corporation，美国加利福尼亚州圣何塞）进行统计分析，首先进行单因素分析（ANOVA），然后使用Tukey的诚实显著差异（HSD）检验比较各组之间的显著差异，P < 0.05视为具有统计学意义。ANN模型的设计和训练是通过MATLAB 2024a软件的Neural Network Toolbox?实现的（美国加利福尼亚州Portola Valley）。3. 结果与讨论3.1. 药物装载的筛选为了从HJ01菌株中识别抗C. zanthoxyli代谢物，本研究使用UPLC-MS/MS在病原体urediniospores诱导后对其代谢组进行分析，以未诱导的细胞作为对照。随后通过多维代谢组学分析筛选潜在的活性代谢物。在正式分析之前，使用合并的质量控制（QC）样本来验证检测系统的可靠性。QC样本的总离子电流（TIC）色谱图在所有色谱峰的峰面积和保留时间上显示出极好的重叠，峰高偏差≤20%，保留时间偏差≤0.1分钟（图1A）。主成分分析（PCA）显示了组内样本的良好聚类，而在urediniospore诱导组和对照组之间观察到了明显的分离趋势（图1B）。这直接表明urediniospore诱导显著改变了HJ01的代谢谱，导致两组之间存在显著的代谢差异。利用高通量代谢组学平台，通过应用p < 0.05和VIP > 1的筛选标准，共鉴定出348个显著差异的代谢物。火山图分析显示，在这348个代谢物中，186个上调（53.45%），162个下调（46.55%）（图1C）。这一结果清楚地描绘了HJ01在urediniospore诱导下的代谢表达变化特征，为后续的途径富集分析提供了明确的目标。层次聚类分析（HCA）进一步可视化了不同组之间差异 metabolites 相对丰度的变化，其中红色和蓝色分别代表高和低的相对丰度，从而明确了两组中各个 metabolites 的表达模式（图 1D）。下载：下载高分辨率图像（721KB）下载：下载全尺寸图像。图 1. 由 C. zanthoxyli urediniospores 诱导的 HJ01 的代谢组学分析及活性代谢物筛选。A: QC 样品 TIC 色谱图，验证检测可靠性。B: PCA 图显示组内聚类和组间分离。C: 火山图（红色：上调，蓝色：下调）。D: metabolite 丰度的 HCA 热图。E: KEGG 一级分类。F: KEGG 丰度气泡图。G: 抗真菌活性候选物检测。H: 针对 C. zanthoxyli 的有效成分筛选。为了阐明这些差异 metabolites 及其相关代谢途径的功能，使用 KEGG 数据库进行了富集分析，该数据库有助于将 metabolites 与其相应的途径和功能相关联。KEGG 一级分类显示，差异 metabolites 主要富集在代谢途径中，其次是生物系统途径，其他途径中的分布较少（图 1E）。气泡图（图 1F）显示 y 轴上的代谢途径，x 轴上的差异代谢物与总代谢物比例，气泡大小与富集计数成正比，颜色代表 q 值。这项分析确定了在 urediniospore 诱导下 HJ01 中发生显著变化的核心代谢途径。基于前述差异代谢物筛选结果，选择了 7 个关键候选物（包括 3-羟基黄酮、2-羟基丙酸、L-苯丙氨酸、香草素、香豆素和萜品醇），通过孢子萌发抑制实验评估其对 C. zanthoxyli 的抗真菌活性。实验结果表明，7 种物质（包括 3-羟基黄酮、乳酸、L-苯丙氨酸和香草素）具有较弱但可检测到的抗真菌效果（图 1G）。相比之下，萜品醇、香豆素和槲皮素的抗真菌活性更强，顺序为：槲皮素 > 茴品醇 > 香豆素（图 1H）。考虑到抗真菌效果和市场价格（补充表 2），槲皮素成为测试化合物中最为平衡的候选物（Chen 等，2022；Fan 等，2025；Wang 等，2022）。为了进一步评估槲皮素的应用潜力，我们将其关键属性与其他天然抗菌剂和合成杀菌剂进行了比较（补充表 2）。槲皮素具有成本效益（55–80 USD/kg），源自农业副产品，并被认定为安全。它对锈病、炭疽病、白粉病和柑橘绿霉病具有广谱抗真菌活性，且田间效果已得到验证（Chen 等，2022；Wang 等，2022）。与单靶点合成杀菌剂（如戊唑醇和阿唑肟）不同，后者存在众所周知的耐药性和残留风险（Diao 等，2025；Osman 等，2025；Xu 等，2025；Li 等，2025；Schirra 等，2010），槲皮素具有双重作用机制（直接抗真菌作用加上诱导耐药性），从而降低了耐药风险（本研究）。此外，其丰富的酚羟基使其能够与壳聚糖高效纳米化，正如这里所展示的那样。总体而言，这些优势使槲皮素成为控制 Z. armatum 锈病的实用且环保的候选物。

