西洋参叶皂苷对植物病原真菌的抗真菌活性及其作用机制研究

《Industrial Crops and Products》：Antifungal activity and mechanistic insights of Panax notoginseng leaf saponins against plant pathogenic fungi

　　文嘉苑|刘嘉月|陈乔欢|李金鑫|刘大慧|万建波
澳门大学中医药科学院中医药质量研究国家重点实验室，澳门

**摘要**
植物产生的次生代谢物作为天然防御化合物，能够抵御病原体的侵害，因此成为环保型杀菌剂的潜在来源。我们最近在人参叶（PNL）中发现了一种复杂的两组分化学防御系统：通过酶解得到的总皂苷（TS-a）显示出比未水解的对应物（TS-b）更强的抗真菌活性。然而，TS-a的抗真菌谱及其作用机制尚未得到系统研究。在本研究中，我们评估了TS-a对多种植物病原真菌的抗真菌活性。TS-a在体外和体内实验中均表现出广谱活性，并且效力优于TS-b。机制研究表明，TS-a会破坏质膜完整性，促进活性氧的积累，并干扰线粒体的能量代谢。这些相互关联的作用机制最终导致膜损伤、代谢失衡以及真菌生长抑制。总体而言，这项研究表明TS-a通过多靶点机制发挥抗真菌作用，并且其效力依赖于特定病原体。这些发现突显了TS-a作为植物源杀菌剂开发候选物的潜力，支持其在可持续作物保护策略中的应用。

**1. 引言**
植物病原真菌对全球作物的产量和品质构成持续威胁（Fisher等人，2012年）。合成杀菌剂的广泛使用导致了病原体抗性的增加、环境污染问题以及非目标毒性（Tudi等人，2022年），这凸显了寻找替代控制方法的紧迫性（Akbari等人，2022年；Duke等人，2023年）。由于可生物降解性、结构多样性以及潜在的多靶点作用机制，植物源杀菌剂受到了越来越多的关注（Aioub等人，2024年；Zhou等人，2025年）。植物自然合成的多种次生代谢物具有抵御入侵病原体的化学防御功能（Elshafie等人，2023年）。与传统的合成化学物质相比，这些天然产物通常具有广谱生物活性且生态影响较低（Jamiolkowska，2020年）。然而，将这些生物活性代谢物转化为实用的抗真菌剂需要对其作用机制有更深入的了解。近期机制研究表明，许多植物源抗真菌化合物通过破坏病原体的细胞内稳态来发挥作用，尤其是诱导过度的氧化应激会导致膜损伤、代谢紊乱和细胞死亡。为了全面理解这些复杂反应，先进分析方法（如非靶向代谢组学）已被用于揭示化学胁迫下的动态代谢变化（Lang等人，2025年）。这些跨学科策略为识别分子靶点及阐明抗真菌机制提供了有力工具。

人参属（五加科）包含约17种植物，包括人参（P. ginseng）、三七（P. notoginseng）和五加（P. quinquefolius），具有很高的药用和经济价值（Shim等人，2021年）。其根部被广泛认为具有适应原性，可用于预防和治疗（Tian等人，2025年）。然而，人参属植物对环境条件非常敏感，需要阴凉、温暖和潮湿的生长环境（Chen等人，2016年）。漫长的栽培周期和严格的生长要求增加了它们感染病原体的风险（Yang等人，2018年）。人参皂苷是人参属植物的特征性三萜皂苷，具有物种和器官特异性的分布模式（Ma等人，2025年）。除了众所周知的药理活性外，人参皂苷还充当着重要的防御代谢物（Chen等人，2019年）。为了在保持有效防御的同时降低自毒性，植物经常以非活性形式储存次生代谢物，并在病原体攻击时选择性地激活特定的防御化合物（Mith?fer和Boland，2012年）。我们在三七叶中发现了这种复杂的防御系统，该系统由位于叶绿体中的β-葡萄糖苷酶（PnGH1）及其底物20(S)-protopanaxadiol型人参皂苷组成（Ma等人，2024年）。在正常生理条件下，这种酶和底物保持细胞内分离状态；当病原体分泌的外酶破坏叶绿体时，PnGH1被激活，催化去除人参皂苷C-3位点的葡萄糖，生成一系列极性较低的人参皂苷。重要的是，酶解后得到的总皂苷（TS-a）显示出比水解前的完整皂苷（TS-b）更强的抗真菌活性和更广的抑制谱（Ma等人，2024年）。尽管有这些有希望的发现，但TS-a的抗真菌谱仍未得到系统研究，其作用机制仍不清楚。因此，在本研究中，我们系统比较了TS-a和TS-b对多种植物病原真菌的抗真菌活性，并进一步探讨了它们增强活性的分子机制。我们的发现为酶激活的皂苷防御系统提供了机制见解，并支持基于内源性化学防御策略的植物源杀菌剂开发。

