Cas9聚集在体外DNA切割中的关键作用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Critical role of Cas9 aggregation on in vitro DNA cleavage

　　

迭戈·科拉（Diego Cora）|安娜·塞哈斯（Ana Seijas）|瓦吉赫·阿尔-苏菲（Wajih Al-Soufi）|劳拉·桑切斯（Laura Sánchez）|阿尔瓦罗·J·阿兰纳（álvaro J. Arana）|梅赛德斯·诺沃（Mercedes Novo）

摘要

CRISPR/Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具，在分子生物学和基因治疗中得到广泛应用，其效率在很大程度上取决于Cas9核糖核蛋白复合物的理化性质。优化Cas9的活性对于可靠的基因组编辑应用至关重要，但目前限制其体外切割效率的因素尚未完全明了。其中，蛋白质聚集被认为会严重影响Cas9的功能，尽管其具体作用尚未进行系统的分析。

在这项研究中，我们探讨了不同环境条件下Cas9的聚集情况，并评估了其对体外DNA切割效率的影响。通过使用荧光标记的Cas9和单分子荧光技术，我们量化了蛋白质聚集与缓冲液组成、离子强度、盐浓度以及sgRNA存在之间的关系，并将这些因素与切割活性联系起来。结果显示，Cas9的聚集会显著降低DNA切割效率，且聚集程度越高，切割效率越低。相反，离子强度较高或含有稳定成分的缓冲液可以减少蛋白质聚集，从而提升Cas9的性能。

总体而言，本研究表明Cas9的聚集在决定体外切割效率方面起着关键作用，并强调了控制蛋白质聚集以优化基于CRISPR/Cas9的基因组编辑应用和递送策略的重要性。

引言

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9）是一种源自细菌适应性免疫系统的著名基因组编辑工具[1],[2]。Cas9是一种多结构域酶，能够识别原间隔序列（PAM），解开DNA并实现靶向切割。这种切割会触发细胞修复机制，从而实现精确的基因编辑[3]。该系统利用单导向RNA（sgRNA）与Cas9内切酶形成核糖核蛋白（RNP）复合物，将其引导至目标DNA序列并进行双链断裂[4]。由于其高效性和可编程性，CRISPR/Cas9已经应用于基础生物学和临床治疗等多个领域。

尽管CRISPR/Cas9的应用范围广泛，但人们对Cas9蛋白本身的理化性质关注较少，尤其是其在不同环境条件下的聚集倾向[5]。蛋白质聚集会显著降低基因编辑效率，因为聚集会减少功能性单体Cas9的可用性，并由于颗粒尺寸增大而阻碍其被包装进递送载体或被细胞摄取[5]。尽管有零星报告描述了Cas9的聚集行为，但对此现象的系统理解仍然不足。例如，Manzano等人[6]描述了Cas9在等电点附近的剪切诱导聚集现象，而Nguyen等人[7]报告了加入sgRNA后颗粒尺寸显著增大，表明形成了聚集体。Jain等人[8]进一步证明，在蛋白质的等电点附近聚集倾向增强，并推测这可能影响sgRNA与Cas9的结合。

在我们实验室进行的初步研究中，我们观察到Cas9的聚集水平异常高。同时发现，在不同的RNP递送系统中，体内基因编辑效率也有所下降，这与Cas9根据配方介质的不同而产生的聚集状态变化有关[9]。这些观察结果暗示了Cas9聚集与基因编辑效率之间存在反比关系。基于这些发现，我们系统地研究了标准实验条件下Cas9的体外切割效率，并将其与蛋白质的聚集行为进行了关联。

基于这些认识，本研究旨在系统分析Cas9的体外DNA切割效率，并将其与不同实验条件下的蛋白质聚集状态联系起来。为此，我们采用了琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳技术来量化不同条件下的Cas9切割能力，并使用荧光标记的Cy5蛋白进行单分子荧光实验以获取聚集信息。我们团队之前已有应用荧光相关光谱（FCS）研究淀粉样蛋白聚集过程的经验[10],[11]。在此研究中，我们利用单分子检测（SMD）技术分离不同类型的蛋白质（单体和聚集体）并独立分析它们，从而提高了实验结果的准确性。同时，我们团队在基因编辑和体内CRISPR/Cas9应用方面也有丰富的经验[9]。

节选内容

材料

重组SpCas9蛋白由安达卢西亚发育生物学中心（CABD，位于西班牙塞维利亚，隶属于帕布罗·德奥拉维德大学和西班牙国家研究委员会）的蛋白质组学服务部门生产和纯化。本研究中使用了两种制备物：一种未标记的SpCas9（以下简称Cas9），另一种用Cy5标记的SpCas9（Cas9*）。这两种蛋白都以50%甘油/水的悬浮液形式提供，浓度分别为1.5 μg/μL（Cas9）和9 μg/μL（Cas9*）。

体外DNA切割效率

体外切割实验旨在分析不同参数对DNA编辑效率的影响。除了使用不同类型和组成的缓冲液外，还研究了sgRNA类型、DNA底物和反应时间的潜在影响。

通过琼脂糖凝胶电泳（1%）定性评估基因组编辑结果（见补充图S2）、完整DNA分子的大小以及较小片段的分布情况

实验参数对体外切割效率的影响

在讨论Cas9聚集的作用之前，首先需要简要分析体外切割效率实验中的主要趋势（见图1和图2）。在测试条件下，未发现DNA底物对切割效率有显著影响，因为无论是ppifb WT还是ppifb模板，切割效率均相似。此外，将反应时间从15分钟延长到60分钟仅导致切割效率略有提高，表明反应时间不是影响切割效率的决定性因素

结论

我们的研究显示了一种明显的负相关关系：Cas9的聚集程度越高，体外基因编辑效率越低，这与sgRNA类型、目标DNA或孵育时间无关。通过结合单分子荧光技术和定量切割实验，我们发现蛋白质聚集会显著降低Cas9的活性，且聚集程度越高，切割效率越低。

我们的结果表明，缓冲液组成、离子强度和蛋白质状态等因素对切割效率有显著影响

作者贡献声明

迭戈·科拉（Diego Cora）：负责撰写初稿、数据可视化、软件开发、方法设计、实验实施和数据分析。安娜·塞哈斯（Ana Seijas）：负责撰写初稿、实验实施、数据分析。瓦吉赫·阿尔-苏菲（Wajih Al-Soufi）：负责总体指导、资源协调、项目管理和方法设计。劳拉·桑切斯（Laura Sánchez）：负责总体指导、项目管理和概念构思。阿尔瓦罗·J·阿兰纳（álvaro J. Arana）：负责撰写初稿、实验实施、资源协调、项目管理和方法设计。

资助情况

本研究得到了两个项目的资助：一个是西班牙加利西亚自治区（Xunta de Galicia）的“利用新型脂质纳米颗粒优化CRISPR/Cas9基因编辑：物理化学与功能方法”项目（项目编号：2025-PU018），另一个是“通过CRISPR/Cas9基因编辑提高水产养殖抗病性”项目（项目编号：Optimización da edición xenética CRISPR/Cas9 para mejorar a resistencia a enfermidades en acuicultura）。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

A.S.感谢加利西亚自治区（Xunta de Galicia）和Tomás Notario Vacas农村基金会提供的预博士合同支持。D.C.感谢加利西亚自治区提供的“Campus de Especialización Campus Terra”预博士合同。