3.2. QUE-NPs 的制备过程与优化
3.2.1. 单因素研究
CS 浓度是调节纳米颗粒合成的关键因素（Hembade 等，2022）。如图 2A-C 所示，它对 QUE-NPs 的形成和性质有显著的调节作用。随着 CS 浓度从 0.5% 上升到 1%，QUE-NPs 的 EE 连续增加，在 1% 的浓度时达到近 70%。这是因为较高的 CS 浓度提供了更多的氨基团（-NH?），用于与 TPP 的离子交联，形成了更多结构完整的纳米颗粒，具有更强的药物载药能力（El-Wahab 等，2025；Narasimhamurthy 等，2022）。从图 2A 和 C 也可以看出，QUE-NPs 的 EE 和离心稳定性先增加后减少，在 CS 浓度为 1.0% 时达到峰值。这表明适当的 CS 浓度（0.75–1.25%）有利于构建粒径均匀且分散稳定性良好的纳米颗粒系统，此时系统的相对高浊度也反映了纳米颗粒的最大产量。然而，当 CS 浓度过高（>1.0%）时，溶液系统的粘度显著增加，阻碍了槲皮素分子在 CS 分子周围的迁移，导致槲皮素的 EE 下降（Muthukrishnan 等，2019；Qi 等，2004；Zhou 等，2022）。相反，过低的浓度会导致离子交联不足。这两种情况都不利于构建稳定的纳米输送系统，并容易引起颗粒聚集（Fan 等，2025；Xia 等，2025）。综合分析表明，1% 的 CS 浓度在 QUE-NPs 的高 EE 和良好的物理稳定性之间达到了最佳平衡，因此确定为 CS 的最佳制备浓度。

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图 2. QUE-NPs 制备过程的优化。CS 溶液浓度对 QUE-NPs 的 EE（A）、浊度（B）和离心稳定性（C）的影响；CS 溶液与 TPP 溶液的质量比对 QUE-NPs 的 EE（D）、浊度（E）和离心稳定性（F）的影响；槲皮素浓度对 QUE-NPs 的 EE（G）、浊度（H）和离心稳定性（I）的影响。本研究中使用的 ANN 模型架构（J）；开发的 ANN 模型的回归分析（K）；ANN 模型的训练性能（L）。

作为离子交联剂，较高的 TPP 相对含量（即较低的 CS 与 TPP 质量比）增强了与 CS 链上质子化的 -NH?? 的离子交联，形成了更密集的网络，从而更有效地包裹槲皮素（Moeini 等，2018；Zhou 等，2022）。如图 2D 所示，随着 CS 与 TPP 质量比的增加，QUE-NPs 的离心稳定性提高，因为 TPP 浓度的降低减弱了两者之间的分子间相互作用，导致系统颗粒大小减小（Moeini 等，2018）。如图 2E 所示，随着 CS 与 TPP 质量比的降低，系统的浊度持续显著增加。这是由于较高的 TPP 浓度增强了 CS 和 TPP 之间的分子间相互作用，导致纳米颗粒大小增加，从而降低了输送系统的稳定性（Ahmadi 等，2018；Yang 等，2018）。实验结果显示，当 CS 与 TPP 的质量比为 5:1 时，QUE-NPs 的 EE 达到最大值（84.85%），此时系统的离心稳定性和浊度也都处于相对稳定的状态。因此，选择这个质量比进行后续实验。

槲皮素的初始浓度是调节药物载药能力和输送系统稳定性的另一个关键因素（Qi 等，2004；Wang 等，2022）。如图 2G 所示，当槲皮素浓度在 0.1–0.2 g/L 范围内时，EE 增加，之后显著下降。这一结果与载体材料的有限载药能力和有效交联位点密切相关。在低药物浓度下，CS 分子链为槲皮素的有效包裹提供了足够的空间和位点，导致系统 EE 较高。相反，过高的药物浓度导致载体饱和。多余的槲皮素在系统中自由存在，导致 EE 显著下降（Fan 等，2025；Moeini 等，2018；Xia 等，2025）。如图 2G 和 H 所示，当槲皮素的初始浓度从 0.1 g/L 增加到 0.5 g/L 时，溶液变得浑浊，离心稳定性逐渐下降，这是由于溶液中的槲皮素含量超过了载体系统的载药能力（Hao 等，2020；Muthukrishnan 等，2019）。因此，在 0.1 g/L 的槲皮素浓度下获得了最佳效果。