**2. 材料与方法**
**2.1. 病原真菌及培养条件**
本研究使用了17种植物病原真菌，包括Geotrichum candidum、Sclerotium rolfsii、Fusarium oxysporum、Fusarium oxysporum ZJ、Fusarium sporotrichioides、Fusarium solani、Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum aenigma、Colletotrichum spaethianum、Colletotrichum siamense、Colletotrichum fructicola、Botryosphaeria dothidea、Botrytis cinerea、Magnaporthe oryzae、Alternaria alternata、Stagonosporopsis ligulicola和Didymella glomerata。这些菌株均由刘大慧教授（湖北中医药大学）提供，并已在实验室菌株库中鉴定。培养物在28°C下于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上维持。所选真菌代表了威胁全球粮食安全和高价值工业作物的多种重要病原体，选择依据包括它们巨大的经济影响、多样的感染策略（土传和叶传）以及广泛的宿主范围。具体包括对主粮作物造成严重威胁的Magnaporthe oryzae（Wilson和Talbot，2009年），以及导致多种植物大量减产的Botrytis cinerea（Bi等人，2023年）。此外还包括引起维管萎蔫和根腐病的土壤传播病原体Fusarium oxysporum（Gordon，2017年）和Sclerotium rolfsii，以及显著降低园艺和经济重要作物产量的叶传和果传病原体（如Colletotrichum属和Alternaria alternata）（Réant等人，2026年）。

**2.2. TS-a和TS-b的制备**
PNL样本采集自中国云南文山地区的栽培基地。TS-a和TS-b的制备方法如前所述（Liu等人，2019年）。制备TS-a时，将60克干燥的PNL粉末浸泡在1000毫升50°C的水中过夜，使主要的人参皂苷完全水解，然后室温下进行超声提取（50 Hz，每次1小时，共三次）。提取液在50°C下减压浓缩。制备TS-b时，将60克PNL粉末在常压下蒸煮30分钟以灭活内源性酶，再在相同超声条件下进行超声提取。每种粗提物用D101大孔树脂（东虹化工有限公司）纯化，然后用清水洗涤去除极性杂质，随后用60%（v/v）乙醇洗脱皂苷。洗脱液浓缩后冷冻干燥得到纯化的TS-a和TS-b样品（Liu等人，2018年；Liu等人，2025年；Ma等人，2022年）。

**2.3. 体外抗真菌活性测定**
采用菌丝生长速率法在PDA平板上评估抗真菌活性。TS-a或TS-b以最终浓度4.0 mg mL?1加入PDA平板中，使用0.25%（v/v）DMSO作为溶剂。含有0.25% DMSO的平板作为空白对照，200 μM的卡巴津作为阳性对照。将活跃生长的菌丝圆盘（直径5毫米）置于每个平板中心，并在28°C下孵育。每天测量菌丝直径。菌丝生长抑制率根据以下公式计算：
**抑制率（%）= (Dcontrol ? Dtreatment) / Dcontrol × 100**
其中Dcontrol和Dtreatment分别表示对照组和处理组的平均菌丝直径。

使用0.25% DMSO制备含有TS-a或TS-b的PDA平板，浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mg mL?1。接种和孵育条件与上述相同，每个浓度重复三次（Azma等人，2023年）。使用IBM SPSS Statistics 27.0进行抑制率与对数浓度的线性回归分析，以获得回归方程、决定系数（R2）、95%置信区间和半数有效浓度（EC??）。

