《International Journal of Biological Macromolecules》：Functional analysis of the C-terminal positive region in an archaeal GH46 family chitosanase
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Xiangyu Zi|Jia Ye|Qing Xu|Xiaolong Sun|Yongqian Fu|Yao Chen中国台州市台州大学生命科学学院生物质功能材料开发与应用重点实验室，318000摘要古菌酶通常具有独特的结构特征。在此，我们从Methanosarcina ther
Xiangyu Zi|Jia Ye|Qing Xu|Xiaolong Sun|Yongqian Fu|Yao Chen
中国台州市台州大学生命科学学院生物质功能材料开发与应用重点实验室，318000
摘要
古菌酶通常具有独特的结构特征。在此，我们从Methanosarcina thermophila中鉴定出一种壳聚糖酶mtCsn46，该酶的C端含有带电延伸结构。实验结果表明，带电区域（PR）在酶的功能中起着关键作用。分子动力学（MD）模拟显示，PR位于底物结合口袋之上，有助于底物水解并增强相互作用，从而提高壳寡糖的聚合度。合理设计的Q19E突变增强了PR与酶核心之间的相互作用，提高了结构稳定性并提升了最佳工作温度。尽管底物亲和力有所下降，但酶活性几乎增加了2倍，其Vmax为4129.00?μmol?L?1?min?1。MD分析表明，Glu19与Lys244和Lys245形成了稳定的盐桥，这解释了稳定性的提升。这些发现阐明了古菌壳聚糖酶中独特C端延伸的结构意义，并为酶工程提供了基于结构的策略。
引言
壳聚糖酶（EC 3.2.1.132）在壳寡糖（COS）的工业生产中起着关键作用[1]，由于壳寡糖具有多种生物活性以及在食品[2]、农业[3]和生物医学[4]领域的广泛应用，因此受到了越来越多的关注。壳聚糖酶被归类为几种糖苷水解酶（GH）家族，包括GH3、GH5、GH7、GH46、GH75和GH80[5]，并广泛分布于Bacillus[6]、[7]、Streptomyces[8]、[9]、[10]和Aspergillus[11] [12]等菌株中。此外，新证据表明古菌中也存在壳聚糖酶，进一步扩展了它们的系统发育多样性。Jia等人从Methanosarcina sp. 1.H.T.1?A.1中克隆并表征了一种古菌壳聚糖酶OUC-CsnA4[13]，通过合理蛋白质设计实现了24–26%的(GlcN)?产量，展示了古菌酶在COS生产中的潜力。
然而，大多数天然存在的壳聚糖酶催化效率较低且热稳定性有限，这限制了它们在工业过程中的直接应用。为了克服这些限制，人们广泛采用了诸如合理设计[14]、[15]、[16]和定向进化[1]、[18]、[19]等蛋白质工程策略。虽然大多数工程研究集中在催化域内的突变上，但越来越多的证据表明，非催化区域（尤其是独特的N端或C端延伸结构）也可能对酶的性能起着关键作用。例如，Tong等人证明，GH8家族壳聚糖酶BcCn8A中的保守N端区域对催化活性和底物结合至关重要[20]。对于来自古菌的壳聚糖酶，一些酶具有独特的功能特性。GH46家族的壳聚糖酶OUC-CsnA4[13]倾向于产生聚合度较高的COS。作为迄今为止唯一报道的来自古菌的壳聚糖酶，OUC-CsnA4其独特性质的机制基础尚不清楚。
然而，在这项研究中，我们鉴定出一种与OUC-CsnA4属于同一家族的壳聚糖酶，它来自同属Methanosarcina thermophila，将其命名为mtCsn46。与OUC-CsnA4不同，mtCsn46的C端具有独特的结构，而其N端结构与BcCn8A相似，暗示了可能的特殊功能。在本研究中，我们结合实验方法和分子动力学（MD）模拟来揭示其C端带电区域的潜在作用。该研究还为研究古菌壳聚糖酶中非典型C端或N端延伸的结构功能提供了方法论框架。
节选
壳聚糖和标准COS
本研究中使用的壳聚糖购自Macklin（上海Macklin生化有限公司，中国）。其脱乙酰度（DD）≥95%，粘度为100–200?mPa·s，数均分子量（M?）约为(1–3)?×?105?g?mol?1。其纯度符合食品级标准，微生物计数、重金属及其他痕量物质均低于法规限值。标准COS（(GlcN)2、(GlcN)3、(GlcN)4、(GlcN)5和(GlcN)6购自Solarbio（北京Solarbio）
GH46家族壳聚糖酶是研究最广泛的壳聚糖降解酶家族之一。Bacillus subtilis MY002中的壳聚糖酶CsnMY002表现出相对较高的表观催化活性[16]。为了探索来自系统发育距离较远且研究较少来源的天然壳聚糖酶，我们采用了基于结构的搜索方法Foldseek[23]，该方法能够识别序列同源性较低但具有相似功能的远缘同源物
本研究阐明了古菌壳聚糖酶mtCsn46中带电C端延伸的结构功能。我们发现，尾部的带电区域PR在底物结合和提高COS聚合度方面起着关键作用。MD模拟表明，PR可能增强了酶与底物的相互作用并稳定了酶核心。基于这些发现，我们合理引入了Q19E突变以强化PR与酶核心之间的相互作用
Xiangyu Zi：撰写原始稿件、数据管理、概念构思。Jia Ye：撰写原始稿件、进行形式化分析、概念构思。Qing Xu：实验研究。Xiaolong Sun：数据管理。Yongqian Fu：撰写与编辑。Yao Chen：撰写与编辑、资金争取。
作者声明他们没有已知的利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。
本研究得到了浙江省自然科学基金（LQN26C200020）和台州市科技项目资助（25sfb37）的支持。