3.2.2. ANN 对 QUE-NPs 制备系统的建模
图 2J 和解了为 QUE-NPs 制备系统构建的 ANN 模型的结构，独立变量和因变量都清晰标示。模型的输入层设有三个节点，对应于单因素实验中确定的三个关键制备参数：CS 质量浓度、CS 与 TPP 的质量比以及初始槲皮素浓度。输出层也设有三个节点，代表 QUE-NPs 的三个核心响应指标，即 EE（Y1）、浊度（Y2）和离心稳定性（Y3）。隐藏层中的最佳神经元数量通过迭代试错确定，使用训练、测试和验证数据集评估了不同神经元数量的网络架构。结果表明，隐藏层有 12 个神经元的网络架构在所有数据集中展示了最高的决定系数（R2）和最低的平均平方误差（MSE），表明该架构最适合 QUE-NPs 制备系统的建模分析（Qian 等，2025b）。如图 2K 所示，本研究中构建的 ANN 模型的训练过程表现出良好的稳定性。经过 20 次迭代后，训练集、验证集和测试集的 MSE 值都稳定下来，训练集和验证集之间的 MSE 差异很小，表明模型没有明显的过拟合或欠拟合（图 2L）。模型显示出强烈的线性相关性，R2 值分别为 0.9507（训练）、0.9645（测试）和 0.8509（组合）。这反映了模型预测值与实际实验数据之间的强线性相关性。模型的误差直方图（补充图 3A）大致符合正态分布，误差值在零周围对称分布，表明预测误差小且无偏（Qian 等，2025b）。模型的训练诊断图（补充图 3B）显示梯度值和 Mu 值都稳步下降，验证检查在第 6 代时达到了预设的停止标准，表明 ANN 模型稳定且有效收敛（Qian 等，2025b；Wang 等，2024）。这些表明本研究中构建的 ANN 模型的预测误差具有良好的随机性和一致性，模型中没有系统性偏差（Qian 等，2025b；Wu 等，2024）。ANN 模型预测的 QUE-NPs 最佳制备参数如下：CS 浓度为 1.05%，CS 与 TPP 的质量比为 5.51:1，槲皮素浓度为 0.09 g/L。实验验证表明，通过此过程制备的 QUE-NPs 在 EE、浊度和离心稳定性方面达到了最佳水平。因此，这套参数被确定为 QUE-NPs 的最终优化制备过程。

3.3. QUE-NPs 的表征
采用了多种表征方法系统地研究了优化后 QUE-NPs 的形态、结构、理化性质和制备效果。SEM（图 3A）显示 QUE-NPs 呈球形，尺寸均匀（数十纳米到数百纳米），表面光滑，分散性良好，证实了制备过程和纳米颗粒系统的稳定性（Hao 等，2020；Liu 等，2023；Xu 等，2024）。相比之下，原始槲皮素呈现典型的针状晶体结构，尺寸为微米级（补充图 4），与 QUE-NPs 的球形形态明显不同，证实了从晶体槲皮素到非晶纳米颗粒的成功转化。类似于封装未萌发孢子的壳聚糖-TPP 微珠（Moeini 等，2018），我们通过离子凝胶化制备的 QUE-NPs 表现出均匀的球形形态和良好的胶体稳定性。FTIR 分析了 CS、槲皮素、CS-TPP 和 QUE-NPs（图 3B）。CS 显示出 3397 cm?1（N-H 拉伸）、2873 cm?1（饱和 C-H 拉伸）、1600 cm?1（N-H 弯曲）和 1076 cm?1（糖苷 C-O-C 拉伸）的峰。槲皮素显示出 3405/3314 cm?1（酚 O-H 拉伸）、1665 cm?1（CO 拉伸）和 1610–1451 cm?1（芳香环拉伸）的峰。CS-TPP 的 N-H 和 C-O-C 峰移至 3496 cm?1 和 1153 cm?1，表明发生了交联引起的结构变化。QUE-CS-TPP 显示出 3531 cm?1 的峰，同时覆盖了 CS 的 N-H 和槲皮素的酚 O-H 峰，以及 1563 cm?1 的峰，与 CS-TPP 的交联结构一致。由于槲皮素的酚羟基与 CS 的氨基/羟基之间的相互作用，槲皮素的特征峰消失了，证实了成功的静电装载（Qi 等，2004；Wang 等，2022）。XRD 表征了槲皮素、空 CS-TPP 和 QUE-NPs 的晶体结构。槲皮素在 2θ 10°–30° 有多个尖锐的高强度衍射峰（结晶度好），而空 CS-TPP 仅在 ～2θ=20° 处有一个宽的漫射峰（非晶态）。 QUE-NPs表现出与CS-TPP几乎相同的图谱（在约2θ=20°处有一个宽的扩散峰），没有槲皮素特有的峰，这表明槲皮素成功被封装在CS-TPP中，处于无定形/分子状态，且QUE-CS相互作用抑制了槲皮素的结晶。槲皮素在纳米载体中的无定形状态提高了其分散性和生物利用度（Hao等人，2020年；Liu等人，2023年）。下载：下载高分辨率图像（945KB）下载：下载全尺寸图像

图3. QUE-NPs的特性分析。SEM图像和粒径分布（PSD）图（A）；CS、槲皮素、CS-TPP和QUE-NPs的FTIR光谱（B）；槲皮素、CS-TPP和QUE-NPs的XRD图谱（C）；槲皮素、CS-TPP和QUE-NPs的高分辨率C1s光谱（D）、O1s光谱（E）和N1s光谱（F）；CS-TPP和QUE-NPs的zeta电位（G）和粒径分布（PSD）图（H）；槲皮素、CS-TPP和QUE-NPs的水接触角（I）；槲皮素（J）、CS-TPP（K）和QUE-NPs的热特性分析（L）。