**2.4. 体内抗真菌效力测定**
菊花品种Fubaiju的叶子每天三次喷洒不同浓度的TS-a或TS-b（? EC??、EC??或2 × EC??），连续三天。使用0.25% DMSO水溶液和200 μM的卡巴津溶液作为空白对照和阳性对照（Ma等人，2024年）。由于三萜皂苷具有促进叶片表面湿润和黏附的天然表面活性剂特性，因此未添加额外的合成表面活性剂或稀释剂。每片叶子接种5毫米大小的S. ligulicola菌株，然后在高湿度条件下培养。接种五天后使用0–5的疾病指数评分标准（Cai等人，2025年）评估病情严重程度：0表示无可见病斑；1表示病斑面积≤总叶面积的5%；2表示病斑面积6–25%；3表示病斑面积26–50%；4表示病斑面积51–75%；5表示病斑面积>75%或叶片脱落。疾病指数计算公式为：
**疾病指数（%）= ∑ni × vi / N × Vmax × 100**
其中ni是每等级的叶片数量，vi是对应的等级值，N是评估的叶片总数，Vmax是最高疾病等级。

**2.5. 扫描电子显微镜（SEM）**
根据EC??结果，选择Magnaporthe oryzae和S. ligulicola进行进一步机制分析。从对照组和TS-a或TS-b处理组（4.0 mg mL?1）中切割约5 × 5毫米2的组织切片。样本在4°C下用戊二醛固定24小时，用PBS（pH 7.2–7.4）冲洗，然后通过逐步乙醇系列（30–95%）脱水。脱水后的样本在-80°C下预冷冻，冻干，喷金后用JSM-6390LV扫描电子显微镜（JEOL有限公司，东京，日本）观察菌丝表面形态。

**2.6. 质膜完整性和通透性**
使用碘化丙啶（PI）染色法评估质膜完整性（Bai等人，2024年）。将Magnaporthe oryzae和S. ligulicola的菌丝圆盘（直径5毫米）在28°C下摇动培养72小时，然后用TS-a或TS-b处理（浓度为? EC??、EC??或2 × EC??）24小时。处理后，收集菌丝，用PBS（pH 7.2–7.4）洗涤三次，再悬浮在PBS中。样品在室温下用PI（5 μL）染色15–20分钟，然后在荧光显微镜下观察。PI荧光强度用于指示质膜完整性。

**2.7. 细胞核酸和蛋白质泄漏**
将新鲜菌丝（1.0克）在含有TS-a或TS-b（浓度为? EC??、EC??或2 × EC??）的30毫升蒸馏水中培养2小时（25°C）。离心（12,000 rpm，10分钟）和过滤（0.22 μm）后，测量上清液的吸光度（260 nm和280 nm），以确定核酸和蛋白质的泄漏情况（Grotto等人，2009年）。所有实验重复三次。

**2.8. 菌丝中ROS和MDA含量**
使用DCFH-DA染色法测定细胞内ROS水平（Gong等人，2025年）。处理24小时后，收集菌丝，用预冷PBS（pH 7.2–7.4）洗涤，并在室温下与10 μM DCFH-DA共孵育30分钟。去除多余探针后，用荧光显微镜观察并评估ROS积累情况。

**2.9. 可溶性蛋白质和酶活性**
按照上述方法培养和处理真菌。菌丝（约0.1克）在PBS或适当提取缓冲液中冰上匀浆，离心（8000 × g，10分钟，4°C）。上清液中的可溶性蛋白质含量是使用BCA蛋白质测定试剂盒测定的，以牛血清白蛋白作为标准品，并按照制造商的说明进行操作。抗氧化酶（包括过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）以及呼吸酶（包括琥珀酸脱氢酶（SDH）和NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）的活性也是根据制造商的协议使用商业测定试剂盒测量的。

2.10. 转录组和qRT-PCR分析
S. ligulicola在PDB中培养72小时后，分别用TS-a（2 × EC??）或DMSO（对照组）处理另外72小时。总RNA使用Tritol提取，每种处理三个生物学重复样本进行分析。RNA测序和初步数据处理由北京生物标志物技术有限公司完成。文库在Illumina高通量平台上使用双端150 bp（PE150）策略进行测序。每个样本至少生成了5.98Gb的干净数据，所有样本的Q30值≥93.36%。随机选择了四个差异表达基因通过qRT-PCR进行验证。RNA被反转录成cDNA，qRT-PCR使用SYBR Green化学试剂进行。相对表达水平使用2?ΔΔCt方法计算，以ade13作为参考基因。所有测定均重复三次。