通过UV-Vis吸收光谱和荧光光谱进一步表征了QUE、空白CS-TPP和QUE-NPs的光学性质（补充图5）。在日光下，QUE悬浮液呈淡黄色，CS-TPP无色透明，而QUE-NPs呈浅黄色且略显浑浊，表明其分散稳定性良好。在365 nm紫外光照射下，CS-TPP显示出微弱的蓝色荧光，而QUE-NPs则表现出明亮的青色荧光，表明成功封装形成了新的复合体系（补充图5A）。UV-Vis吸收光谱（补充图5B）显示，游离态的QUE在紫外区域（200–400 nm）有强烈的吸收峰，CS-TPP在所有波长上的吸收都较低，而QUE-NPs显示出中等强度的吸收，证实了槲皮素已被加载到CS-TPP纳米载体中。荧光光谱（补充图5C）显示，游离态的QUE在400 nm处有强烈的发射峰，CS-TPP在425 nm处有微弱的发射峰，而QUE-NPs在400 nm处显示出红移的中等强度发射峰，表明由于 encapsulation 而发生了微环境变化。这些光学特性为QUE-NPs的成功制备提供了额外证据（Muthukrishnan等人，2019年）。

XPS（图2D-F）分析了C1s、O1s和N1s光谱以验证QUE-NPs的制备情况。C1s光谱显示284.82 eV处的C-C/C-H峰稳定，但QUE-NPs中的C-O/CO峰发生了位移。O1s光谱显示出一致的趋势，QUE-NPs的峰位于槲皮素和CS-TPP之间。N1s光谱显示QUE-NPs的峰相对于CS-TPP具有更高的结合能。这些变化证实了槲皮素和CS-TPP之间的电子相互作用以及QUE-NPs的成功制备（Hao等人，2020年；Qian等人，2025a）。如补充图6所示，游离态的槲皮素缺乏N1s峰，而QUE-NPs保留了特征性的C1s、O1s和N1s信号，证实了纳米粒子的复合性质。Zeta电位和粒径分析（图3G-H）显示，空白CS-TPP的粒径分布较宽（范围319.83 nm至615.14 nm；在396.06–458.67 nm区间体积占比为59.03%），平均粒径为446.4 nm（由于CS链的聚集）。QUE-NPs的粒径分布较窄（范围90.82 nm），平均粒径较小（207.4 nm，减少了53.5%）。这一粒径小于装载了硫胺素的壳聚糖纳米粒子（596 nm，Muthukrishnan等人，2019年），其封装效率（84.85%）与他们报道的值（90±3%）相当。这是由于QUE-CS相互作用（氢键和疏水效应）和增强的静电排斥作用，促进了膜穿透（Hao等人，2020年；Liu等人，2023年；Qi等人，2004年）。通过倒置稳定性测试进一步评估了QUE、CS-TPP和QUE-NPs的胶体状态和流动行为（补充图7）。倒置30秒后，游离态的QUE出现明显聚集并迅速沉淀，而CS-TPP仍保持透明液体状态。相比之下，QUE-NPs保持均匀的淡黄色外观，具有明显的胶体状态和良好的均匀性，表明纳米载体封装有效地提高了悬浮液的稳定性和加工性。进行了水接触角测量以表征QUE-NPs、空白CS-TPP和槲皮素的表面润湿性（图3I）。测试结果显示，槲皮素的水接触角为61.3±2.545°，CS-TPP为50.20±1.29°，QUE-NPs为47.5±0.1°，显示出槲皮素 > CS-TPP > QUE-NPs的显著趋势。QUE-NPs接触角的降低表明其在水介质中的表面亲水性和分散性得到改善，支持其在体内的应用（Hao等人，2020年；Tang等人，2024年）。

通过热重-差示扫描量热法（TG-DSC）评估了槲皮素、CS-TPP和QUE-NPs的热稳定性（图3J–L）。游离态的槲皮素经历了两个质量损失阶段：116°C时损失8.30%（水分蒸发）和358°C时损失58.80%（分子分解），剩余质量为32.91%，并在DSC图中伴随着明显的放热分解峰。CS-TPP在70°C时损失8.96%的水分，在234°C时主要分解，剩余质量为45.17%。对于QUE-NPs，初始水分损失在96°C时降至6.70%，主要分解发生在228°C，总质量损失为49.19%，剩余质量为44.11%（接近CS-TPP，远高于游离态的槲皮素）。值得注意的是，槲皮素特征性的高温分解峰（358°C）在QUE-NPs中消失了，证实了成功的封装。改变的热行为证实了槲皮素和CS-TPP之间的强相互作用，显著提高了装载槲皮素的热稳定性。

3.4. QUE-NPs的稳定性
3.4.1. pH稳定性
如图4A和B所示，QUE-NPs对pH变化非常敏感。在pH=3时，QUE-NPs的浑浊度显著降低，而离心稳定性增加。由于CS需要醋酸才能溶解在水中，过低的pH会导致CS在纳米悬浮液中的高离子化程度，从而使CS溶解在系统中（Moeini等人，2018年；Zhou等人，2022年）。因此，pH=3时槲皮素纳米悬浮液相对不稳定。浑浊度在pH=5时达到峰值，此时CS的氨基团完全 proton化为-NH??，从而与TPP磷酸根离子进行最佳的离子交联，产生粒径分布较窄的纳米粒子，增强光散射（Hao等人，2020年；Moeini等人，2018年）。同时，离心稳定性结果也与浑浊度的变化一致，在pH=5时达到最佳值。这证实了在pH=5时形成的纳米粒子具有较高的产量和良好的物理稳定性，能够抵抗聚集和沉淀（Hao等人，2020年；Moeini等人，2018年）。据报道，相对较高的pH会导致CS的构象卷曲，从而影响系统的稳定性（Moeini等人，2018年）。因此，CS对pH变化敏感，在pH 4–6的范围内相对稳定。

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图4. 不同pH值下QUE-NPs的浑浊度（A）和离心稳定性（B）；不同储存时间下QUE-NPs的浑浊度（C）和离心稳定性（D）。

3.4.2. 储存稳定性
QUE-NPs的储存稳定性如图4C和D所示。随着储存时间的延长，QUE-NPs的浑浊度增加，而离心稳定性降低。在4℃下，QUE-NPs的浑浊度从0.098上升到0.132，离心稳定性从72.46%下降到56.46%。相比之下，在25℃下储存的纳米粒子，浑浊度从0.111上升到0.138，离心稳定性从77.57%下降到49.87%。这些结果表明，在4℃下，浑浊度和离心稳定性的变化相对较小，说明QUE-NPs在这种储存条件下的稳定性较好。浑浊度的增加表明纳米粒子尺寸逐渐增大，而离心稳定性的降低反映了系统中粒子分布的减少（Aloui等人，2014年；Qi等人，2004年；Zhou等人，2022年）。在储存的前10天内，QUE-NPs的浑浊度和离心稳定性变化缓慢。然而，从第12天开始，25℃下储存的纳米粒子的浑浊度显著增加。这可能是由于粒子尺寸逐渐增大和分布不均，促进了聚集并进一步降低了稳定性（Qi等人，2004年；Zhou等人，2022年）。根据上述分析，QUE-NPs的最佳储存时间为4℃下13天，25℃下9天。值得注意的是，4℃下储存13天的QUE-NPs稳定性低于先前报道的几种基于壳聚糖的纳米制剂（Moeini等人，2018年；Zhou等人，2022年；El-Wahab等人，2025年），例如交联壳聚糖-瓜尔胶体系（25℃下60天）和柑橘油-壳聚糖脂质体（4℃下28天）。

这一限制可能源于两个因素。首先，封装依赖于非共价相互作用（氢键和静电作用），这些作用比共价交联更容易受到环境变化的影响，因为壳聚糖-TPP体系的稳定性强烈受pH和离子条件的影响（Moeini等人，2018年；Zhou等人，2022年）。其次，尽管额外稳定剂的添加有利于生物相容性，但可能会影响长期胶体稳定性。为了提高稳定性，未来的策略包括添加生物相容性交联剂如genipin或TPP，这些已被证明可以增强壳聚糖纳米粒子的结构完整性（El-Wahab等人，2025年）；使用丙糖醇或甘露醇等冷冻保护剂进行冻干，这是延长纳米粒子悬浮液保质期的常见方法（Muthukrishnan等人，2019年）；优化CS-TPP比例以实现更稳定的基质（Moeini等人，2018年）；或用亲水性聚合物如PEG进行表面修饰，以改善空间稳定性（Hembade等人，2022年）。这些方法目前正在研究中。

3.5. QUE-NPs对C. zanthoxyli孢子的体外效应
我们通过水琼脂平板法系统评估了QUE-NPs对C. zanthoxyli的抑制活性。如图5A–C和5J所示，在蒸馏水、CS溶液和CS-TPP组中，脲针孢子芽管的萌发抑制率均为0.00±0.00%，表明溶剂和纳米载体本身都没有表现出 antibacterial活性。这有效地排除了溶剂干扰和载体效应，确保了结果的准确性和可靠性，并证实观察到的脲针孢子芽管抑制作用完全归因于QUE-NPs。如图5D和J所示，浓度为0.10 g/L的QUE-NPs显著抑制了C. zanthoxyli的脲针孢子芽管萌发，表明其对这种病原体具有强力的 antibacterial活性。进一步观察图5D–J发现，随着QUE-NPs浓度的增加，IR显著增加，表明 antibacterial活性与有效QUE-NPs浓度之间存在正相关关系（Yang等人，2025年）。根据剂量-反应曲线，确定QUE-NPs对C. zanthoxyli脲针孢子萌发的半最大有效浓度（EC50）为0.47 g/L（补充图8）。

这个EC??值（0.47 g/L）与卡贝丹唑-壳聚糖纳米粒子对R. solani的 EC??（0.31 g/L，El-Wahab等人，2025年）相当，表明QUE-NPs具有强的抗真菌活性。这种浓度依赖性的抗真菌活性可能归因于较高浓度的QUE-NPs，它们与脲针孢子细胞膜发生更广泛的相互作用，从而破坏膜完整性和抑制代谢酶活性（Han等人，2025年；Yang等人，2025年）。这些发现为优化QUE-NPs的抗菌浓度和开发针对C. zanthoxyli的绿色控制剂提供了理论依据。

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图5. QUE-NPs的体外抗真菌活性
A：对照组（无菌水）中脲针孢子萌发的抑制；B：用0.10 g/L CS溶液处理的脲针孢子萌发的抑制；C：用0.10 g/L CS-TPP处理的脲针孢子萌发的抑制；D–I：用不同浓度（0.10–1.00 g/L）的QUE-NPs处理的脲针孢子萌发的抑制；J：不同处理对C. zanthoxyli脲针孢子萌发的抑制效应。