2.11. 统计分析
数据以平均值±标准差（SD）表示。在单因素方差分析（ANOVA）之前，使用Shapiro–Wilk检验和Levene检验评估数据的正态性和方差齐性。事后比较使用Duncan的多范围检验（SPSS 27.0）。差异在P<0.05时被认为是显著的。

3. 结果
3.1. TS-a和TS-b的化学组成
TS-a和TS-b都富含20(S)-protopanaxadiol型皂苷（图1A），并且在我们的实验室中通过转化后用微孔树脂纯化制备。它们的化学特性有明显差异（图1B）。TS-b主要由完整的皂苷组成，包括G-Rb3、G-Rc、G-Rb2、G-Rb1和G-Rd，其特征是在C-3位置有β-(1→2)糖苷键。相比之下，TS-a主要含有水解的皂苷，如NG-Fd、NG-Fe、G-Rd2、GYP-XVII和G-F2，这些皂苷是由于C-3位置的β-(1→2)糖苷键区域选择性断裂而产生的。在两种组分中都检测到了在C-3位置带有Glu–Glu–Xyl糖链的耐水解皂苷（例如NG-Fa、NG-Fp2和NG-Fc）。

3.2. TS-a在体外的抗真菌活性优于TS-b
体外实验显示，对照组中菌丝生长旺盛，而TS-a和TS-b都显著抑制了真菌生长（图S1，表S1）。抗真菌效果因病原体而异。两种处理对叶部病原体C. gloeosporioides的抑制作用相对较高（TS-a为80.47 ± 2.44%；TS-b为76.17 ± 1.35%），但对土传病原体S. rolfsii的抑制作用较低（分别为48.67 ± 14.22%和27.33%），这表明TS-a对叶部真菌更有效。在相同的浓度4 mg mL?1下，TS-a对不同真菌种类的抗真菌活性始终优于TS-b。TS-a对G. candidum、F. sporotrichioides、M. oryzae和A. alternata的抑制率显著更高，并且在浓度为4 mg mL?1时完全抑制了S. ligulicola和C. aenigma。

3.3. TS-a对S. ligulicola提供了强效的体内保护
基于其在体外的强活性，评估了TS-a和TS-b对感染福柏菊花叶片的保护和治疗效果，以羧苯唑胺（carbendazim）作为阳性对照（图3）。值得注意的是，在体内所需的浓度高于体外，这可能是由于叶片表面的复杂环境和植物角质层的屏障作用。在这种条件下，羧苯唑胺的病害指数为22.22%，而TS-a在2 × EC??（1.40 mg mL?1）时将病害指数降低到了13.33%。在相同浓度下，TS-a始终比TS-b产生更低的病害指数，这证实了TS-a在体内的抗真菌活性更强。

3.4. TS-a引起严重的结构损伤和质膜破坏
为了阐明细胞结构损伤是否有助于抗真菌活性，在用TS-a或TS-b处理后检测了S. ligulicola和M. oryzae的形态变化和质膜完整性。扫描电子显微镜（SEM）显示，暴露于4 mg mL?1 TS后出现了明显的超微结构异常（图4）。在对照组中，两种真菌的菌丝表面光滑，结构完整。在S. ligulicola中，TS-a导致表面粗糙、纵向褶皱和不规则沟槽，表明细胞壁结构严重受损。TS-b导致菌丝断裂和表面沉积，但结构变形相对较轻。在M. oryzae中，TS-a处理导致菌丝肿胀、塌陷和收缩，而TS-b仅引起局部肿胀。总体而言，TS-a在两种病原体中造成的结构损伤更为严重。

3.5. TS-a引发ROS积累并导致广泛的细胞功能障碍
使用DCFH-DA荧光探针量化了细胞内的ROS水平（图5B）。DCFH-DA在细胞内水解成非荧光的DCFH，随后被ROS氧化形成荧光DCF；因此，荧光强度与细胞内的ROS水平呈正相关。在S. ligulicola和M. oryzae的对照菌丝中仅观察到微弱的绿色荧光，表明基础ROS水平较低。TS-a或TS-b处理后，两种真菌的荧光强度和分布均随浓度增加而增强，表明ROS积累增加。在相同浓度下，TS-a产生的荧光显著强于TS-b，表明其诱导氧化应激的能力更强。