3.6. QUE-NPs对Z. armatum锈菌预防作用的 pot 实验
为了了解QUE-NPs如何诱导抗性，我们首先必须排除病原体自身引起的防御反应。这证实了QUE-NPs作为诱导剂，上调防御酶（SOD、POD、CAT、PAL）并使Z. armatum植物产生抗性（El-Abeid等人，2024年；Hembade等人，2022年；Narasimhamurthy等人，2022年）。在健康植物上喷洒该剂并追踪防御酶活性是验证诱导抗性的经典方法。这种方法可以将直接的抗真菌效果与植物免疫激活区分开来（El-Abeid等人，2024年；Narasimhamurthy等人，2022年）。因此，为了探讨QUE-NPs对Z. armatum防御酶活性的增强作用，本研究在不同的QUE-NPs浓度下喷洒在无锈菌的Z. armatum幼苗叶片上，并动态测量应用后的四种防御酶（SOD、POD、CAT和PAL）的活性（图6A）。结果显示，所有QUE-NP处理组的叶片中SOD、POD、CAT和PAL的活性显著高于对照组（图6B–E），表明QUE-NPs能够有效诱导防御酶活性的提高并激活Z. armatum的自我防御系统（El-Abeid et al., 2024, Narasimhamurthy et al., 2022, Ocsoy et al., 2013）。作为关键的活性氧（ROS）清除酶，POD还催化酚类化合物的氧化，其活性表现出以下变化（图6B）：在喷施后2天达到峰值，随后下降。同时，POD活性随着QUE-NP浓度的增加而先上升后下降，0.6 g/L的处理组在喷施后2天的POD活性最高，这表明在该浓度下Z. armatum叶片的防御活性最佳（Shi et al., 2025）。SOD广泛分布于植物细胞中，通过将超氧阴离子自由基（O??·）转化为分子氧（O?）和过氧化氢（H?O?）来构成第一道抗氧化酶防线（Kartika et al., 2025）。SOD活性的变化趋势与POD一致：都在喷施后2天达到峰值，之后下降，并在喷施后6天再次上升。这种回升可能是由于QUE-NPs的持续释放。其不断释放的生物活性成分重新诱导了SOD的上调，维持了植物的抗氧化防御（Kartika et al., 2025, Shi et al., 2025）。与POD类似，SOD活性在QUE-NP浓度为0.6 g/L时达到最大。CAT主要功能是分解H?O?并去除植物细胞内的过量H?O?以减少细胞毒性（Kartika et al., 2025）。其活性模式与SOD相同：在喷施后2天达到峰值，随后下降，然后在喷施后6天再次上升。这一结果进一步支持了QUE-NPs的持续释放特性，使其对植物产生持续和反复的诱导防御效果。PAL是苯丙素途径中的关键酶，促进一系列次级代谢物的合成，从而抑制病原体感染（Kartika et al., 2025）。其活性在QUE-NP应用后2至10天内呈“增加-减少-增加-减少”的波动趋势。这种波动进一步证实了QUE-NPs对Z. armatum的双重保护作用：它们不仅直接抑制病原体，还能以持久有效的方式激活植物的自我防御（Gholamnezhad, 2019, Kartika et al., 2025, Shi et al., 2025）。

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图6. QUE-NPs对Z. armatum锈病预防效果的盆栽实验
A：QUE-NPs对Z. armatum锈病预防效果的盆栽实验设计示意图；
B–E：不同浓度QUE-NP处理过的健康Z. armatum幼苗的植物防御酶活性变化；
F：盆栽实验中不同处理组的病情发生率；
G：盆栽实验中不同处理的病情指数；
H：接种病原体后3周不同处理组的植物表型。

为了阐明槲皮素和壳聚糖纳米载体在植物免疫中的单独和协同作用，在健康Z. armatum中比较了CK、游离QUE、CS-TPP和QUE-NPs的防御酶活性（POD、SOD、CAT、PAL）（补充图9）。单独使用CS-TPP显著提高了这四种酶的活性，证实了基于壳聚糖的纳米载体通过表面受体识别和下游信号传导有效触发基础防御反应。这种免疫增强行为已有充分文献记载；Liu等人（2026）报道，苯胺修饰的羧甲基纤维素席夫碱可增加水稻中的JA含量、CAT活性和叶绿素，从而诱导JA介导的防御和生长促进。同样，我们系统中的空白CS-TPP也激活了抗氧化和苯丙素途径。游离槲皮素也增强了防御酶水平，这归因于其自身的抗氧化能力和对苯丙素途径的增强作用，与其作为植物防御代谢物的作用一致。值得注意的是，QUE-NPs诱导的酶活性显著高于单独使用游离QUE或CS-TPP，显示出强烈的协同效应（补充图9A-D）。这种协同效应源于两个因素：（i）纳米载体增强了槲皮素的传递（溶解性、粘附性、持续释放）；（ii）CS-TPP增强了植物免疫力，而槲皮素增强了苯丙素防御。它们的联合作用持续增强了植物的抗性。这种双重功能设计——载体介导的传递加上活性免疫激活，代表了一种有前景的可持续策略（Liu et al., 2026）。因此，QUE-NPs通过直接的抗真菌活性和协同的免疫诱导作用实现了更强的病害控制。类似地，壳聚糖-水杨酸纳米颗粒预先激活了小麦中对黄锈病的PR基因和防御酶，支持了基于壳聚糖的纳米载体能有效增强植物免疫的作用（Hembade et al., 2022）。

为了进一步验证上述酶诱导作用是否能在实际中转化为对Z. armatum锈病的预防效果，用不同浓度的QUE-NPs预处理的植物被接种了C. zanthoxyli的夏孢子（图6A），并在接种后1–3周记录了DIE和DIX（图6F和6G）。结果表明，在锈病症状出现之前施用QUE-NPs显著降低了所有处理组的DIE（对照组发病率>84%）。随着QUE-NP浓度的增加，DIE和DIX均有所下降。在0.6 g/L的QUE-NP浓度下，DIE低于20%，DIX低于5%，表明具有优异的预防效果，这与之前观察到的最佳防御酶活性高度一致。然而，随着接种后时间的延长，所有处理的DIE和DIX均显著增加（图6F–H），表明尽管QUE-NPs具有较长的作用时间，但其预防效果仍有轻微下降。这种现象可能是由于剂浓度的降低和活性随时间的减弱。基于这些结果，施用适当的QUE-NP浓度（例如0.6 g/L及以上）对长期控制Z. armatum锈病具有重要的指导意义。

3.7. 容器实验：QUE-NPs对病发后Z. armatum锈病的治疗效果
为了进一步研究QUE-NPs在病发后对Z. armatum锈病的治疗效果和控制机制，选择0.6 g/L的QUE-NPs来验证患病植物的防御反应。设置了阳性对照（用无菌水处理的患者植物）和阴性对照（用无菌水处理的健康植物）（图7A）。结果（图7B–E）显示，在病发后喷施QUE-NPs显著提高了Z. armatum叶片中SOD、POD、CAT和PAL的活性（P：<0.05）。如图7B所示，QUE-NP处理组的SOD活性在第6天达到峰值（652.6 ± 17.04 U/g鲜重FW），然后趋于稳定。在阳性对照组中，SOD活性在接种后先下降后上升，但始终低于QUE-NP处理组。如图7C所示，阳性对照组中的POD活性在第4天达到峰值（7418 ± 152.44 U/g鲜重），然后缓慢下降。QUE-NP处理组中POD活性的变化趋势与阳性对照组大致一致，两者在后期均趋于稳定。如图7D所示，QUE-NP处理组中的CAT活性在喷施后2天达到峰值，随后逐渐下降，而阳性对照组中的CAT活性在接种后4天达到峰值。PAL活性的变化趋势与POD相似（图7E）。值得注意的是，在整个实验期间，阴性对照组中的SOD、POD、CAT和PAL活性一直保持在较低水平且没有明显波动，表明植物生长未受到其他干扰因素的影响，实验结果可靠（Gholamnezhad, 2019, Shi et al., 2025）。

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图7. 病发后QUE-NPs对Z. armatum锈病治疗效果的盆栽实验
A：病发后QUE-NPs对Z. armatum锈病治疗效果的盆栽实验设计示意图；
B–E：病发后不同处理组Z. armatum幼苗的植物防御酶活性变化；
F：盆栽实验中不同处理组的病情发生率；
G：病发后喷施不同浓度QUE-NP3周的植物表型。

为了进一步验证QUE-NPs对Z. armatum锈病的治疗效果，我们在锈病症状出现后对叶片喷施了不同浓度的QUE-NPs（图7A），并在喷施后1–3周记录了DIE和DIX（图7F和7G）。治疗应用显著降低了DIE（相对于阳性对照组的发病率>80%），且随着QUE-NP浓度的增加，DIE和DIX均有所下降。然而，治疗应用导致DIE和DIX随时间上升，其效果远低于预防应用（图7F–H），表明预防性喷洒对Z. armatum锈病更有效。盆栽实验证实，预防性应用（在病发之前）优于治疗性应用（在症状出现之后），且QUE-NPs的抑制效果随浓度增加而增强。0.6 g/L及以上浓度的QUE-NPs显示出最佳的控制效果。在症状出现之前的预防性喷洒显著降低了DIX并改善了控制效果，尽管效果随时间有所下降。这可能是由于在锈病发展中期和晚期该剂的作用有限。相比之下，症状出现后的治疗性应用显示出较低的控制效果，表明在锈病发展中期很难有效控制Z. armatum锈病。