3.6. TS-a更强烈地抑制抗氧化酶和线粒体酶活性
为了进一步评估代谢紊乱，测量了S. ligulicola在处理72小时后的抗氧化酶（SOD、POD和CAT）和线粒体代谢相关酶（SDH和NADP-MDH）的活性（图7）。采样时间线反映了真菌应激的动态：24小时用于急性细胞事件（例如膜破坏），72小时用于下游反应，包括抗氧化平衡和代谢重编程。在抗氧化酶中，CAT活性随着TS-a和TS-b浓度的增加而逐渐下降。POD活性在TS-a处理下稳步下降，而在TS-b处理下在低浓度时下降，在高浓度时上升。SOD活性对TS-a呈双相响应（初期增加后下降），而在TS-b处理下则持续上升。这些模式表明TS-a更强烈地破坏了真菌的抗氧化防御系统，特别是在高浓度下。关于线粒体酶，NADP-MDH活性在两种处理下均无显著变化。相比之下，SDH活性在TS-a和TS-b处理下均显著下降，其中TS-a的抑制作用更为明显。这些结果 collectively表明TS-a更强烈地抑制了抗氧化能力和线粒体功能，进一步加剧了氧化应激和代谢紊乱。

3.7. 转录组分析揭示了TS-a的分子靶标
为了阐明TS-a抗真菌活性的分子基础，用TS-a在2 × EC??（1.40 mg mL?1）处理S. ligulicola菌丝，随后进行RNA-seq分析，以DMSO处理的样本作为对照。共鉴定出1347个差异表达基因（DEGs）（|log?变化| ≥ 2，FDR ≤ 0.01），包括505个上调基因和842个下调基因（图8A）。基因本体论（GO）富集分析显示，在生物过程、分子功能和细胞组分类别中与膜相关的术语显著过表达。高度富集的术语与跨膜运输和转运蛋白活性相关，表明膜相关功能受到显著干扰（图8B）。KEGG途径分析进一步突出显示了跨膜运输途径，其中ABC转运蛋白是受影响基因的最大群体。几个ABC转运蛋白基因显著下调（-2.44至-3.18倍）（图8C-D）。由于ABC转运蛋白作为膜嵌入的泵，它们的抑制表明膜运输能力受损和通透性改变。此外，包括柠檬酸循环（TCA循环）和氧化磷酸化在内的关键能量产生途径也显著受到抑制，分别有14个和8个关键基因下调。这些结果表明，膜运输、线粒体能量代谢和DNA修复途径在TS-a处理下受到广泛抑制。这些分子变化与观察到的膜损伤、活性氧（ROS）积累和代谢障碍是一致的。下载：下载高分辨率图像（978KB）下载：下载全尺寸图像图8. S. ligulicola经TS-a处理后的转录组分析。(A) 差异表达基因（DEGs）的数量；(B) 前10个富集的基因本体（GO）生物学过程术语；(C) 与跨膜运输相关的DEGs的热图；(D) 与运输相关的DEGs的KEGG通路富集。(E) 通过RNA-seq和qRT-PCR验证选定的DEGs。3.8. 通过RT-qPCR验证转录组数据为了验证RNA-seq结果的可靠性，基于它们的统计显著性（|log?倍变化| ≥ 2，FDR ≤ 0.01）和与观察到的抗真菌表型的生物学相关性，选择了四个DEGs进行RT-qPCR验证。鉴于转录组和生理分析表明膜运输有显著破坏，优先考虑了来自富集的ABC转运蛋白途径的三个基因（TRINITY_DN1702_c0_g3、TRINITY_DN3539_c0_g4和TRINITY_DN3929_c0_g2）。为了确保涵盖其他受影响的途径，还包含了一个参与花生四烯酸代谢的基因（TRINITY_DN955_c0_g3），该途径与ROS积累和脂质代谢功能障碍相关。TRINITY_DN6076_c0_g1编码腺苷琥珀酸酶（ADE13），因其在本研究中的表达稳定（|log?倍变化| < 1；观察值= 0.63）而被用作参考基因。RT-qPCR的结果显示表达模式与RNA-seq数据一致（图8E），从而证实了转录组分析的可靠性。4. 讨论本研究证明，TS-a（PNL的水解皂素）对多种植物病原体表现出广谱抗真菌活性，并且其效力始终高于未水解的皂素。这种增强的生物活性与其结构修饰密切相关。酶促水解会从皂素骨架中去除特定的外糖基团，改变其分子两亲性。通过修饰关键结构基团来优化生物活性化合物已被广泛认为是提高抗菌活性的有效策略（Liao等人，2026年）。在我们的研究中，水解可能增加了TS-a对脂质双层的亲和力，从而促进了与真菌膜的更强相互作用和渗透。因此，TS-a更有效地启动了多靶点的抗真菌级联反应。膜破坏似乎是主要事件。TS-a提高了膜的通透性，导致核酸和蛋白质的泄漏，并改变了与膜相关的基因的转录，特别是那些参与跨膜运输的基因。这些发现与先前的研究一致，即三萜皂素（如Sapindus mukorossi中的皂素（Huang等人，2024年）和七叶皂苷（Trdá等人，2019年）能够破坏真菌膜并触发氧化反应。这种模式在不同结构的皂素中的重复出现表明，针对膜可能是植物来源的三萜皂素的一种保守的抗真菌机制。一个有趣的观察是，TS-a对叶部病原体的抑制作用比土壤传播的病原体更强。这种差异敏感性可能反映了膜甾醇组成和解毒能力的差异。皂素的活性与真菌膜甾醇谱密切相关；含有较高麦角甾醇含量的物种通常更易受影响，而具有独特脂质组成的生物，包括某些根部相关的卵菌，往往表现出内在耐受性（Morrissey和Osbourn，1999年）。生态适应也可能起到作用。尽管皂素作为抗菌防御化合物，但越来越多的证据表明它们参与了植物-病原体信号传导过程（Escaray等人，2024年）。某些真菌，包括Botrytis cinerea和一些Fusarium物种，能够代谢或耐受三萜皂素。长期暴露是否能使TS-a发生适应性代谢，对于实际应用来说是一个重要的考虑因素。未来研究通过检查降解动力学以及敏感和不太敏感物种之间的比较转录组或代谢组反应，将有助于阐明病原体依赖的变异性和长期适应性潜力。机制数据支持抗真菌作用的级联模型。TS-a与真菌质膜的初始相互作用增加了膜的通透性并破坏了细胞稳态。随后的线粒体功能障碍，表现为SDH活性降低，与过多的ROS积累有关。SOD活性的双相模式进一步揭示了这一过程：初始的增加表明对早期ROS升高的适应性反应，而在较高浓度下的下降则表明在严重氧化应激下抗氧化能力耗尽。升高的ROS可能增强脂质过氧化，进一步破坏线粒体功能，从而加剧代谢障碍。调节细胞内氧化平衡越来越被认为是天然生物活性化合物活性的核心机制（Quan等人，2025年）。在这个背景下，膜破坏、氧化应激放大和代谢障碍似乎形成了一个自我强化的循环，最终抑制了菌丝生长并损害了细胞活力。TS-a与TS-b在结构、生理、酶学和转录组分析中的一致更强效果支持了这一综合机制。从应用的角度来看，TS-a对17种植物病原体的活性突显了其作为植物杀菌剂候选物的潜力。多靶点天然产物相比单一作用点的合成杀菌剂，可能降低抗药性发展的可能性，有助于可持续的疾病管理。然而，仍存在一些限制。本研究未评估其对非目标生物的毒性、环境持久性和田间效力。在实际应用之前，需要进行全面的安全评估和配方优化以提高稳定性和生物利用度。总之，这项工作系统地描述了水解PNL皂素的广谱抗真菌活性和多靶点机制。未来的研究应侧重于将实验室发现与田间应用相结合，包括配方开发（例如纳米乳液），以提高环境稳定性和递送效率。将这些多靶点植物制剂整合到综合害虫管理计划中，可能提供一种有效的策略来减缓抗药性发展并促进可持续的作物保护。CRediT作者贡献声明Wan Jian-Bo：写作 - 审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。Liu Jia-Yue：可视化、方法学、研究。Yuan Wen-Jia：写作 - 原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据管理。Chen Qiao-huan：验证、方法学。Liu Da-Hui：监督、项目管理。Li Jin-Xin：方法学。