3.8. QUE-NPs对Z. armatum锈病的田间控制实验
为了明确QUE-NPs在实际生产中对Z. armatum锈病的田间控制效果，使用了一块8年生的、已接种C. zanthoxyli但未出现病害症状的Z. armatum苗圃作为实验材料。喷施了不同浓度的QUE-NPs，以无菌水作为空白对照（CK）。在处理后1–6周调查了DIE和DIX（图8A）。结果显示，所有处理组中Z. armatum的DIE和DIX随时间的增加而显著增加，但所有QUE-NP处理组的DIE和DIX显著低于CK组（图8B和8C）。总体而言，QUE-NP对病原体的抑制效果随浓度的增加而增强，表明在病发之前预防性喷洒QUE-NPs可以有效降低DIX并改善田间控制效果。连续喷洒QUE-NPs后，控制效果随时间呈现下降趋势，表明当Z. armatum锈病发展到中期和晚期时，控制难度显著增加，杀虫剂控制效率受限。田间观察显示，与CK组相比，QUE-NP处理组的叶片病害严重程度明显减轻，落叶减少，夏孢子也被明显钝化（图8D-K）。从田间表现来看，QUE-NPs的预防性应用显著降低了Z. armatum锈病的发病率和病情指数。槲皮素的直接抗真菌作用和壳聚糖介导的诱导抗性共同作用，使QUE-NPs形成了高效、稳定且持久的病害控制系统。QUE-NPs的卓越田间表现与N-琥珀酰壳聚糖包封的查尔酮衍生物相当，后者对水稻鞘枯病的保护效果达到了80.9%，突显了基于壳聚糖的纳米农药在可持续病害管理方面的潜力（Xia et al., 2025）。

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图8. QUE-NPs对Z. armatum锈病的田间实验
A：QUE-NPs对Z. armatum锈病田间实验设计示意图；
B：田间实验中不同处理组的病情发生率；
C：田间实验中不同处理的病情指数；
D–E：对照组（D）和QUE-NP处理组（E）的落叶情况；
F–I：病发后3周对照组和QUE-NP处理组的叶片情况。

总之，QUE-NPs对Z. armatum锈病具有优异的田间控制效果，且随着农药浓度的降低，控制效果也会减弱。在田间生产中，通过在Z. armatum锈病症状出现之前喷洒较高浓度的QUE-NP可以实现理想的预防效果。该田间实验的结果与之前的盆栽实验结论高度一致，进一步证实了QUE-NP预防性喷洒对Z. armatum锈病的有效性，表明其防治效果具有稳定性和可重复性，并为实际生产应用提供了可靠的实验支持。

4. 结论
总之，纳米技术通过减轻杀真菌剂的抗药性和生态风险，为化学控制提供了一种绿色替代方案。本研究特别展示了其在有效管理Z. armatum锈病方面的潜力。通过对生物防治菌株HJ01代谢物进行UPLC-MS/MS代谢组学筛选，发现槲皮素是最佳的抗真菌成分，因为其效果优于其他候选物质且更具成本效益。我们通过离子交联成功制备了QUE-NPs，并通过单因素实验结合人工神经网络模型优化了制备过程。最佳条件（1.09%的CS，CS:TPP质量比为5.51:1，0.09 mg/L的槲皮素）获得了84.85%的效率。综合表征表明QUE-NPs呈规则的球形（207.4 nm），分散性均匀，槲皮素通过氢键和静电作用被加载到纳米载体上。纳米封装还将槲皮素从结晶状态转化为非晶状态，显著提高了其亲水性、稳定性和叶片吸收能力。QUE-NPs在pH 4–6范围内表现出最佳稳定性，可在4℃下储存13天（25℃下 ??9天），表面亲水性的提高（接触角减小）有利于田间应用。体外实验表明，0.8 mg/L的QUE-NPs抑制了88.81%的C. zanthoxyli乌雷迪尼孢子的萌发，而CS或CS-TPP本身没有抗真菌活性。在8年生的Z. armatum苗圃进行的盆栽和田间实验表明，0.6–0.8 mg/L的预防性喷洒效果优于治疗性喷洒，显著增强了防御酶（SOD、POD、CAT、PAL）的活性，同时具有稳定、可重复的效果且无植物毒性。虽然当前配方显示出良好的效果和生物相容性，但其有限的储存稳定性表明需要通过交联、冻干或表面修饰等策略进一步优化，以便于实际应用和商业化。QUE-NPs制备简单且环保，提供了一种新型的绿色控制策略。未来的研究可以针对CS进行改性或添加稳定剂，以延长室温储存时间，并整合疾病预测技术，优化锈病中后期的施用时机，进一步推动Z. armatum产业的绿色和可持续发展。

作者贡献声明：
李赵：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目协调、方法学研究、资金筹集、正式分析、数据整理。
兰玲：数据可视化、监督、项目协调、方法学研究、资金筹集。
袁瑶：数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目协调、方法学研究、资金筹集。
刘星冉：监督、软件使用、资源管理、方法学研究、调查、资金筹集。
刘星宇：数据可视化、监督、项目协调、调查、正式分析、数据整理、概念设计。
周子晨：数据可视化、验证、软件使用、资源管理、项目协调、资金筹集。
赖英明：数据可视化、验证、软件使用、项目协调、方法学研究、资金筹集。
陈光燕：验证、监督、资源管理、调查、数据整理。
杨春林：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、软件使用、资源管理、数据整理。
叶萌：数据可视化、监督、软件使用、资源管理、方法学研究、资金筹集、数据整理。
李书英：数据可视化、验证、软件使用、方法学研究、正式分析、数据整理。
李书江：验证、监督、软件使用、资源管理、方法学研究、资金筹集、正式分析、数据整理。
朱天慧：数据可视化、监督、软件使用、项目协调、资金筹集、数据整理、概念设计。
韩珊：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、调查、正式分析、数据整理、概念设计。